Summary
स्वचालित bliss-मालदी (iMALDI) तकनीक का उपयोग करके जटिल जैविक द्रव्यों में प्रोटीन ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है.
Abstract
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) एक जटिल नमूनों में प्रोटीन को बढ़ाता है के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रौद्योगिकियों में से एक है, एक लक्ष्य अणु की जन के प्रत्यक्ष का पता लगाने का एक परिणाम के रूप में उत्कृष्ट परख विशिष्टता के साथ । हालांकि, एमएस-आधारित प्रोटियोमिक्, सबसे अंय विश्लेषणात्मक तकनीकों की तरह, उच्च बहुतायत analytes को मापने की दिशा में एक पूर्वाग्रह है, तो यह कम एनजी/एमएल या स्नातकोत्तर/एमएल के जटिल नमूनों में पता लगाने की सीमा को प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण है, और यह कई के लिए एकाग्रता रेंज है रोग-मानव प्लाज्मा जैसे तरल पदार्थ में प्रासंगिक प्रोटीन । कम बहुतायत analytes का पता लगाने में सहायता करने के लिए, bliss-संवर्धन परख में एकीकृत किया गया है ध्यान केंद्रित करने और एमएस माप से पहले analyte शुद्ध, काफी परख संवेदनशीलता में सुधार । इस कार्य में bliss-मैट्रिक्स की सहायता से लेसर Desorption/Ionization (iMALDI) तकनीक के ठहराव-मोतियों पर bliss-संवर्धन के आधार पर, पूर्व रेफरेंस के बिना मालदी-एमएस माप के अनुसार, में प्रोटीन और पेप्टाइड्स के लिए प्रस्तुत है । विरोधी पेप्टाइड एंटीबॉडी चुंबकीय मोतियों पर कार्यात्मक रहे हैं, और नमूनों के साथ मशीन । धोने के बाद, मोती सीधे एक मालदी लक्ष्य प्लेट पर स्थानांतरित कर रहे हैं, और संकेत मैट्रिक्स समाधान मोतियों के लिए लागू किया गया है के बाद एक मालदी उड़ान के समय (मालदी-तोफ) साधन द्वारा मापा जाता है । नमूना तैयारी प्रक्रिया अन्य bliss-एमएस परख की तुलना में सरलीकृत है, और मालदी माप तेजी से है. पूरे नमूना तैयारी एक तरल हैंडलिंग प्रणाली के साथ स्वचालित है, बेहतर परख reproducibility और उच्च प्रवाह के साथ । इस अनुच्छेद में, iMALDI परख पेप्टाइड एन्जियोटेन्सिन मैं (मैं) प्लाज्मा, जो नैदानिक प्राथमिक aldosteronism (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) की स्क्रीनिंग के लिए प्लाज्मा रेनिन गतिविधि के readout के रूप में इस्तेमाल किया जाता है में एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
Introduction
मास स्पेक्ट्रोमेट्री मात्रात्मक प्रोटियोमिक् में एक अपरिहार्य उपकरण बन गया है । मास स्पेक्ट्रोमेट्री लक्ष्य प्रोटीन या पेप्टाइड्स की जनता निर्धारित कर सकते हैं, इसलिए प्राप्त analyte संकेतों immunoassays की तुलना में अत्यधिक विशिष्ट किया जा सकता है । दो ionization विधियों, electrospray और मालदी, सबसे अधिक प्रोटीन और पेप्टाइड्स का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है1,2,3,4. एमएस-आधारित प्रोटीन ठहराव में एक प्रमुख चुनौती उच्च बहुतायत प्रोटीन की उपस्थिति में एनजी/एमएल या स्नातकोत्तर/एमएल सांद्रता में जटिल नमूनों में कम बहुतायत प्रोटीन का पता लगाने में निहित है, और कई उंमीदवार प्रोटीन मानव प्लाज्मा में पाया मार्क्स है इस श्रेणी के भीतर5। यह समस्या मुख्यतः मानव proteome की अंतर्निहित व्यापक गतिशील रेंज और जटिलता के कारण होता है6।
इन का पता लगाने की चुनौतियों से उबरने के लिए, bliss-एमएस तरीकों लक्ष्य प्रोटीन या पेप्टाइड्स नमूना समाधान से एक ठोस सतह पर समृद्ध करने के लिए विकसित किया गया है, analytes और एमएस माप के रेफरेंस के बाद7,8 , 9 , 10. bliss-संवर्धन के माध्यम से, analytes जटिल नमूनों से शुद्ध कर रहे हैं और इसलिए आयन-दमन प्रभाव अन्य अणुओं से कम कर रहे हैं. विभिन्न ठोस समर्थन के अलावा, चुंबकीय मोतियों वर्तमान में सबसे व्यापक रूप से वे उच्च एंटीबॉडी बाध्यकारी क्षमता और हैंडलिंग में आसानी का लाभ है के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं । विभिंन functionalizations और आकारों के साथ चुंबकीय मोती विकसित किया गया है और immunoprecipitation प्रयोगों के लिए वाणिज्यिक । तिथि करने के लिए, bliss-संवर्धन मोतियों पर दोनों electrospray ionization (ईएसआई) और प्रोटीन और पेप्टाइड माप के लिए मालदी-एमएस के साथ इंटरफेस किया गया है । स्थिर आइसोटोप मानकों और कब्जा विरोधी पेप्टाइड एंटीबॉडी (SISCAPA) प्रौद्योगिकी, नमूनों में प्रोटीन में पचा रहे हैं, bliss-संवर्धन के लिए एंटीबॉडी-लेपित मोतियों के साथ मशीन द्वारा पीछा किया । "शास्त्रीय" SISCAPA में, कब्जा कर लिया proteotypic पेप्टाइड्स मोतियों से eluted हैं, और तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा मापा-ईएसआई-एमएस (LC-ms), या प्रत्यक्ष अर्क ईएसआई द्वारा-एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी-एमएस (ईएसआई-MRM-ms)11,12. bliss-संवर्धन परिमाण के 3-4 आदेश द्वारा MRM परख संवेदनशीलता में सुधार, कम एनजी पहुंच/
electrospray-ms की तुलना में, मालदी-ms तेजी से है, और नियंत्रण रेखा की सफाई और पुन: equilibration को शामिल नहीं करता है तो कोई स् और प्रदूषण के मुद्दे हैं, यह अधिक उच्च प्रवाह के अध्ययन के लिए उपयुक्त बनाने14. bliss-मालदी प्रौद्योगिकी हमारी प्रयोगशाला में विकसित किया गया है bliss-संवर्धन के साथ गठबंधन करने के लिए मालदी-MS के संवेदनशील और विशिष्ट ठहराव के लिए पेप्टाइड्स और प्रोटीन (quantitation पेप्टाइड्स के proteotypic के आधार पर)15,16 ,17. bliss-संवर्धन के बाद, मोतियों को मालदी लक्ष्य प्लेट पर जमा किया जाता है, मैट्रिक्स समाधान को मोतियों से जोड़ा जाता है, और प्लेट को सूखने के बाद एक मालदी-तोफ-MS द्वारा विश्लेषण के लिए तैयार रखा जाता है । मोतियों से पेप्टाइड्स का रेफरेंस एक अलग कदम के रूप में नहीं किया जाता है, लेकिन संबंध-बाउंड analytes को मनका धब्बों में जोड़ दिया जाए तो मालदी मैट्रिक्स सॉल्यूशन से eluted जाता है, जिससे नमूना तैयारी को सरल बनाता है और नमूना हानि को कम करता है. iMALDI प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों की एक किस्म में लागू किया गया है18,19, और हाल ही में स्वचालित किया गया है और एन्जियोटेन्सिन मैं (मैं) प्लाज्मा रेनिन गतिविधि (प्रा.) का निर्धारण करने के लिए आंग को मापने के लिए इस्तेमाल किया20। इस प्रोटोकॉल के लिए एक स्वचालित iMALDI परख प्रदर्शन करते थे प्रक्रिया का प्रदर्शन करेंगे । एक उदाहरण के रूप में प्रा परख लेते हुए, 10% से कम के अंतर दिवस सीवी स्वचालन के माध्यम से प्राप्त किया गया है, प्रति दिन ७४४ नमूनों को मापने की क्षमता के साथ20।
iMALDI प्रा इस पांडुलिपि में प्रदर्शन किया परख प्रोटीन पाचन की आवश्यकता नहीं है, लक्ष्य अणु के रूप में (मैं आंग) १२९५.७ दा की एक आणविक वजन के साथ एक पेप्टाइड है । अंय परख में जहां प्रोटीन पाचन आवश्यक है और एक पेप्टाइड बरकरार प्रोटीन के लिए किराए के रूप में प्रयोग किया जाता है, iMALDI के लिए चयनित पेप्टाइड अद्वितीय और लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट होना चाहिए, एक बड़े पैमाने पर के साथ ८०० दा इतना है कि यह आसानी से ग से प्रतिष्ठित किया जा सकता है मालदी मैट्रिक्स समाधान से hemical शोर । पेप्टाइड्स के bliss-संवर्धन के लिए विरोधी पेप्टाइड एंटीबॉडी की आवश्यकता है । एक iMALDI परख को मापने के लिए प्रोटोकॉल चार कदम: 1 मानव प्लाज्मा में आंग मैं की पीढ़ी के होते हैं; 2) bliss-मैं एंटीबॉडी-लेपित मोतियों का उपयोग आंग के संवर्धन; 3) एक मालदी लक्ष्य प्लेट को मोतियों का हस्तांतरण और मैट्रिक्स समाधान जोड़ने; और 4) एक मालदी द्वारा संकेत अधिग्रहण-तोफ-एमएस और डेटा विश्लेषण20।
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Protocol
- गल प्लाज्मा नमूने (& #8805; २०० & #181; L) 5 मिनट के लिए एक कमरे के तापमान पानी स्नान में, और फिर पूरी तरह से गल जब तक बर्फ पर नमूने डाल दिया.
- Transfer २०० & #181; प्रत्येक प्लाज्मा नमूने के एल एक १.१ मिलीलीटर के अलग कुओं को मैंयुअल रूप से डीप-वेल प्लेट (नमूना प्लेट), और 2 में 10 मिनट के लिए एक केंद्रापसारक में थाली केंद्रापसारक & #176; C और १२७८ x g.
- एक स्वचालित तरल हैंडलिंग प्रणाली का उपयोग करने के लिए प्रश्नपत्र पतला एक ५०० fmol/& #181; l आंग मैं NAT मानक समाधान चिकन अंडे के साथ छह औजार समाधान तैयार करने के लिए सफेद एल्ब्युमिन (०.१, ०.२, ०.६, १.९, ५.७, १७.२ fmol/& #181; l).
- पिपेट २०० & #181; येक औजार का एक वेल, और १२५ & #181; l के लिए जनरेशन बफर का नमूना प्लेट.
नोट: CEWA में फास्फेट बफर खारा (पंजाब) बफर प्रयोग के दिन पर नए सिरे से तैयार होने की जरूरत है । - एक स्वचालित तरल हैंडलिंग प्रणाली का उपयोग कर, एक नई थाली में मिश्रण १२५ & #181; l प्लाज्मा supernatant या १२५ & #181; CEWA के 25 & #181 के साथ पंजाब में एल के एल; आंग मैं जनरेशन बफर, जो 1 एम Tris, ०.२ mm ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), और 1 मिमी शामिल है l phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF).
नोट: एक 1 एम Tris/0.2 mM EDTA जलीय बफर मिश्रण से आंग मैं पीढ़ी बफर तैयार (एसिटिक एसिड का उपयोग कर पीएच ५.५ को समायोजित) और एक PMSF समाधान (मेथनॉल में १०० mM) । दोनों समाधानों को 1 माह तक संग्रहित किया जा सकता है 4 & #176; C. प्रयोग के दिन दो समाधानों को मिलाएं । - स्वचालित रूप से समाधान एक ९६-well थाली में स्थानांतरित, 3 समाधान प्रति प्रतिकृति, ३४ & #181; एल प्रति अच्छी तरह से । ३७ पर थाली मशीन & #176; ग के लिए 3 ज.
- विकार का उपयोग कर के संवर्धन एंटीबॉडी चुंबकीय प्रोटीन जी मोतियों पर
नोट: मोतियों के साथ विकार के एंटीबॉडी पर 3 ज आंग मैं पीढ़ी अवधि के दौरान मैंयुअल रूप से किया जाता है प्रयोग के दिन । अन्य analytes के लिए, संयुग्मित मोतियों को पंजाब में संग्रहित करने में सक्षम हो सकता है ०.०१५% लोग (PBSC) जिसमें 4 & #176; C तीन महीने या उससे अधिक समय के लिए, गुण और एंटीबॉडी की स्थिरता पर निर्भर करता है ।- अंतरण ११० & #181; मनका घोल के एल (20 नमूनों को मापने और एक 6 सूत्री मानक वक्र बनाने के लिए पर्याप्त) एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में । मोतियों को धोकर सात बार 25% acetonitrile/PBSC की 1 मिलीलीटर के साथ, और तीन बार PBSC के 1 मिलीलीटर के साथ । प्रत्येक धुलाई कदम के बीच मोतियों की गोली के लिए एक चुंबकीय खड़े का प्रयोग करें । अंतिम वॉश के बाद वाश बफ़र निकालें.
नोट: धुलाई के साथ 7 बार 25% acetonitrile/PBSC मनका घोल में MS-असंगत additives को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है, के बीच-20 । यदि चयनित मोतियों में ऐसी additives नहीं कर रहे हैं, इस व्यापक धुलाई कदम आवश्यक नहीं हो सकता है । - में मोतियों को रिसस्पेंड कर ११० & #181; l के PBSC, और add ११० & #181; l के विरोधी आंग I एंटीबॉडी (अंतिम एंटीबॉडी एकाग्रता: १०० & #181; g/mL). pipetting द्वारा मोती और समाधान मिश्रण है, और फिर उंहें 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी, 8 rpm पर घूर्णन ।
- 3 बार PBSC के 1 मिलीलीटर के साथ मोती धो लें, और ११०० & #181 में reसस्पैंड कर दें; L of PBSC.
नोट: यदि किसी भी मनका समाधान मशीन के दौरान ट्यूब की टोपी में प्रवाहित किया है, नीचे एक benchtop २६८० x g. पर केंद्रापसारक का उपयोग कर समाधान स्पिन
- मनका समाधान मैंयुअल रूप से एक ९६-अच्छी तरह से थाली (मनका मानक प्लेट) हस्तांतरण । एक ही ९६-अच्छी तरह से थाली करने के लिए मोतियों aliquot करने के लिए स्वचालित तरल हैंडलिंग प्रणाली का प्रयोग करें, १२० & #181; L प्रत well. & #160;
- अंतरण ११० & #181; मनका घोल के एल (20 नमूनों को मापने और एक 6 सूत्री मानक वक्र बनाने के लिए पर्याप्त) एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में । मोतियों को धोकर सात बार 25% acetonitrile/PBSC की 1 मिलीलीटर के साथ, और तीन बार PBSC के 1 मिलीलीटर के साथ । प्रत्येक धुलाई कदम के बीच मोतियों की गोली के लिए एक चुंबकीय खड़े का प्रयोग करें । अंतिम वॉश के बाद वाश बफ़र निकालें.
- bliss-मोतियों पर संवर्धन
- 3 एच आंग मैं पीढ़ी अवधि के बाद, पर मशीन प्लेट प्लेस 10 मिनट के लिए बर्फ आंग मैं की पीढ़ी को समाप्त करने के लिए
- स्वचालित रूप से SIS पेप्टाइड स्टॉक समाधान (10 pmol/& #956; L) १००-पंजाबियों बफर के साथ गुना, और आगे स्वचालित रूप से एक ९६-well पीसीआर प्लेट के लिए स्थिर isoptope मानक पेप्टाइड कमजोर पड़ने aliquot । स्थानान्तरण १.५ & #181; एक स्थिर आइसोटोप मानकों (SIS) पेप्टाइड समाधान (१०० fmol युक्त) की मशीन प्लेट के प्रत्येक कुआं में और यह प्लाज्मा नमूने या CEWA के साथ मिश्रण में पंजाब के बफर.
- स्वचालित रूप से मनका समाधान, 10 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से, मिश्रण करने के लिए मशीन की थाली की सामग्री हस्तांतरण ।
- 4 & #176 पर थाली मशीन; C 1 h के लिए 8 rpm पर घूर्णन करते हुए ।
- 5 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट (AmBic) सॉल्यूशन के साथ तीन बार मोतियों को धो लें, १०० & #181; L प्रति अच्छी तरह से धोएं । अंतिम वाश के बाद, 7 & #181 में मोतियों को फिर से सस्पेंड करना; प्रत्येक कुआं में 5 एमएम AmBic सॉल्यूशन का एल. पिछले धोने के बाद नीचे करने के लिए मोतियों को खींचने के लिए एक चुंबक का प्रयोग करें ।
- 7 & #181; L मनका घोल का एक स्थान आकार के साथ एक मालदी लक्ष्य प्लेट पर स्वचालित रूप से २,६०० & #181; मी. मोतियों को सुखा कर बाहर निकाल दो.
नोट: एक छोटे से यूएसबी संचालित प्रशंसक मनका सुखाने की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । - स्वचालित रूप से 2 & #181 जोड़; L के & #945;-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड (HCCA)-मैट्रिक्स समाधान (3 मिलीग्राम/एमएल HCCA, १.८ मिलीग्राम/एमएल अमोनियम साइट्रेट, ७०% acetonitrile, और ०.१% trifluoroacetic एसिड) मैट्रिक्स से अच्छी तरह से लक्ष्य प्लेट पर प्रत्येक नमूना स्थान पर .
- सकारात्मक रिफ्लेक्टर मोड का उपयोग कर एक मालदी-तोफ साधन के साथ नमूना स्थानों का विश्लेषण । आंतरिक अंशांकन, डेटा स्मूथिंग, और आधारभूत घटाव स्वचालित रूप से विक्रेता-विशिष्ट सॉफ़्टवेयर के साथ निष्पादित करें ।
नोट: मालदी-तोफ माप के लिए चयनित मोड (धनात्मक/ऋणात्मक, रेखीय/रिफ्लेक्टर) लक्ष्य पेप्टाइड्स या प्रोटीन पर निर्भर करता है । - सापेक्ष प्रतिक्रिया अनुपात (Nat/SIS तीव्रता अनुपात) की गणना और मानक वक्र करने के लिए यह एक नमूना में आंग मैं एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए तुलना करें । गणना प्रा समीकरण का उपयोग (1), जहां & #916; t आंग मैं पीढ़ी आंग मैं
की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल समय का प्रतिनिधित्व करता है प्रा = [आंग i]/& #916; t आंग i पादन (1)
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Representative Results
एक स्वचालित iMALDI आंग मैं चित्रा 1में दिखाया गया है मापने के लिए प्रक्रिया । लक्ष्य पेप्टाइड्स (या तो अंतर्जात पेप्टाइड्स या पेप्टाइड प्रोटीन से) विरोधी पेप्टाइड चुंबकीय मोतियों पर समृद्ध कर रहे हैं, और फिर मोतियों मालदी माप के लिए एक लक्ष्य प्लेट को हस्तांतरित कर रहे हैं. पूरी प्रक्रिया अंय bliss-MS प्रौद्योगिकियों कि अतिरिक्त पेप्टाइड रेफरेंस कदम की आवश्यकता की तुलना में सरलीकृत है । iMALDI परख के स्वचालन के नमूनों की एक बड़ी संख्या के उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए अनुमति देता है एक अंतर के साथ दिन के गुणांक (CV) के नीचे 10% 20. प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा मानव प्लाज्मा नमूनों में आंग मैं मापने द्वारा प्राप्त चित्रा 2में दिखाया गया है । SIS पेप्टाइड्स पेप्टाइड quantitation के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में कार्य करते हैं । १८८ रोगी प्रा एक नैदानिक नियंत्रण रेखा के उपयोग द्वारा प्राप्त मूल्यों के साथ स्वचालित iMALDI परख के साथ प्राप्त नमूनों से प्रा मूल्यों के सहसंबंध-ms/एमएस प्रक्रिया17 चित्रा 3में दिखाया गया है । दो विधियों में से एक सहसंबंध गुणांक ०.९८ है; ढलानों के बीच अंतर दो तरीकों में अलग आंतरिक मानकों के उपयोग के द्वारा, या iMALDI प्रक्रिया20में अलग एंटीबॉडी के उपयोग के कारण हो सकता है । परख और परख परिशुद्धता के रैखिक रेंज चित्रा 4 और चित्रा 5में दिखाए जाते हैं ।
चित्र 1: एक स्वचालित iMALDI प्रा परख की प्रक्रिया प्रवाह योजनाबद्ध । संदर्भ से अनुकूलित20, अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2: प्रतिनिधि के स्पेक्ट्रा NAT और SIS आंग मैं एक मानव प्लाज्मा नमूने से मापा पेप्टाइड्स.
चित्र 3: प्रा iMALDI द्वारा और नियंत्रण रेखा द्वारा मापा मूल्यों के सहसंबंध-ms/१८८ मरीज के नमूनों से ms/ संदर्भ से अनुकूलित20, अनुमति के साथ ।
चित्र 4: दोनों में iMALDI प्रा परख के रैखिक पर्वतमाला (एक) रिफ्लेक्टर और (ख) रैखिक मोड । संदर्भ20से अनुकूलित, अनुमति के साथ। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 5: इंट्रा डे प्रेसिजन (ए) और interday प्रेसिजन (बी) के साथ प्लाज्मा पूल पर iMALDI प्रा परख कम, मध्यम, और उच्च प्रा मूल्यों । संदर्भ से अनुकूलित20, अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
पारंपरिक एमएस आधारित प्रोटीन ठहराव की तुलना में, iMALDI एंटीबॉडी का उपयोग करता है analytes को समृद्ध और जटिल नमूनों से उन्हें शुद्ध, इसलिए यह संभव कम सांद्रता पर प्रोटीन या पेप्टाइड यों को बढ़ाता है. iMALDI प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम bliss-संवर्धन लक्ष्य पेप्टाइड्स की है । इस प्रयोजन के लिए उच्च विशिष्टता और अपनत्व के साथ एंटीबॉडी का चयन किया जाना चाहिए. SISCAPA में, यह सूचित किया गया है कि 10-9 मीटर या बेहतर पर एंटीबॉडी समानताएं कम एनजी पर उच्च संवेदनशीलता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक होगा/ इसके अलावा, उच्च एंटीबॉडी बाध्यकारी क्षमता के साथ मोती इष्टतम संवर्धन के लिए पसंद कर रहे हैं ।
यह भी अपेक्षाकृत कम पृष्ठभूमि के स्तर के साथ लक्ष्य अणुओं के लिए "स्वच्छ" स्पेक्ट्रा उत्पंन करने के लिए महत्वपूर्ण है । उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात bliss-संवर्धन कदम के बाद व्यापक मनका धोने के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । इसके अलावा, हमने पाया है कि जोड़ने और मैट्रिक्स समाधान सुखाने काफी शोर संकेतों को कम कर सकते है और इस तरह संकेत करने के लिए शोर अनुपात में सुधार के बाद लक्ष्य प्लेट पर मनका धब्बे धोने ।
iMALDI प्रा इस काम में प्रदर्शन किया परख प्रोटियोलिसिस कदम की आवश्यकता नहीं है, के रूप में लक्षित अणु आंग मैं एक पेप्टाइड है । एक नमूने में प्रोटीन अणुओं का अंदाजा लगाने के लिए, प्रोटीन आम तौर पर पेप्टाइड्स में bliss-संवर्धन से पहले पचा लिया है, हालांकि epitope-युक्त पेप्टाइड्स के लिए, पाचन पर कब्जा किया जा सकता है प्रोटीन22,23. इस मामले में, एक मौजूदा प्रोटीन पाचन प्रोटोकॉल iMALDI कार्यप्रवाह में आसानी से डाला जा सकता है । पाचन बफर पर निर्भर करता है, एंटीबॉडी-पेप्टाइड बाइंडिंग के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए, मोतियों पर पेप्टाइड्स का कब्जा करने से पहले एक लवण कदम की जरूरत हो सकती है ।
अंय bliss-एमएस तरीकों के समान, विरोधी पेप्टाइड एंटीबॉडी के उत्पादन iMALDI परख के विकास में एक प्रमुख चुनौती है । हाल ही में, ट्रिपल एक्स प्रोटियोमिक् प्रौद्योगिकी को समानता बांधने कि बांधने की मशीन24प्रति एकाधिक पेप्टाइड्स लक्ष्य कर सकते है उत्पादन विकसित किया गया है । यह विरोधी पेप्टाइड एंटीबॉडी की लागत को कम कर सकते हैं, और एक साथ एक ही मशीन का उपयोग कर एक साथ मल्टीप्लेक्स परख के विकास की सुविधा होगी । इसके अलावा, एंटीबॉडी टुकड़े25 या सिंथेटिक aptamers26 बरकरार एंटीबॉडी के उपयोग के लिए विकल्प हो सकता है और आसान उत्पादन का लाभ होगा । सिंथेटिक aptamers बरकरार एंटीबॉडी से कम पृष्ठभूमि स्तर दिखा के रूप में बताया गया है जब संबंध के लिए इस्तेमाल किया-संवर्धन26।
iMALDI प्रौद्योगिकी उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ जटिल नमूनों की एक बड़ी संख्या में तेजी से, उच्च प्रवाह प्रोटीन/पेप्टाइड विश्लेषण को सक्षम करने, मालदी मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ immunoassays के फायदों को जोड़ती है । अंय bliss-एमएस तरीकों के विपरीत, bliss-कैप्चर के बाद, लक्ष्य पेप्टाइड्स ट्यूब में eluted नहीं कर रहे हैं, लेकिन analytes ले जाने मोती एमएस-विश्लेषण के लिए मालदी लक्ष्य प्लेट पर स्थानांतरित कर रहे हैं, इस तरह पेप्टाइड्स के कारण प्लास्टिक के लिए उनके सोखना के नुकसान से बचने ट्यूब. पश्चिमी दाग या एलिसा के रूप में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया proteomic उपकरणों की तुलना में, केवल एक एंटीबॉडी iMALDI में आवश्यक है, काफी परख विकास समय और लागत को कम करने । पता लगाने की कम सीमा हम प्रा परख में प्राप्त की है पारंपरिक एलिसा के बराबर है, और अच्छी तरह से शारीरिक सीमा के भीतर । एंटीबॉडी और जन-प्रभारी अनुपात एक दोहरी चयन प्रक्रिया प्रदान करते हैं, जो परख की उच्च विशिष्टता सुनिश्चित करता है । iMALDI के आवेदन प्रा परख करने के लिए सीमित नहीं है, लेकिन किसी भी प्रोटीन अभिव्यक्ति और यहां तक कि जटिल नमूनों में प्रोटीन संशोधन के ठहराव के quantitation के लिए लागू किया जा सकता है । विशेष रूप से, स्वचालित उच्च प्रवाह iMALDI की खोज और मांयता के लिए एक शक्तिशाली नैदानिक उपकरण हो सकता है रोगों की एक किस्म में प्रोटीन की पुष्टि, benchtop मालदी उपकरणों की उपस्थिति के कारण वर्तमान में बैक्टीरियल के लिए क्लीनिक में इस्तेमाल किया पहचान.
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Disclosures
सी. एच. बी. iMALDI प्रौद्योगिकी पर पेटेंट रखती है.
Acknowledgments
हम जीनोम कनाडा और जीनोम ब्रिटिश कोलंबिया से संचालन (204PRO) और प्रौद्योगिकी विकास (214PRO) के लिए जीनोम नवाचारों नेटवर्क (जिन) के माध्यम से वित्तीय सहायता का धंयवाद । हम मालदी के उपयोग के लिए मैकगिल विश्वविद्यालय स्वास्थ्य केंद्र के अनुसंधान संस्थान में दवा डिस्कवरी मंच-तोफ उपकरण फिल्माने के लिए धंयवाद । H.L. कनाडा के राष्ट्रीय विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) से एक postdoctoral फैलोशिप से समर्थन के लिए आभारी है । सी. एच. बी. अग्रणी धार बंदोबस्ती कोष (LEEF) से समर्थन के लिए आभारी है । C.H.B. मैकगिल विश्वविद्यालय (मॉंट्रियल, क्यूबेक, कनाडा) में आण्विक ऑन्कोलॉजी में सहगल मैकगिल कुर्सी से समर्थन के लिए आभारी है । M.X.C. और C.H.B. वॉरेन Y. ःपर चैरिटेबल ट्रस्ट और एल्विन सहगल परिवार फाउंडेशन से यहूदी जनरल अस्पताल (मॉंट्रियल, क्यूबेक, कनाडा) के समर्थन के लिए आभारी हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
References
- Aebersold, R., Mann, M.
- Nicol, G. R., et al. Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients. Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).
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