Summary
Ett protokoll för protein kvantifiering i komplexa biologiska vätskor med hjälp av automatiserade immuno-MALDI (iMALDI) teknik presenteras.
Abstract
Masspektrometri (MS) är en av de vanligaste teknikerna för att kvantifiera proteiner i komplexa prover, med utmärkta analysens specificitet till följd av direkt påvisande av massa-till-avgift förhållandet mellan varje målmolekylen. Men MS-baserad proteomik, som de flesta andra analystekniker, har en inriktning mot mäta hög-överflöd analyter, så det svårt för att uppnå upptäckt begränsar låga ng/ml eller pg/mL i komplexa prover, och detta är koncentrationsintervall för många sjukdom-relevanta proteiner i kroppsvätskor såsom humanplasma. För att hjälpa detektion av låg-överflöd analyter, har immuno-anrikning integrerats i analysen att koncentrera sig och rena analyten före MS mätning, avsevärt förbättra analysens känslighet. I detta arbete, är immuno - laser Laser Desorption/jonisering (iMALDI) tekniken presenteras för kvantifiering av proteiner och peptider i kroppsvätskor, baserat på immuno-anrikning på pärlor, följt av MALDI-MS mätning utan föregående eluering. Anti peptid antikropparna är functionalized på magnetiska pärlor, och inkuberas med prover. Efter tvätt, pärlorna överförs direkt till en MALDI målplatta och signaler mäts av en MALDI-tid på flyg (MALDI-TOF) instrumentet efter modellösning har tillämpats på pärlorna. Prov förberedelse förfarandet förenklas jämfört med andra immuno-MS analyser och MALDI mätningen är snabb. Hela provberedningen är automatiserad med en vätskehanterande system, med förbättrad analysreproducerbarhet och högre genomströmning. I den här artikeln iMALDI analysen används för att bestämma den peptid angiotensin jag (Ang jag) koncentration i plasma, som används kliniskt som avläsningen av reninaktivitet i plasma för screening av primär aldosteronism (PA).
Introduction
Masspektrometri har blivit ett oumbärligt verktyg i kvantitativ proteomik. Masspektrometri kan bestämma massan av målet proteiner eller peptider, därför de erhållna analyt signalerna kan vara mycket specifik jämfört immunanalyser. Två jonisering metoder, elektrospray och MALDI, används oftast för att detektera proteiner och peptider1,2,3,4. En stor utmaning i MS-baserad protein kvantifiering ligger i detektion av låg-överflöd proteiner i komplexa prover vid ng/mL eller pg/mL koncentrationer i närvaro av hög-överflöd proteiner, och många kandidat protein biomarkörer hittade i human plasma är inom detta spänner5. Detta problem orsakas till stor del av sin natur brett dynamiskt omfång och komplexitet av mänskliga proteomet6.
För att övervinna utmaningarna upptäckt, immuno-MS metoder har utvecklats för att berika den målet proteiner eller peptider från provet lösningarna på en fast yta, följt av eluering av analyter och MS mätning7,8 , 9 , 10. genom immuno-anrikning, analyterna renas från komplexa prover och därför ion-suppression effekterna från andra molekyler minimeras. Bland olika fasta stöd används magnetiska pärlor för närvarande mest eftersom de har fördelarna med hög antikropp bindande kapacitet och enkel hantering. Magnetiska pärlor med olika functionalizations och storlekar har utvecklats och kommersialiseras för immunoprecipitation experiment. Hittills har immuno-anrikning på pärlor har varit kopplats ihop med både elektrospray jonisering (ESI) och MALDI-MS för protein och peptid mätning. I stabil isotop standarder och fånga av anti peptid antikroppar (SISCAPA) teknik rötas proteiner i proven, följt av inkubation med antikroppsbelagda pärlor för immuno-anrikning. I ”klassisk” SISCAPA, är de tagna proteotypic peptiderna elueras från pärlor och mäts av Liquid Chromatography-ESI-MS (LC-MS), eller genom direkt infusion ESI-flera reaktion övervakning-MS (ESI-MRM-MS)11,12. Immuno-anrikning förbättrades MRM analysens känslighet med 3-4 storleksordningar, att nå den låga ng/mL range13.
Jämfört med elektrospray-MS, MALDI-MS är snabbare och omfattar inte rengöring och förnyad Jämviktstiden LC kolumner så finns ingen överföring och kontaminering frågor, vilket gör den mer lämplig för hög genomströmning studier14. Immuno-MALDI teknik har utvecklats i vårt laboratorium att kombinera immuno-anrikning med VITEK-MS för känsligt och specifikt kvantifiering av peptider och proteiner (baserat på kvantitering av proteotypic peptider)15,16 ,17. Efter immuno-anrikning, pärlorna är deponeras på en MALDI målplatta, modellösning läggs till pärlor och plattan är redo för analys av en MALDI-TOF-MS efter torkning. Eluering av peptiderna från pärlorna utförs inte som ett separat steg, men affinitet-bundna analyter elueras av MALDI modellösning när det läggs till pärla fläckar, därigenom förenkla provpreparering och minimera prov förlust. Den iMALDI tekniken har använts i en mängd tillämpningar18,19, och nyligen har automatiserat och används för att mäta Angiotensin jag (Ang jag) för att fastställa plasma renin aktivitet (PRA)20. Detta protokoll kommer att demonstrera det förfarande som används för att utföra en automatiserad iMALDI analys. Tar PRA analysen som ett exempel, mellan dag CVs på mindre än 10% har uppnåtts genom automatisering, med möjlighet att mäta 744 prover per dag20.
IMALDI PRA analysen visat i detta manuskript kräver inte protein matsmältningen, som målmolekylen (Ang jag) är en peptid med en molekylvikt av 1295.7 Da. I andra analyser där protein matsmältningen är nödvändigt och en peptid används som surrogat för intakt protein, bör den valda peptiden för iMALDI unika och specifika för målproteinet, med en massa över 800 Da så att det kan lätt skiljas från c hemical buller från MALDI modellösning. Anti peptid antikroppar krävs för immuno-anrikningen av peptiderna. Protokollet för ett iMALDI test mäta PRA består av fyra steg: 1) generation av Ang jag i human plasma. (2) immuno-anrikning av Ang jag använder antikroppsbelagda pärlor; (3) överföring av pärlor till en MALDI målplatta och lägga modellösning; och 4) signal förvärv genom en MALDI-TOF-MS och data analys20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
belopp av de reagens som beskrivs nedan bygger på mätning av 20 patient plasmaprover. Protokollet presenteras nedan följer riktlinjerna från University of Victoria ' s mänskliga forskningsetisk kommitté.
1. generation av Ang jag i Human Plasma
- Tina plasmaprover (≥ 200 µL) i ett rum temperatur vatten bad i 5 min, och sedan lägga proverna på is tills helt tinat.
- Överföra 200 µL av varje plasmaprov manuellt till separata brunnar 1,1 mL deep-well platta (prov plansch) och centrifugera plattan i en centrifug för 10 min vid 2 ° C och 1278 x g.
- Använda en automatiserad vätskehantering system till seriellt späd 500 fmol/µL Ang I NAT standardlösning för att förbereda sex kalibrator lösningar med kyckling ägg vita albumin (0,1, 0,2, 0,6, 1,9 5,7, 17,2 fmol/µL).
- Pipett 200 µL av varje kalibrator till en väl och 125 µL av generation buffert till provet plattan.
Obs: CEWA fosfat buffrad saltlösning (PBS) bufferten måste vara nyberedd dagen i experimentet. - Använda en automatiserad vätskehantering system, i en ny tallrik blanda 125 µL plasma supernatant eller 125 µL av CEWA i PBS med 25 µL av Ang jag generation bufferten, vilket innehåller 1 M Tris, 0,2 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) och 1 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF).
Obs: Förbereda Ang jag generation buffert genom att blanda en 1 M Tris/0,2 mM EDTA aqueous buffert (justera till pH 5,5 med ättiksyra) och en PMSF lösning (100 mM i metanol). Båda lösningarna kan förvaras upp till 1 månad vid 4 ° C. blanda två lösningar på dagen för experimentet. - Överför automatiskt lösningarna till en plattan med 96 brunnar, 3 replikat per lösning, 34 µL per brunn. Inkubera plattan vid 37 ° C i 3 h.
2. Immuno-anrikning av Ang jag använder antikroppsbelagda pärlor
- Konjugation av antikropp på magnetiska Protein G pärlor
Obs: Konjugation av antikropp med pärlor utförs manuellt under 3 h Ang jag generation period på den dag av experimentet. För andra analyter skulle konjugerade pärlorna kunna lagras i PBS-bufferten innehåller 0,015% käkar (PBSC) vid 4 ° C i tre månader eller längre, beroende på vilka egenskaper och stabilitet av antikropp.- Överföra 110 µL av pärla flytgödsel (nog för att mäta 20 prov och att göra en 6-punkts standardkurva) i ett 1,5 mL rör. Tvätta pärlorna sju gånger med 1 mL 25% acetonitril/PBSC och tre gånger med 1 mL av PBSC. Använd en magnetisk stå till pellet pärlor mellan varje tvätt steg. Ta bort tvättbufferten efter den sista wash.
Obs: Tvätta 7 gånger med 25% är acetonitril/PBSC kritisk för att avlägsna de MS-inkompatibla tillsatserna i pärla slam, såsom Tween-20. Om det finns inga sådana tillsatser i de valda pärlorna, detta omfattande tvätt steg kanske inte nödvändigt. - Återsuspendera pärlorna i 110 µL av PBSC och tillsätt 110 µL anti-Ang jag antikropp (slutliga antikroppskoncentrationen: 100 µg/mL). Blanda pärlor och lösning av pipettering, och sedan odla dem i rumstemperatur för 1 h, roterande vid 8 rpm.
- Tvätta pärlor 3 gånger med 1 mL av PBSC och återsuspendera i 1100 µL av PBSC.
Obs: Om någon pärla lösning har flödade in i locket på röret under inkuberingen, snurra ner lösningen med en bänkmonterade centrifug på 2680 x g. - Överför pärla lösningen manuellt till en plattan med 96 brunnar (pärla Kantbockade). Använda den automatiska vätskehanterande system till alikvot pärlor för att den samma plattan med 96 brunnar, 120 µL per brunn.
- Överföra 110 µL av pärla flytgödsel (nog för att mäta 20 prov och att göra en 6-punkts standardkurva) i ett 1,5 mL rör. Tvätta pärlorna sju gånger med 1 mL 25% acetonitril/PBSC och tre gånger med 1 mL av PBSC. Använd en magnetisk stå till pellet pärlor mellan varje tvätt steg. Ta bort tvättbufferten efter den sista wash.
- Immuno-anrikning på pärlor
- efter 3 h Ang jag generation period, placera inkubation plattan på is för 10 min att avsluta generationen av Ang I.
- Automatiskt späd stamlösningen SIS peptid (10 pmol/μL) 100-fold med PBS buffert och ytterligare automatiskt alikvot stabil isoptope standard peptid utspädning till en PCR-plattan med 96 brunnar. Över 1,5 µL av en stabil isotop normer (SIS) peptid lösning (innehållande 100 fmol) i varje brunn av inkubering plattan och blanda det med plasmaprover eller CEWA i PBS buffertar.
- Automatiskt överföra innehållet i inkubation plattan till bead lösningen, 10 mL per brunn, blanda.
- Inkubera plattan vid 4 ° C för 1 h samtidigt vrida på 8 rpm.
- Tvätta pärlorna tre gånger automatiskt med 5 mM lösning av ammoniumbikarbonat (AmBic), 100 µL per brunn per tvätt. Efter den sista tvättningen, Återsuspendera pärlorna i 7 µL av 5 mM AmBic lösning i varje brunn. Använd en magnet för att dra pärlorna till botten efter den senaste wash.
3. Överföring av pärlor på en MALDI målplatta och lägga till modellösning
- Filöverföring 7 µL av pärla suspensionen automatiskt på MALDI mål plåt med en spot storlek på 2 600 µm. Låt pärlorna torka ut.
Obs: En liten USB-drivna fläkten kan användas för att påskynda den pärla som processaa uttorkning. - Automatiskt lägga till 2 µL av α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA)-matris lösning (innehållande 3 mg/mL HCCA, 1,8 mg/mL ammoniumcitrat, 70% acetonitril och 0,1% trifluorättiksyra) från matrix väl på varje plats på målplatta .
4. Signalera förvärv av en MALDI-TOF-MS och dataanalys
- analysera provet ställen med ett MALDI-TOF instrument använder positiv reflektor läge. Utföra intern kalibrering, data utjämning och baslinjen subtraktion automatiskt med leverantörsspecifika programvara.
Obs: Funktionsläget (positivt/negativt, linjär/reflektor) valt för MALDI-TOF mätning beror på målet peptider eller proteiner. - Beräkna relativa svar förhållandet (Nat/SIS intensitet ratio) och jämför det med standardkurvan reda av Ang jag koncentration i varje prov. Beräkna PRA med hjälp av ekvation (1), där Δt Ang jag generation representerar den tid som används för generering av Ang I.
PRA = [Ang jag] / Δt Ang jag generation (1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett automatiserat iMALDI förfarande för att mäta Ang jag visas i figur 1. Målet peptider (endogena peptider eller peptider från smälta proteiner) är berikad på anti peptid magnetiska pärlor, och sedan pärlorna överförs till en måltavla för MALDI mätning. Hela förfarandet förenklas jämfört med andra immuno-MS-tekniker som kräver ytterligare peptid eluering steg. Automatisering av iMALDI analysen möjliggör hög genomströmning analys av ett stort antal prover med en Inter dag variationskoefficienten (CV) under 10% 20. Representativa spectra erhålls genom att mäta Ang jag i humant plasmaprover visas i figur 2. De SIS peptiderna fungerar som intern standard för peptid kvantifieringsmetoden. Korrelation av PRA värden från 188 patientprover som erhålls med automatisk iMALDI analys med PRA värden som erhålls med hjälp av en klinisk LC-MS/MS förfarande17 visas i figur 3. De två metoderna har en korrelationskoefficient på 0,98; skillnaden mellan backarna kan orsakas genom användning av olika interna standarder i de två metoderna eller genom användning av olika antikroppar i iMALDI förfarande20. Det linjära området av analysen och Analysens precision visas i figur 4 och figur 5.
Figur 1: Process flöde Schematisk bild av ett automatiserat iMALDI PRA test. Anpassad från referens20, med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa spektra av NAT och SIS Ang jag peptider mätt från en mänsklig plasmaprov.
Figur 3: Korrelation av PRA värden som uppmätts av iMALDI och av LC-MS/MS från 188 patientprover. Anpassad från referens20, med tillstånd.
Figur 4: Linjära spänner iMALDI PRA analysens både (A) reflektor och (B) linjärt läge. Anpassad från referens20, med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Intraday precision (A) och interday precision (B) av iMALDI PRA analyser på plasmapooler med låg, medelhög och hög PRA värden. Anpassad från referens20, med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jämfört med konventionella MS-baserad protein kvantifiering, använder iMALDI antikroppar för att berika analyter och rena dem från komplexa prover, därför gör det möjligt att kvantifiera proteiner eller peptider vid låga koncentrationer. Ett avgörande steg i protokollet iMALDI är immuno-anrikningen av målet peptiderna. För detta ändamål bör antikroppar med hög specificitet och affinitet väljas. I SISCAPA, har det rapporterats att antikropp tillhörighet på 10-9 M eller bättre skulle behövas för att uppnå hög känslighet vid låga ng/mL21. Dessutom föredras pärlor med hög antikropp bindande kapacitet för optimal berikning.
Det är också viktigt att generera relativt ”ren” spectra för målmolekyler med minimal bakgrundsnivåerna. Hög signal-brus-förhållanden kan uppnås genom omfattande pärla tvätt efter steget immuno-anrikning. Dessutom har vi funnit att tvätta pärla fläckar på måltavlan efter att lägga till torkning modellösning kan avsevärt minska buller signalerna och därmed förbättra signal-brus-förhållandet.
IMALDI PRA analysen visat i detta arbete kräver inte proteolys stegen, som målmolekylen Ang är en peptid. För att kvantifiera proteinmolekyler i ett prov, är proteinet vanligtvis rötas till peptider innan immuno-anrikning, men för epitop-innehållande peptider, matsmältningen kan utföras på den fångade protein22,23. I det här fallet kan en befintlig protein matsmältningen protokoll infogas enkelt i iMALDI arbetsflödet. Beroende på matsmältningen bufferten, kan en avsaltning steg behövas innan fånga av peptiderna på pärlor, att undvika störningar med antikropp-peptid bindningen.
Liknar andra immuno-MS metoder, produktion av anti peptid antikroppar är en stor utmaning i utvecklingen av iMALDI analyser. Nyligen, Triple X Proteomics teknik har utvecklats för att producera affinitet bindemedel som kan rikta flera peptider per binder24. Detta kan minska kostnaden för anti peptid antikroppar och skulle underlätta utvecklingen av samtidiga multiplexade analyser med hjälp av en enda inkubation. Dessutom antikropp fragment25 eller syntetiska aptamers26 kan vara alternativ till användning av intakt antikroppar och skulle ha fördelen att lättare produktion. Syntetiska aptamers har rapporterats som visar lägre bakgrundsnivåer än intakt antikroppar när de används för affinitet-anrikning26.
iMALDI teknik kombinerar fördelarna med immunanalyser med MALDI masspektrometri, möjliggör snabb, hög genomströmning protein/peptid analys i ett stort antal komplexa prover, med hög känslighet och specificitet. Till skillnad från andra immuno-MS metoder, undvika efter immuno-capture, målet peptider inte elueras i röret, men pärlorna redovisade analyter överförs till MALDI mål plattan för MS-analys, därmed förlusten av peptider på grund av deras adsorption till plast rören. Jämfört med utbredda proteomiska verktyg såsom western blot eller ELISA, krävs endast en antikropp i iMALDI, avsevärt minska assay utvecklingstid och kostnad. Den lägre detektionsgräns som vi inhämtat i PRA-analysen är jämförbara konventionella Elisa och väl inom intervallet fysiologiska. Antikroppen och förhållandet massa-till-avgift ger en dubbel urvalsprocess, som säkerställer hög specificitet för analys. Tillämpningar av iMALDI är inte begränsat till PRA-analyser, men kan tillämpas för kvantitering av någon proteinuttryck och även kvantifiering av protein modifiering i komplexa prover. Framför allt kan den automatiserade hög genomströmning-iMALDI vara ett kraftfullt kliniska verktyg för identifiering och validering av protein markörer i en mängd olika sjukdomar, på grund av bänkmonterade MALDI instrument som för närvarande används på kliniker för bakteriella identifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C.H.B innehar patentet på iMALDI teknik.
Acknowledgments
Vi tackar det finansiella stödet från genomet Kanada och genomet British Columbia för operationer (204PRO) och teknikutveckling (214PRO) genom genomet innovationer nätverk (GIN). Vi tackar Drug Discovery plattformen på forskningsinstitutet för McGill University Health Center för användning av MALDI-TOF instrumentet för filmning. H.L. är tacksam för stöd från ett postdoktorsstipendium från National Science och Engineering Research rådet av Kanada (NSERC). C.H.B är tacksam för stöd från framkant Endowment Fund (LEEF). C.H.B. är tacksam för stöd från Segal McGill professor i molekylär onkologi vid McGill University (Montreal, Quebec, Kanada). M.X.C. och C.H.B. är tacksam för stöd från Warren Y. Soper Charitable Trust och Alvin Segal Family Foundation till judiska allmänna sjukhuset (Montreal, Quebec, Kanada).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
References
- Aebersold, R., Mann, M.
- Nicol, G. R., et al. Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients. Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).
- Webster, J., Oxley, D. Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. Zanders, E. D. , Humana Press. 227-240 (2012).
- Yergey, A. L., et al. De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).
- Anderson, L. Six decades searching for meaning in the proteome. J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).
- Landegren, U., et al. Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis. Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation. Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate. Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).
- Fredolini, C., et al.
- Tran, J. C., et al. Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies. Anal. Chem. , (2016).
- Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow. N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).
- Razavi, M., et al. High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).
- Anderson, N. L., et al. SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device. Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).
- Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective. The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).
- Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).
- Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II. Methods. 56 (2), 213-222 (2012).
- Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension. Clin. Proteomics. 10 (1), 20 (2013).
- Jiang, J., et al. Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis. Proteomics Clin Appl. 1, (2007).
- Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis. Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).
- Popp, R. An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).
- Schoenherr, R. M., et al. Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry. J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , US 7846748 B2 (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , CA 2507864 C (2011).
- Weiß, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).
- Nelson, A. L. Antibody fragments: Hope and hype. mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).
- Gupta, V., et al. An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein. Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).
