Summary
ويرد على بروتوكول لتحديد كمية البروتين في السوائل البيولوجية المعقدة باستخدام التكنولوجيا الآلية المناعية-استخدام (إيمالدي).
Abstract
الطيف الكتلي (مللي ثانية) واحدة من التكنولوجيات الأكثر استخداماً لتحديد كمية البروتينات في عينات معقدة، مع خصوصية المقايسة ممتازة نتيجة للكشف عن نسبة الكتلة إلى تهمة كل جزيء الهدف المباشر. بيد البروتيوميات المستندة إلى مرض التصلب العصبي المتعدد، مثل معظم غيرها من التقنيات التحليلية، وقد تحيز نحو قياس تحليلها وفرة عالية، ولذلك فإنه يمثل تحديا لتحقيق الكشف عن حدود منخفضة نانوغرام/مل أو بيكوغرام/مل في عينات معقدة، وهذا هو نطاق التركيز للعديد البروتينات ذات الصلة بالمرض في بيوفلويدس مثل البلازما البشرية. للمساعدة في الكشف عن تحليلها وفرة منخفضة، أدمجت المقايسة للتركيز وتنقية أكثر قبل قياس مرض التصلب العصبي المتعدد، وإلى حد كبير تحسين حساسية المقايسة المناعية لتخصيب. في هذا العمل، هو التكنولوجيا ماتريكساسيستيد الليزر الامتزاز/التأين (إيمالدي) المناعية-قدمت للتحديد الكمي للبروتينات والببتيدات في بيوفلويدس، استناداً إلى التخصيب المناعية على الخرز، متبوعاً بقياس استخدام MS دون شطف مسبق. الأجسام المضادة الببتيد فونكتيوناليزيد على حبات مغناطيسية، والمحتضنة مع العينات. بعد الغسيل، الخرز يتم نقلها مباشرة على استخدام لوحة هدف، ويتم قياس الإشارات باستخدام وقت الرحلة (استخدام-TOF) الصك بعد تطبيق الحل مصفوفة الخرز. يتم تبسيط إجراءات إعداد عينة مقارنة بغيرها فحوصات المناعية-مرض التصلب العصبي المتعدد، وقياس استخدام سريع. إعداد نموذج كامل الآلي مع سائل التعامل مع النظام، مع إمكانية تكرار نتائج الفحص المحسنة وإنتاجية أعلى. في هذه المقالة، يستخدم الإنزيم إيمالدي لتحديد انجيوتنسين الببتيد أنا (إنج أنا) تركيز في البلازما، الذي يستخدم سريرياً كقراءات نشاط إنزيم الرينين في البلازما لفحص الدوستيرونيسم الأولية (السلطة الفلسطينية).
Introduction
الكتلي أصبحت أداة لا غنى عنها في البروتيوميات الكمية. الكتلي يمكن تحديد الجماهير المستهدفة البروتينات أو الببتيدات، ولذلك إشارات أكثر التي تم الحصول عليها يمكن أن تكون محددة للغاية مقارنة بتحديدكم. طريقتين التأين، اليكتروسبراي، واستخدام، هي الأكثر شيوعاً للكشف عن البروتينات والببتيدات1،2،،من34. تحديا كبيرا في تحديد مقدار البروتين المستندة إلى MS يكمن في الكشف عن البروتينات المنخفضة-وفرة في العينات المعقدة في تركيزات نانوغرام/مليلتر أو pg/mL حضور وفرة عالية البروتينات، والعديد من المؤشرات الحيوية البروتين المرشح وجدت في البلازما البشرية ضمن هذا النطاق5. هو سبب هذه المشكلة إلى حد كبير بدينامية طبيعتها واسعة النطاق والتعقيد من البروتين البشري6.
للتغلب على هذه التحديات الكشف، تطورت الأساليب المناعية-مرض التصلب العصبي المتعدد لإثراء البروتينات المستهدفة أو الببتيدات من الحلول العينة على سطح صلب، تليها شطف تحليلها ومرض التصلب العصبي المتعدد قياس7،8 , 9 , 10-من خلال تخصيب المناعية، يتم تنقيته تحليلها من العينات المعقدة وذلك يتم الحد من آثار أيون-قمع من الجزيئات الأخرى. بين مختلف يدعم الصلبة، الخرز المغناطيسي حاليا أكثر تستخدم على نطاق واسع كما لها مزايا القدرة الملزمة جسم العالية وسهولة التعامل. أعدت حبات مغناطيسية مع فونكتيوناليزيشنز مختلفة وأحجام وتسويقها للتجارب إيمونوبريسيبيتيشن. وحتى الآن، تم ربطه المناعية-الإثراء على الخرز مع اليكتروسبراي التأين (ESI) واستخدام MS لقياس البروتين والببتيد. في معايير النظائر المستقرة واستيلاء التكنولوجيا الببتيد المضادة الأجسام المضادة (سيسكابا)، يتم هضمها البروتينات في العينات، تليها الحضانة مع الخرز المغلفة بالأجسام المضادة المناعية-الإثراء. في سيسكابا "الكلاسيكية"، الببتيدات بروتيوتيبيك القبض على الوتيد من الخرز، ويقاس بالسائل اللوني-ESI-مرض التصلب العصبي المتعدد (LC-MS)، أو عن طريق التسريب المباشر11،ESI-متعددة "رد فعل" الرصد--مرض التصلب العصبي المتعدد (أي إس أي-الآلية-MS)12. تحسين المناعية لتخصيب حساسية المقايسة الآلية 3-4 للحجم، الوصول إلى النطاق المنخفض نانوغرام/مل13.
بالمقارنة مع اليكتروسبراي--مرض التصلب العصبي المتعدد، استخدام--مرض التصلب العصبي المتعدد هو أسرع، ولا تنطوي على التنظيف وإعادة الموازنة LC الأعمدة حتى تكون هناك أي قضايا التلوث وترحيل، يجعلها أكثر ملاءمة للدراسات الفائق14. وقد وضعت المناعية-استخدام التكنولوجيا في المختبر للجمع بين المناعية لتخصيب باستخدام MS للقياس الكمي حساسة ومحددة من الببتيدات والبروتينات (استناداً إلى كوانتيتيشن الببتيدات بروتيوتيبيك)15،16 ،17. بعد تخصيب المناعية، تودع الخرز على لوحة هدف استخدام مصفوفة الحل هو إضافة إلى الخرز واللوحة جاهز للتحليل باستخدام-TOF-MS بعد التجفيف. لا يتم شطف الببتيدات من الخرز كخطوة منفصلة، ولكن يتم التيد تحليلها زمنياً تقارب باستخدام مصفوفة الحل عند إضافته إلى بقع حبة، وبالتالي تبسيط إعداد العينة والتقليل إلى أدنى حد من الخسائر في عينة. التكنولوجيا إيمالدي قد طبقت في مجموعة متنوعة من التطبيقات18،19، ومؤخرا تم الآلي واستخدامه لقياس انجيوتنسين أنا (إنج أنا) لتحديد البلازما إنزيم الرينين النشاط (PRA)20. سوف يثبت هذا البروتوكول الإجراء المستخدم للقيام تحليل الآلي إيمالدي. أخذ مقايسة جيش الخلاص الشعبي على سبيل مثال، السير الذاتية اليوم بين أقل من 10% قد تحققت من خلال التشغيل الآلي للمكاتب، مع القدرة على قياس العينات 744 كل يوم20.
والرزن جيش الخلاص الشعبي إيمالدي أظهر في هذه المخطوطة لا يتطلب هضم البروتين، الجزيء المستهدف (إنج أنا) ببتيد مع وزن الجزيئي دا 1295.7. في فحوصات أخرى حيث هضم البروتين ضروري وببتيد كالمركب للبروتين سليمة، ينبغي أن يكون الببتيد مختارة إيمالدي الفريدة والمحددة للبروتين المستهدفة، مع كتلة عبر 800 دا حتى أنه يمكن تمييزها بسهولة من c الكيماوية من الضوضاء من استخدام مصفوفة الحل. الببتيد المضادة الأجسام المضادة مطلوبة من أجل المناعية-إثراء الببتيدات. البروتوكول المتعلق بفحص إيمالدي قياس جيش الخلاص الشعبي يتكون من أربع خطوات: 1) جيل إنج في البلازما البشرية؛ 2) المناعية-الإثراء إنج الأول باستخدام الخرز المغلفة بالأجسام المضادة؛ 3) نقل الخرز إلى استخدام لوحة الهدف وإضافة مصفوفة الحل؛ و 4) إشارة شراء بتحليل البيانات واستخدام-TOF-MS20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كميات الكواشف الموصوفة أدناه تستند إلى قياس عينات البلازما المريض 20. البروتوكول الواردة أدناه فيما يلي المبادئ التوجيهية لجامعة فيكتوريا ' لجنة أخلاقيات البحوث البشرية s-
1. "جيل إنج" في "البلازما البشرية"
- إذابة الجليد في عينات البلازما (≥ 200 ميليلتر) درجة حرارة المياه في غرفة حمام لمدة 5 دقائق، وثم وضع العينات في الثلج حتى مذاب تماما.
- نقل 200 ميليلتر من كل عينة البلازما يدوياً لفصل آبار صفيحة الآبار العميقة 1.1 مل (نموذج لوحة)، والطرد المركزي اللوحة في أجهزة الطرد مركزي لمدة 10 دقيقة في 2 درجة مئوية وغ. س 1278
- استخدام سائل الآلي التعامل مع نظام متسلسل تمييع نات إنج I فمول/ميليلتر 500 حل قياسية لإعداد حلول معايرة الستة مع دجاج البيض الأبيض الزلال (0.1، 0.2، 0.6، 1.9، 5.7، 17.2 فمول/ميليلتر). المخزن المؤقت
- ماصة 200 ميليلتر من كل معايرة ميليلتر جيدا، و 125 من جيل إلى لوحة عينة-
ملاحظة: سيفا في الفوسفات العازلة مخزنة المالحة (PBS) يحتاج إلى أن يكون طازج اليوم من التجربة- - باستخدام سائل الآلي التعامل مع النظام، في لوحة جديدة ميليلتر 125 من البلازما طافية أو مزيج ميليلتر 125 من سيفا في برنامج تلفزيوني مع 25 ميليلتر من إنج أنا جيل المخزن المؤقت، والذي يحتوي على 1 م تريس 0.2 مم الإيثيلين (يدتا)، وحامض 1 مم فلوريد فينيلميثيلسولفونيل (بمسف)-
ملاحظة: تعد إنج أنا جيل المخزن المؤقت عن طريق خلط 1 م تريس/0.2 مم يدتا مائي المخزن مؤقت (ضبط للأس الهيدروجيني 5.5 استخدام حمض الخليك) وحل بمسف (100 ملم في الميثانول). يمكن تخزين كل الحلول إلى شهر واحد في 4 ° C. مزيج الاثنين الحلول في يوم التجربة- - تلقائياً نقل الحلول في لوحة 96، حسنا، replicates 3 كل حل، ميليلتر 34 كل بئر. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية حاء 3
2. المناعية-إثراء إنج أنا الخرز المغلفة "استخدام الأجسام المضادة"
- تصريف الأجسام المضادة على المغناطيسي "ز البروتين" الخرز
ملاحظة: يتم إجراء اقتران للجسم مع الخرز يدوياً أثناء ح 3 إنج أنا فترة جيل على اليوم من هذه التجربة. للتحاليل الأخرى، قد يكون الخرز مترافق قادرة على تخزينها في مخزن برنامج تلفزيوني يحتوي على الفصول 0.015% (ببسك) عند 4 درجة مئوية لمدة ثلاثة أشهر أو أكثر، تبعاً للخصائص واستقرار الجسم.- ميليلتر نقل 110 من الملاط حبة (ما يكفي لقياس العينات 20 وجعل منحنى قياسي 6-نقطة) في أنبوب 1.5 مل. أغسل حبات سبع مرات مع 1 مل من 25% الاسيتو الانيتريل/ببسك، وثلاث مرات مع 1 مل من ببسك. استخدم موقفا مغناطيسي لبيليه الخرز بين كل خطوة الغسيل. إزالة المخزن المؤقت الغسيل بعد واشنطن الأخيرة
ملاحظة: الغسيل 7 مرات مع 25% الاسيتو الانيتريل/ببسك أمر بالغ الأهمية لإزالة إضافات MS-متوافق في الطين حبة، مثل توين 20. إذا كان هناك أي إضافات من هذا القبيل في الخرز مختارة، هذه الخطوة الغسيل واسعة النطاق قد لا تكون ضرورية. - ريسوسبيند الخرز في 110 ميليلتر من ببسك، وإضافة 110 ميليلتر لمكافحة-إنج أنا جسم (تركيز الضد النهائي: 100 ميكروغرام/مل). مزيج الخرز والحل قبل بيبيتينج ومن ثم احتضان لهم في درجة حرارة الغرفة ح 1، تناوب 8 لفة في الدقيقة- تغسل حبات 3 مرات مع 1 مل ببسك
- ومن ريسوسبيند في ميليلتر 1100 من ببسك-
ملاحظة: إذا كان أي حل حبة تدفقت إلى الحد أقصى الأنبوب أثناء الحضانة، تدور أسفل الحل باستخدام أجهزة الطرد مركزي benchtop في 2680 س زاي - نقل الحل حبة يدوياً إلى لوحة 96-جيدا (حبة اللوحة القياسية). استخدام السائل الآلي التعامل مع النظام إلى قاسمة الخرز نفس لوحة 96، حسنا، ميليلتر 120 كل بئر.
- ميليلتر نقل 110 من الملاط حبة (ما يكفي لقياس العينات 20 وجعل منحنى قياسي 6-نقطة) في أنبوب 1.5 مل. أغسل حبات سبع مرات مع 1 مل من 25% الاسيتو الانيتريل/ببسك، وثلاث مرات مع 1 مل من ببسك. استخدم موقفا مغناطيسي لبيليه الخرز بين كل خطوة الغسيل. إزالة المخزن المؤقت الغسيل بعد واشنطن الأخيرة
- المناعية-الإثراء على الخرز
- بعد ح 3 إنج الفترة جيل، أضع لوحة الحضانة على الجليد لمدة 10 دقيقة إنهاء توليد أولاً إنج
- تلقائياً تمييع الحل الأسهم الببتيد SIS (10 pmol/ميكروليتر) معززات مع برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت، وكذلك تلقائياً قاسمة تمييع الببتيد القياسية إيسوبتوبي مستقرة لصفيحة بكر 96-جيدا. نقل 1.5 ميليلتر من حل الببتيد المعايير (SIS) النظائر المستقرة (تحتوي على 100 فمول) في كل من لوحة حضانة جيدا ومزجها مع عينات البلازما أو سيفا في المخازن المؤقتة لبرنامج تلفزيوني.
- تلقائياً نقل محتويات لوحة الحضانة إلى الحل حبة، 10 مل في البئر، ومزيج.
- احتضان لوحة عند 4 درجة مئوية عن ح 1 بينما تناوب 8 لفة في الدقيقة-
- يغسل الخرز ثلاث مرات تلقائياً بحل بيكربونات الأمونيوم (أمبيك) 5 مم، 100 ميليلتر كل بئر للمياه والصرف الصحي. بعد الغسيل الأخير، ريسوسبيند الخرز في ميليلتر 7 5 مم أمبيك الحل في كل بئر. استخدم مغناطيس لسحب الخرز للأسفل بعد واشنطن الأخيرة
3. نقل الخرز على استخدام لوحة الهدف وإضافة مصفوفة الحل
- ميليلتر نقل 7 من الملاط حبة تلقائياً إلى لوحة هدف استخدام مع حجم بقعة من 2,600 ميكرومتر. اسمحوا الخرز تجف.
ملاحظة: يمكن استخدام مروحة USB بالطاقة صغيرة للتعجيل بحبه عملية التجفيف. - تلقائياً بإضافة 2 ميليلتر من حمض α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك (ةككا)-مصفوفة الحل (تحتوي على 3 ملغ/مل ةككا وسترات أمونيوم 1.8 ملغ/مل، الاسيتو الانيتريل 70% وحامض trifluoroacetic 0.1 ٪) من المصفوفة جيدا على كل عينة بقعة على لوحة الهدف .
4. إشارة شراء باستخدام-TOF-مرض التصلب العصبي المتعدد وتحليل البيانات
البقع- تحليل العينة مع صك TOF استخدام استخدام وضع عاكس إيجابية. إجراء المعايرة الداخلية وتجانس البيانات، والطرح الأساس تلقائياً مع بائعي البرامج-
ملاحظة: الوضع (إيجابية/سلبية، خطي/العاكس) المحدد لقياس استخدام TOF يعتمد على الببتيدات المستهدفة أو البروتينات. - حساب نسبة الاستجابة النسبية (نسبة كثافة Nat/الأخت) وذلك لمقارنة المنحنى القياسي لتحديد إنج أنا التركيز في كل عينة. حساب جيش الخلاص الشعبي باستخدام المعادلة (1)، حيث Δt إنج أنا جيل يمثل الوقت المستخدم لتوليد أولاً إنج
جيش الخلاص الشعبي = [إنغ أنا]/Δt إنج أنا جيل (1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إجراء إيمالدي الآلي لقياس إنج هو المبين في الشكل 1. هي تثري الببتيدات المستهدفة (الببتيدات الذاتية أو الببتيدات من هضم البروتينات) في الببتيد المضادة المغناطيسي الخرز، وثم الخرز يتم نقلها إلى لوحة المستهدف لقياس استخدام. يتم تبسيط الإجراء بأكمله مقارنة بغيرها من التكنولوجيات MS المناعية التي تتطلب خطوات شطف إضافي الببتيد. التشغيل الآلي للانزيم إيمالدي يسمح بتحليل الفائق لعدد كبير من العينات مع يوم بين معامل الاختلاف (CV) أقل من 10% 20. الممثل الأطياف التي تم الحصول عليها عن طريق قياس إنج في عينات البلازما البشرية مبينة في الشكل 2. الأخت الببتيدات الدالة كمعيار داخلية كوانتيتيشن الببتيد. ويرد في الشكل 3العلاقة بين قيم جيش الخلاص الشعبي من 188 عينات المرضى الحصول عليها مع الإنزيم إيمالدي الآلي بجيش الخلاص الشعبي القيم التي تم الحصول عليها باستخدام إجراء LC-MS/MS سريرية17 . هاتين الطريقتين يكون معامل الارتباط 0.98؛ قد يكون سبب الفرق بين المنحدرات باستخدام المعايير الداخلية المختلفة بالطريقتين، أو باستخدام الأجسام المضادة المختلفة في إيمالدي الداخلي20. مجموعة الخطي في التحليل ودقة التحليل تظهر في الشكل 4 و الشكل 5.
رقم 1: التخطيطي تدفق العملية للمقايسة جيش الخلاص الشعبي إيمالدي الآلي- مقتبس من مرجع20، مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: أطياف الممثل نات وانج SIS أنا الببتيدات يقاس من عينة بلازما بشرية.
الشكل 3: قياس القيم "الارتباط لجيش الخلاص الشعبي" إيمالدي و LC-MS/MS من عينات المرضى 188. مقتبس من مرجع20، مع الإذن.
4 الرقم: نطاقات الخطي للمقايسة جيش الخلاص الشعبي إيمالدي في عاكس (A) و (ب) وضع الخطي. مقتبس من مرجع20، مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
5 الرقم: الدقة اللحظية (A) ودقة (ب) إينتيرداي إيمالدي جيش الخلاص الشعبي معبراً عن تجمعات بلازما مع قيم PRA منخفضة ومتوسطة وعالية. مقتبس من مرجع20، مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مقارنة لتحديد مقدار البروتين التقليدية المستندة إلى مرض التصلب العصبي المتعدد، يستخدم إيمالدي الأجسام المضادة لإثراء تحليلها وتنقية لها من العينات المعقدة، ولذلك يجعل من الممكن تحديد كمية البروتينات أو الببتيدات تركيزات منخفضة. هو خطوة حاسمة في البروتوكول إيمالدي المناعية-إثراء الببتيدات المستهدفة. ولهذا الغرض، يجب تحديد الأجسام المضادة مع خصوصية عالية وتقارب. في سيسكابا، وأفيد أنه سيلزم الانتماءات جسم في 10-9 م أو أفضل لتحقيق حساسية عالية في انخفاض نانوغرام/مل21. وباﻹضافة إلى ذلك، الخرز مع الأجسام المضادة عالية القدرة الملزمة المفضلة للتخصيب الأمثل.
من المهم أيضا أن تولد أطياف "نظيفة" نسبيا للجزيئات المستهدفة مع المستويات الأساسية الدنيا. يمكن أن يتحقق النسب إشارة إلى الضوضاء عالية واسعة حبة الغسيل بعد الخطوة المناعية لتخصيب. أيضا، وجدنا أن غسل البقع حبة على لوحة الهدف بعد إضافة وتجفيف الحل مصفوفة يمكن أن تقلل إلى حد كبير على الإشارات الضوضاء وبالتالي تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
والرزن جيش الخلاص الشعبي إيمالدي أظهرت في هذا العمل لا يتطلب خطوات بروتيوليسيس، الجزيء المستهدف إنغ ببتيد. لتحديد حجم جزيئات البروتين في عينة، البروتين يهضم عادة إلى الببتيدات قبل تخصيب المناعية، على الرغم من أن الببتيدات المحتوية على بيفرتون، يمكن إجراء الهضم على22،البروتين القبض على23. وفي هذه الحالة، يمكن بسهولة إدراجها بروتوكولا هضم بروتين موجودة في سير العمل إيمالدي. اعتماداً على المخزن المؤقت الهضم، قد يلزم خطوة desalting قبل القبض على الببتيدات على الخرز، لتجنب التداخل مع الربط أضداد الببتيد.
مماثلة لغيرها من الأساليب المناعية-مرض التصلب العصبي المتعدد، إنتاج الأجسام المضادة الببتيد تحديا رئيسيا في تطوير فحوصات إيمالدي. في الآونة الأخيرة، وضعت "الثلاثي العاشر البروتيوميات" التكنولوجيا لإنتاج موثقات التقارب التي يمكن استهداف متعددة الببتيدات الواحدة الموثق24. وهذا قد يقلل من تكلفة الببتيد المضادة الأجسام المضادة، وسيسهل تطوير فحوصات متعدد المتزامن حضانة واحدة باستخدام. أيضا، وشظايا جسم25 أو الابتامرات الاصطناعية26 يمكن أن تكون بدائل لاستخدام أجسام سليمة وأن تتميز بإنتاج أسهل. وأبلغ الابتامرات الاصطناعية كعرض مستويات الخلفية أدنى من أجسام سليمة عندما تستخدم لتخصيب تقارب26.
إيمالدي التكنولوجيا يجمع بين مزايا تحديدكم مع استخدام الطيف الكتلي، تمكين التحليل السريع، والإنتاجية العالية البروتين/الببتيد في عدد كبير من العينات المعقدة، مع حساسية عالية وخصوصية. على عكس الأساليب الأخرى المناعية-مرض التصلب العصبي المتعدد، بعد التقاط المناعية، الهدف الذي لم يتم الوتيد الببتيدات في الأنبوب، ولكن الخرز تحليلها تحمل يتم نقلها على لوحة الهدف استخدام لمرض التصلب العصبي المتعدد-تحليل، وبالتالي تجنب فقدان الببتيدات سبب الامتزاز البلاستيك أنابيب. بالمقارنة مع الأدوات المستخدمة على نطاق واسع من البروتين مثل لطخة غربية أو أليسا، مطلوب جسم واحد فقط في إيمالدي، يقلل بمقايسة التنمية الوقت والتكلفة. الحد الأدنى للكشف التي حصلنا عليها في مقايسة PRA قابل للمقارنة إلى أليسا التقليدية، وضمن نطاق الفسيولوجية. الجسم ونسبة الكتلة بتهمة توفير عملية انتقاء مزدوجة، مما يضمن خصوصية عالية التحليل. تطبيقات إيمالدي لا يقتصر على فحوصات جيش الخلاص الشعبي، ولكن يمكن تطبيقها على كوانتيتيشن من أي تعبير البروتين والكمي حتى بتعديل البروتين في عينات معقدة. جدير بالذكر أن إيمالدي الفائق الآلي يمكن أن تكون أداة سريرية قوية لاكتشاف والتحقق من صحة المؤشرات الحيوية البروتين في مجموعة متنوعة من الأمراض، بسبب وجود benchtop استخدام الأدوات المستخدمة حاليا في العيادات للبكتيريا تحديد الهوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C.H.B تحمل براءات الاختراع في تكنولوجيا إيمالدي.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدعم المالي من الجينوم كندا وكولومبيا البريطانية الجينوم للعمليات (204PRO)، وتطوير التكنولوجيا (214PRO) من خلال شبكة الابتكارات الجينوم (الجن). ونشكر "برنامج اكتشاف المخدرات" في معهد البحوث التابع لجامعة ماكجيل المركز الصحي لاستخدام أداة TOF استخدام لتصوير. H.L. تشعر بالامتنان للدعم من زمالة ما بعد الدكتوراه من "الوطنية للعلوم" والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة). C.H.B تشعر بالامتنان للدعم من صندوق الهبات الرائدة (الليف). C.H.B. تشعر بالامتنان للدعم من الرئاسة ماكغيل سيغال في "علم الأورام الجزيئي" في جامعة ماك غيل (مونتريال، كيبيك، كندا). M.X.C. و C.H.B. ممتنة للدعم من مؤسسة الأسرة سيغال ألفين وارن Y. سوبر الخيرية الصندوق الاستئماني إلى "المستشفى العام اليهودي" (مونتريال، كيبيك، كندا).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
References
- Aebersold, R., Mann, M.
- Nicol, G. R., et al. Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients. Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).
- Webster, J., Oxley, D. Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. Zanders, E. D. , Humana Press. 227-240 (2012).
- Yergey, A. L., et al. De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).
- Anderson, L. Six decades searching for meaning in the proteome. J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).
- Landegren, U., et al. Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis. Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation. Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate. Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).
- Fredolini, C., et al.
- Tran, J. C., et al. Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies. Anal. Chem. , (2016).
- Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow. N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).
- Razavi, M., et al. High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).
- Anderson, N. L., et al. SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device. Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).
- Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective. The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).
- Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).
- Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II. Methods. 56 (2), 213-222 (2012).
- Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension. Clin. Proteomics. 10 (1), 20 (2013).
- Jiang, J., et al. Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis. Proteomics Clin Appl. 1, (2007).
- Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis. Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).
- Popp, R. An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).
- Schoenherr, R. M., et al. Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry. J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , US 7846748 B2 (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , CA 2507864 C (2011).
- Weiß, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).
- Nelson, A. L. Antibody fragments: Hope and hype. mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).
- Gupta, V., et al. An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein. Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).
