Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Paul E. Leon; Teddy John Wohlbold; Wenqian He; Mark J. Bailey; Carole J. Henry; Patrick C. Wilson; Florian Krammer; Gene S. Tan

doi:10.3791/56067

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Immunology and Infection

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Generación de variantes de Escape de neutralizar anticuerpos Monoclonal del Virus de la Influenza

Published: August 29, 2017

doi:

10.3791/56067

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Paul E. Leon^1,2, Teddy John Wohlbold^1,2, Wenqian He^1,2, Mark J. Bailey^1,2, Carole J. Henry³, Patrick C. Wilson³, Florian Krammer¹, Gene S. Tan¹

¹Department of Microbiology,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ²Graduate School of Biomedical Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ³The Department of Medicine, Section of Rheumatology, The Knapp Center for Lupus and Immunology Research,The University of Chicago

Summary

Se describe un método por el cual identificamos residuos críticos necesarios para la Unión de humanos o murinos anticuerpos monoclonales dirigidos a la hemaglutinina viral del virus de la gripe A. El protocolo puede ser adaptado a otras glicoproteínas de superficie del virus y sus correspondientes anticuerpos neutralizantes.

Abstract

Virus de la gripe presentan una notable capacidad para adaptarse y evadir la respuesta inmune del huésped. Una forma es a través de cambios antigénicos que se producen en las glicoproteínas de superficie del virus. La generación de variantes de escape es un método de gran alcance en la aclaración de cómo el virus escapan detección inmune y en la identificación de residuos críticos necesarios para la Unión de anticuerpos. Aquí, describimos un protocolo sobre cómo generar variantes de escape del virus de influenza A mediante la utilización de humanos o murinos anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigido contra la hemaglutinina viral (HA). Con el uso de nuestra técnica, anteriormente caracterizamos residuos críticos para la Unión de anticuerpos a la cabeza o el tallo de la novela aviar H7N9 HA. El protocolo puede ser fácilmente adaptado para otros sistemas de virus. Análisis de variantes de escape son importantes para el modelado de deriva antigénica, determinación de polimorfismos de nucleótido único (SNPs) que confieren resistencia y aptitud del virus y en el diseño de vacunas y terapias.

Introduction

Similar a otros virus de ARN, los virus de influenza A poseen una polimerasa propensa a errores que permite la generación de una multitud de variantes antigénicas con cada ronda de replicación¹^,²^,³. El virus de influenza A tiene una capacidad asombrosa para adaptarse y evadir la respuesta inmune humana a través de deriva antigénica, que se logra a través de una acumulación de mutaciones en las glicoproteínas de superficie que conduce a la pérdida de unión de anticuerpos. Deriva antigénica de las glicoproteínas de superficie virales, HA y neuraminidasa (NA), exige la necesidad de reformular y administrar la vacuna anualmente.

Los avances tecnológicos en el aislamiento y la generación de anticuerpos antígeno específicos han producido un número elevado de mAbs inducida por la vacuna⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸. A su vez, la caracterización de los epitopos de mAbs que ampliamente neutralizar los virus de la gripe A ha ayudado grandemente el desarrollo de varios universal gripe vacuna candidatos⁹^,¹⁰^,¹¹^, ¹²^,¹³^,¹⁴. Dilucidar la huella antigénica de una mAb revela los determinantes estructurales de la neutralización y permite un acercamiento informado hacia el diseño de la vacuna. Sin embargo, no es ni realista ni rentable para los laboratorios caracterizar estructuralmente paneles extensos de mAbs a través de Cristalografía de rayos x o microscopia del cryo-electrón para mapa epitopos del antígeno viral¹⁵^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸.

Cristalografía de rayos x o microscopia del cryo-electrón requiere equipo costoso, técnicas especializadas y potencialmente una gran cantidad de tiempo para generar datos. Un enfoque alternativo y más rápido es la utilización de la generación rápida de diversas poblaciones virales vía el propenso RNA-dependiente polimerasa del RNA para generar mutantes de escape para determinar los epitopos de mAbs¹⁹^,²⁰^, ²¹^,²²^,²³. La generación de variantes de escape no requiere ningún equipo especial o técnica y se puede realizar con equipos y reactivos de laboratorio convencional.

Aquí, describimos un método que permite la asignación de residuos críticos requerida para el atascamiento de mAb que reconocen la gripe HA.

Protocol

PRECAUCIÓN: un número de virus de la gripe circulantes en la población humana (por ejemplo, H1, H3) son patógenos de clase de nivel 2 de bioseguridad que deben manejarse con cuidado y equipo de protección personal adecuado. Manejo de virus debe ser aprobado por la Junta de revisión institucional. El siguiente protocolo fue aprobado por la Junta de revisión institucional en el Monte Sinaí.

Nota: anticuerpos HA específicos que inhiben la replicación viral se pueden categorizar generalmente en i) que se unen en o cerca del sitio de unión del receptor encima de la cabeza globular y ii) que se unen a distal del atascamiento del receptor dominio, que incluye el lado lateral de la cabeza globular y la región del tallo de la HA. Anticuerpos que atacan el sitio de unión del receptor evitar la motivos de ácido siálico en la superficie de las células diana y se pueden medir mediante una prueba de hemoaglutinación inhibición (HI). Anticuerpos que son HI-negativas, tales como anticuerpos específicos para tallo, todavía puede inhibir la replicación viral, pero sólo pueden ser evaluadas mediante ensayos de neutralización.

1. categorización de anticuerpos basados en HI y neutralización de actividades

análisis de HI
1. en una placa de 96 pocillos V-inferior, añada 25 μl de PBS 1 x en las columnas 2 a 12.
2. Diluir la 7B2 mAb (específica de la cabeza), 6F12 (específico de tallo) ²³ y un control de isotipo a 100 μg/mL 1 x PBS y alícuotas de 50 μl de las preparaciones de anticuerpo diluido en columna 1. También no incluyen un control de mAb agregando 50 μl de PBS 1 x ( figura 1A).
3. Realizar diluciones seriadas 2 veces de los anticuerpos mediante la transferencia de 25 μl de la columna 1 columna 2 y así sucesivamente. Deseche los últimos 25 μl de la columna 12 ( figura 1A).
  Nota: Asegúrese de incluir una fila de no control del anticuerpo.
4. Diluir la acción de virus (virus recombinante expresando la HA y NA de A/California/04/09 con los segmentos internos de A/Puerto Rico/8/34) hasta 8 hemaglutinación unidades/25 μl diluir virus stock. Añadir 25 μl del stock de virus diluido (8 hemaglutinación) a cada pozo (filas A G).
  Nota: La mezcla de anticuerpos y virus debe tener un volumen final de 50 μL con una concentración final a partir de 50 μg/mL.
5. Incubar la placa a temperatura ambiente (RT) durante 45 min.
6. De la fila de volumetría (H), añadir 50 μl de PBS 1 x en pozos H2 a H12. Añada 100 μl de la 8 hemaglutinación unidades/25 μl a H1. En serie diluir dos veces al transferir 50 μl de H1 a H2 y así sucesivamente. Desechar la última 50 μl de H12 bien. Por último, añada 50 μl de 0.5% pollo células de sangre rojas (RBC) en todos los pocillos de la placa de 96 pocillos fondo V.
  Nota: Las muestras de mAb en el ensayo deben tener un volumen final de 100 μl: mAb (25 μl), virus (25 μl) y RBC (50 μL). El volumen final del no control mAb debe contener 25 μl de 1 x PBS, 25 μl de virus y 50 μl de eritrocitos.
7. Incubar la placa a 4 ° C por 1 h.
8. Lectura visual las placas para la actividad de HI. Si hay una lectura positiva de un anticuerpo particular, proceda al paso 2.1 para generar variantes de escape. Si el anticuerpo es HI-negativo, proceda a continuación al paso 1.2 para evaluar si el anticuerpo tiene que neutralizar la actividad en un ensayo de cultivo celular.
  Nota: Una lectura positiva de un mAb HI activa se indica mediante una pelotilla de RBC rojo oscurezca en el centro de un pozo ( figura 1B 7B2) que formará una lágrima cuando la placa de 96 pocillos fondo V se mantiene en un ángulo de 45 °. Una lectura negativa no formarán un diábolo rojo oscuro de RBC en el pozo ( figura 1B 6F12 y no mAb). El control de isotipo también no forma una pelotilla de RBC rojo oscurezca y aspecto idéntico del anticuerpo específico de tallo, 6F12 o el mAb no debe controlar la muestra ( figura 1B) ²³.
Ensayo de microneutralización
1. las células de la placa Madin Darby Canine riñón (MDCK) a una densidad de 2 x 10 ⁴ células/pozo en un cultivo de tejidos tratados placa de 96 pocillos e incubar a 37 ° C y 5% de CO ₂ de 17 a 19 h .
  Nota: Las células pueden también podrán adherirse al fondo del pozo durante al menos 4 h antes de su uso.
2. En una placa de 96 pocillos separada, realizar siete diluciones seriadas 3-fold del mAb humano 4D 05 ⁵, CR9114 ¹⁷ control o de isotipo IgG, en una concentración inicial de 200 μg/mL en 1 X medio esencial mínimo (MEM) suplementado con tosyl Fenilalanil clorometil cetona (TPCK)-tratado de tripsina (1 μg/mL) ( figura 2).
  Nota: La columna A debe contener 75 μl de anticuerpo diluido (a partir de la concentración de 200 μg/mL). En serie diluir (3-fold) abajo de la placa mediante la transferencia de 25 μl de la columna A la fila B y así sucesivamente. Filas A H deben tener un volumen final de 50 μl. No es necesario cambiar consejos entre dilución transferencias.
3. Diluir la acción de virus (virus recombinante expresando la HA y la NA de A/Shanghai/1/13 con el segmento interno de A/Puerto Rico/8/34) a una dosis infectiva de cultivo de tejidos 50% (TCID ₅₀) 100 / 50 μL en 1 x MEM complementado con tratados de TPCK tripsina (1 μg/mL) ²⁴. Añadir 50 μL/pocillo de virus diluido a las preparaciones de anticuerpo (paso 1.2.2). Añadir 50 μl de MEM X 1 a los pocillos control de células no infectadas.
4. Incubar las mezclas virus anticuerpos en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO ₂) durante 1 h.
  Nota: Las mezclas de anticuerpo del virus deben tener un volumen total de 100 μl: 50 μl de la dilución del anticuerpo (paso 1.1.2) y 50 μl de virus que contiene 100 TCID ₅₀ (paso 1.2.3).
5. Los medios de comunicación en los pozos de aspirar y añadir el todo 100 μl de las mezclas de anticuerpo del virus a los pocillos correspondientes.
  Nota: La aspiración se realiza utilizando un adaptador aspirador 8 canales conectado a un vacío. Como alternativa, puede usarse una pipeta multicanal de micro de 8 o 12 pozos para aspirar manualmente. Toda aspiración durante la eliminación de inóculo o lavados se realiza desde la mayor concentración de anticuerpos menor sin necesidad de cambiar consejos.
6. Lavar la monocapa con 200 μL de 1 x PBS. Aspirar 200 μL de PBS 1 x (como en el paso 1.2.5). Repita el lavado una vez más para un total de dos lavados.
7. Infectar la monocapa de células MDCK añadiendo el todo 100 μL/pocillo de mezclas de anticuerpo del virus (de paso 1.2.4) en la monocapa e infectar/incubar a 37 ° C (con 5% CO ₂) durante 1 h.
8. Durante la infección, en una placa de 96 pocillos separada, preparar otra serie de diluciones del anticuerpo. Añadir 150 μL de 100 μg/mL del anticuerpo correspondiente en la fila A y 100 μl de 1 x MEM suplementado con tripsina tratada TPCK (1 μg/mL) en filas B H. realizar 3-fold diluciones transfiriendo 50 μl de la columna A fila b , y así sucesivamente, hasta la fila H. desechar la última 50 μl de la fila H. El volumen total de cada bien debe ser igual a 100 μl. apartar.
  Nota: Los anticuerpos se diluyen en 1 x MEM suplementado con tripsina tratada TPCK (1 μg/mL).
9. Aspire el inóculo de anticuerpo del virus de la monocapa en paso 1.2.7 y reponer con el entero 100 μL/pocillo de la dilución del anticuerpo correspondiente preparado en el paso 1.2.8.
  Nota: Si un bien independiente una concentración de anticuerpo final de 100 μg/mL durante la infección (paso 1.2.7), entonces los medios de comunicación llenando también debe contener una concentración de anticuerpo final de 100 μg/mL (paso 1.2.8).
10. Incubar durante 24 h en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO ₂).
11. Los medios de comunicación de las placas de 96 pozos de aspirar y lavar con 200 μL/pocillo de PBS 1 x tres veces.
12. Fijar las células con 100 μl de acetona fría de 80% durante 1 h a -20 ° C.
  Nota: La solución de acetona 80% se diluye en doble destilada (dd) H ₂ O (p. ej., 80 mL de acetona al 100% más 20 mL de ddH ₂ 0). La solución de acetona 80% puede ser enfriada en hielo antes de su uso.
13. Lavar las células con 200 μL/pocillo de 1 X PBS tres veces.
14. Bloque las placas con 200 μL/pocillo de leche 5% diluyeron en 1 X PBS e incuban las placas a temperatura ambiente por 1 h.
15. Agregar 100 μl de biotinilado anti-influenza un anticuerpo primario de nucleoproteína (NP) diluido 1:2,000 1 x PBS/1% de albúmina de suero bovino (BSA) e Incube las placas a temperatura ambiente por 1 h.
  Nota: Para el virus de la gripe B, un anticuerpo de anti-NP influenza B virus-específica debe utilizarse.
16. Lavar las placas con 1 x PBS tres veces.
17. Añadir 100 μl del anticuerpo conjugado de peroxidasa (HRP) rábano estreptavidina diluido 1:3,000 1 x PBS/1% BSA e incubar las placas a temperatura ambiente por 1 h.
18. Lavar las placas con 200 μL de PBS 1 x tres veces.
19. Añadir Reactivo de substrato HRP en 100 μL/pocillo e incubar en la oscuridad a RT.
  Nota: El tiempo de incubación debe optimizarse antes de la adición del buffer ácido parada (abajo). Por lo general, basta con 15 a 30 min.
20. Calmar la reacción con 50 μL/pocillo de 5 M HCl.
  5M PRECAUCIÓN: el ácido clorhídrico es un reactivo altamente corrosivo que puede causar daños a ojos, piel y membranas mucosas. Además de este reactivo deben realizarse bajo una campana de ventilación con equipo de protección personal adecuado.
21. Leer las placas a 492 nm y restar los pocillos fondo (células no infectadas).
22. Calcular el porcentaje de inhibición con la siguiente fórmula:
23. si un anticuerpo tiene actividad de neutralización (y ninguna actividad HI), continúe con el paso 2.2.
  Nota: Carece de anticuerpos que carecen de actividad de neutralización en vitro actividad HI.

2. Generación de variantes de mutantes de Escape

Nota: anticuerpos neutralizantes que tienen o carecen de actividad de HI se analizan más lejos con los protocolos específicos que se describen a continuación.

Protocolo 1: anticuerpos HI-positivo/neutralización-positivo ( Figura 3A )
1. Prepare un caldo de virus de 10 ⁶ placa formando unidades/mililitro (PFU/mL) en PBS 1 x en el un volumen de 400 μl.
2. Preparar cuatro diluciones del anticuerpo de interés en el aumento de las concentraciones (por ejemplo, 0, 0.5, 0,05 y 0,005 mg/mL) en PBS 1 x en un volumen de 100 μl dilución.
  Nota: Virus tipo salvaje siempre deben ser pasados en paralelo y en la ausencia de anticuerpos. Las secuencias de estos virus los ayudará a distinguir entre la adaptación a las condiciones de cultivo de células y mutaciones de escape.
3. Mezclar 100 μl de 10 ⁶ PFU/mL de virus con 100 μl de cada dilución de anticuerpo o 100 μl de PBS 1 x.
4. Incubar durante 1 h en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO ₂). Vortex brevemente. Inyecte 200 μL de cada mezcla en huevos de pollo de patógeno específico libres (SPF) embrionados.
5. Incubar los huevos a 37 ° C (sin CO ₂) 40-44 h.
6. Sacrificar los huevos embrionados infectados de virus por incubación a 4 ° C durante un mínimo de 6 h.
7. Cosecha el líquido alantoideo de los huevos, como se describió anteriormente ²⁴ ^, ²⁵.
8. Realizar el ensayo de hemaglutinación, como se describe anteriormente ²⁴ ^, ²⁶. Si todos los preparativos fluidos alantoico no tienen títulos de hemoaglutinación, repita del paso 2 con las diluciones de anticuerpo que van de 0,005 mg/mL a 0,00005 mg/mL.
  Nota: Una concentración de saturación de un anticuerpo positivo HI puede neutralizar todas las partículas de virus presentes. Por lo tanto, puede ser necesario disminuir la cantidad de anticuerpos presentes en los pases.
9. Confirmar ²⁴ (paso 1.1) del análisis de las variantes de escape mediante la realización de la HI.
  Nota: Los anticuerpos HI-activo bloquean HA participación de adornos de ácido siálico en las células diana. Por lo tanto, un virus en presencia de su anticuerpo cognado pierde la capacidad de aglutinar glóbulos rojos (presencia de pellets de RBC). Teóricamente, escape variantes de anticuerpos HI-active pueden todavía atar ácido siálico motivos incluso en presencia de su anticuerpo cognado y así pueden aglutinar los glóbulos rojos (no pellet de RBC). Si la altura del anticuerpo de interés es todavía perceptible, repetir el protocolo de paso 2.1.2 con una mayor concentración partida del anticuerpo.
Protocolo 2: anticuerpos HI-positivo/negativo neutralización ( figura 3B )
Nota: para generar variantes de escape contra la neutralización de anticuerpos que no HI actividad, el virus debe ser pasado en presencia de cantidades crecientes de anticuerpos.
1. Las células MDCK la placa en una placa de 6 pozos a una densidad de 1 x 10 ⁶ células/pocillo e incubar durante un mínimo de 4 h en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO ₂).
2. Diluir la acción de virus 10 ⁶ PFU/mL o el virus del paso anterior en el 1 x MEM con tripsina tratada TPCK (1 μg/mL) en un volumen de 500 μl.
3. Preparar una sola dilución de anticuerpo (0,02 mg/mL para el pasaje original o superior para todos después de pasajes) en 1 x MEM con tripsina TPCK tratados en un volumen de 250 μl.
4. Mix 250 μl de virus diluido con 250 μl de anticuerpo diluido (+ anticuerpo) o 250 μl de 1 x MEM (no control del anticuerpo).
5. Incubar la mezcla del anticuerpo del virus por 30 min en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO ₂).
6. Aspirado los medios de comunicación utilizando un vidrio Pasteur pipeta y lavan la monocapa de células con 1 mL de 1 X PBS.
7. Añadir 500 μl de las mezclas en los pocillos e incubar en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO ₂) durante 1 h.
8. Después de 1 h, complementar los pozos con 2 mL de 1 x MEM con tripsina tratada TPCK (1 μg/mL).
9. Comprobar las células en las 48 h post-infección signos de efecto citopático (CPE) en el microscopio o realizar un ensayo de hemaglutinación para la detección de crecimiento viral ²⁶.
10. Si hay bruto CPE en las culturas con anticuerpos, recoger el sobrenadante en cryo-tubos múltiples, la etiqueta con el paso número y conservar a -80 ° C.
11. Guardar 100 μl del sobrenadante para infectar una monocapa fresca de MDCKs con 2 mL de 1 x MEM suplementado con tripsina TPCK y anticuerpo. No olvide no incluir ningún control del anticuerpo para cada paso.
  Nota: Aumentar la concentración del anticuerpo doble (o a discreción del investigador) en el siguiente pasaje (cada dos días).
12. Aumentar la concentración de anticuerpo en cada paso sucesivo, hasta que el crecimiento del virus es todavía viable incluso con una concentración final de 0.6 mg/mL de anticuerpos. Congelar los frascos múltiples del sobrenadante de cada paso y almacenan a -80 ° C.
  Nota: El no control del anticuerpo es crucial para verificar el crecimiento del virus de un pasaje a otro. Si hay bruto CPE en el no control del anticuerpo, pero no CPE en la + grupo de anticuerpos, esto indica que la concentración del anticuerpo era demasiado alta y no variantes de escape fueron generadas. Si hay bruto CPE en el no control del anticuerpo, pero solamente moderado CPE en el grupo de anticuerpos, esto indica la presencia de posibles variantes de escape. En el siguiente pasaje, aumentar el volumen de paso a 200 μL del sobrenadante y mantener la concentración de anticuerpo para aumentar la probabilidad de generar variantes de escape.

3. Aislamiento de variantes escapar a través de la purificación de placa

las células MDCK la placa en una placa de 6 pozos a una densidad de 1 x 10 ⁶ células/pocillo e incubar durante un mínimo de 4 h en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO ₂).
Diluir los anticuerpos en 1 x MEM con tripsina TPCK tratados a partir de 300 μg/mL en un volumen de 250 μl y mezclar con 250 μl de virus mutante de escape correspondiente. Pasados en ausencia de anticuerpos de virus debería ser placa purificada.
Aspirar los medios de comunicación de las células, lavar con PBS 1 x tres veces y agregar el entero 500 μl de la mezcla de anticuerpo del virus (paso 3.2).
Incubar las placas durante 1 h en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO ₂) asegurándose de roca ida y vuelta cada 10 minutos para evitar la sequedad de la monocapa.
Aspire las mezclas de anticuerpo del virus y llenar los pozos con medios de agar de recubrimiento que contienen cantidades correspondientes de anticuerpo (300 μg/mL; paso 3.2).
Incubar la placa de 40-44 h en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO ₂).
Las placas visibles del círculo con un marcador de color azul o negro para facilitar la selección de la placa.
Pick cuatro placas para cada uno escapan de anticuerpo del virus mutante, así como virus de tipo salvaje que fueron pasados en huevos en ausencia de anticuerpos o células MDCK.
Suspender la placa en 100 μl de PBS 1 x.
Inyectar la entera 100 μl de virus mutante de escape purificado placa 10 – viejos huevos de pollo embrionados SPF.
Incubar los huevos de 40-44 h en una incubadora de 37 ° C (sin 5% CO ₂).
Realizar un ensayo de hemaglutinación para confirmar la presencia de virus (paso 1.1).

4. Extracción de RNA Viral y análisis de HA secuencia de variación

Extracto de RNA viral de 200 μL de fluido alantoideo infeccioso del virus mutante de escape con una mono-fásica solución de fenol con isotiocianato de guanidina.
PRECAUCIÓN: El fenol es un reactivo líquido volátil que puede causar tos, dificultad para respirar y moderadamente irrita la piel por contacto.
Amplificar el segmento HA partir de RNA viral con el uso de una transcriptasa inversa y cartillas gene-específicas de la gripe A HA segmento ²⁷.
Nota: Los iniciadores universales para virus de la gripe B se describe en la tabla 2 amplifican tanto la HA (~ 1.800 bp) y la NA (~ 1.500 bp) ²⁸.
Resolver el producto de RT-PCR en un gel de agarosa al 1% y recortar la banda de tamaño correcto (~ 1.800 bp).
Gel extracto del producto PCR utilizando un procedimiento de purificación de sílice-membrana base y enviar el cDNA para secuenciación.
Identificar los residuos de aminoácidos requeridos para la Unión de anticuerpos distinguiendo las mutaciones encontradas en variantes de escape supuesta y pasados virus de tipo salvaje debido a la adaptación de la cultura de célula o selección inmunológica.
Clonar el producto PCR que contiene el tipo salvaje o variante HA de escapar en un vector de expresión de pCAGGs (NotI y NheI).
Unión de anticuerpo a la variante de escape HA puede evaluarse con una de dos opciones (o ambas) se describe más adelante.

5. Anticuerpo vinculante análisis de escapar variantes

células 293T de

inmunofluorescencia
1. la placa a una densidad de 2 x 10 ⁴ células/pozo en una placa de 96 pocillos e incubar en la incubadora de 37 ° C (con 5% CO ₂) durante 24 h.
2. Transfectar las células con 0.10 μg/pocillo de la pCAGGS plásmidos codifican el mutante de escape HA, virus pasados HA y HA de tipo salvaje (unpassaged) con el uso de un reactivo de transfección.
3. Incubar las placas de 96 pozos durante 48 h en incubadora de 37 ° C (con 5% CO ₂).
4. Fix con 100 μl de paraformaldehído al 0.5% durante 15 min a TA.
  PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es un reactivo líquido volátil que puede causar tos, dificultad para respirar y moderadamente irrita la piel por contacto. Ha sido designado como un potencial carcinógeno humano. Adición del reactivo debe realizarse en una campana química ventilación.
5. Lavado con PBS 1 x tres veces. Bloque con leche de 5% en PBS 1 x por 1 h a RT.
6. Lavado con PBS 1 x tres veces. Incubar con 5 μg/mL del anticuerpo de interés por 1 h a RT.
7. Incubar con 100 μl de anticuerpo secundario (humana o anti-ratón Alexa 488) a una dilución de 1:2,000 en 1 x PBS/1% BSA durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
8. Lavado con PBS 1 x tres veces. Observar las células en un microscopio de fluorescencia para tinción positiva o negativa.
Activado por fluorescencia de la célula clasificación (FACS)
1. las células 293T la placa a una densidad de 2 x 10 ⁵ células/pozo en una placa de 6 pozos e incuban a 37 ° C (con 5% CO ₂) por 24 h.
2. Transfectar las células con 0.50 μg/pocillo con pCAGGS plásmidos codifican el mutante de escape HA, virus pasados sólo HA y HA de tipo salvaje con el uso de un reactivo de transfección.
3. Incubar las placas de 6 pozos durante 48 h a 37 ° C (con 5% CO ₂).
4. Después de 48 h, aspirar el medio de crecimiento y lavar con PBS 1 x dos veces suavemente (Asegúrese de que la monocapa es imperturbada).
5. Cosechar las células 293T transfected con 500 μl de tampón FACS (1 x suero de ternera fetal de PBS/2%).
  Nota: Tampón FACS debe ser previamente enfriada a 4 º c antes de su uso.
6. Centrifugar las células 293T cosechados a 300 x g durante 5 min a 4 ° C.
7. Aspirar el tampón FACS y resuspender con 200 μL de tampón FACS que contiene mAbs de interés (concentración final de 1 a 5 μg/mL). Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos
8. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 minutos a 4 ° C. lavado dos veces con 500 μl de tampón FACS. Aspirar cuidadosamente con un vaso de pipeta Pasteur en cuanto a no perturbar el sedimento.
9. Resuspender con 200 μL de tampón FACS que contiene anticuerpo secundario conjugado a Alexa 488 (dilución final de 1:1, 000). Incubar en la oscuridad a 4 ° C durante 20 min
10. Centrifugar las células a 300 g durante 5 min a 4 ° C. lavado dos veces con 500 μl de tampón FACS y Aspire cuidadosamente el tampón de lavado.
11. Suspender en 500 μl de tampón FACS y evaluar atascamiento de mAbs o policlonales sera a las células transfectadas con HA por FACS.
  Nota: No olvide incluir un sin control de sueros policlonales/mAb como una muestra de untransfected en el experimento de.

Representative Results

Anteriormente hemos utilizado variaciones de este método para generar variantes de escape a mAbs humanos y murinos inducidos por la vacuna antigripal estacional, H7N9 vacunación o secuencial HA ADN/recombinante proteína vacunación⁴^,⁵ ^,⁶^,⁷. Como se describió anteriormente, los anticuerpos primero se caracterizaron usando el análisis HI y microneutralización para informarnos de que protocolo específico para continuar con siguiente⁴^,⁵. Anticuerpos 5D 07 03 07-5F01, 07-5G 01, 07-4B03, 07-4E02 y 07-4D 05 se encontraron actividades HI y neutralización contra el virus H7N9 aviar (A/Shanghai/1/2013) (tabla 1), y así se utilizó protocolo 1 (paso 2.1). Para mAbs con neutralizar esa falta de actividad de la HI, como 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 y S6-B01 (tabla 1), protocolo 2 (paso 2.2) se utilizó para generar variantes de escape. Asignación de mutantes de escape reveló que muchos de los anticuerpos reconocen residuos críticos en distintas localizaciones en el viral HA⁴^,⁵ (figura 4). Aunque la mayoría de los anticuerpos HI-positivas han escapar residuos mutantes cerca sitios antigénicos previamente divulgados de la H7 HA, los anticuerpos HI-negativo generan a mutantes de escape con mutaciones puntuales en el pedúnculo de la región⁴^,⁵.

Anticuerpo	Hola actividad	Actividad NEUT
07-5D 03	+	+
07-5F01	+	+
07-5G 01	+	+
07-4B03	+	+
07-4E02	+	+
07-4D 05	+	+
41-5E04	–	+
045-051310-2B06	–	+
042-100809-2F04	–	+
S6-B01	–	+

Tabla 1: Tabla de anticuerpos HI y neutralización actividad. Diez mAbs específicos de H7 aisladas de individuos vacunados con una vacuna experimental del H7N9 exhiben diferentes en vitro actividades antivirales⁵.

	Primer avance (5′ a 3′)	Reverse Primer (5′ a 3′)	Condiciones de Thermocylcer
IAV	TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG	ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT	42 º c durante 60 min, 94 ° c por 2 min/5 ciclos de 94 º c por 20 s, 50 º c por 30 s y 68 º c durante 3 min 30 s, seguido por 40 ciclos de 94 º c por 20 s, 58 º c por 30 s y 68 º c durante 3 min 30 s con un tiempo de extensión final a 68 º c por 10 min.
IBV	GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC	CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC	45 º c por 60 min, 55 º c por 30 min, 94 ° c por 2 min/5 ciclos de 94 º c por 20 s, 40 º c por 30 s y 68 º c durante 3 min 30 s, seguido por 40 ciclos de 94 º c por 20 s , 58 º c por 30 s y 68 º c durante 3 min 30 s con un tiempo de extensión final a 68 º c por 10 min.

Tabla 2: cartillas de virus de influenza Universal. Pares de primer para la amplificación de los segmentos HA de influenza A²⁷ y B²⁸ virus y sus condiciones respectivas termociclador.

Figura 1: ensayo HI. (A) A esquema para establecer un ensayo de HI probar la actividad de dos mouse H1 específico mAbs 7B2 (específica de la cabeza) y 6F12 (tallo-específico) con una placa de 96 pocillos fondo V y (B) un ejemplo de los resultados de un ensayo de HI²³. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: ensayo de microneutralización. Un esquema para establecer un ensayo de microneutralización probar la actividad de dos mAbs humana 4 05⁵ y CR9114¹⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: generación de mutantes de escape. La metodología sugerida dependerá la HI y la actividad de microneutralización exhibida por el anticuerpo. La generación de mutantes de escape contra (A) anticuerpos neutralizantes HI-positivas pueden requerir un pasaje único en los huevos, mientras que los anticuerpos neutralizantes de HI-negativo (B) pueden implicar varios pasos con el aumento de cantidades de anticuerpos en cultivo de tejido celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: ejemplo de un mapa del epítopo de la novela aviar H7N9 HA generado variantes mutantes de escape. Inducida por la vacuna los anticuerpos aislaron de individuos vacunados con un candidato gripe H7N9 una vacuna se utilizaron para generar variantes mutantes del escape. Cada residuo indicado en rojo representa la situación de críticas aminoácidos necesarios para la Unión eficaz de un mAb. Los datos fueron adaptados de Henry Dunand et al., 2015⁴. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Aunque la mayoría de los residuos identificados a través de mutantes de escape han sido exacta, una de las principales advertencias de este enfoque es que las mutaciones de punto de variantes de escape no pueden corresponderse necesariamente dentro de la huella molecular de anticuerpos determinado por análisis estructurales. Esto es debido a la capacidad de llevar a un cambio conformacional distal a la localización de los residuos mutados, análogo a un efecto alostérico de una mutación en un determinado residuo. Otra limitación es que esta metodología puede aplicarse sólo para neutralizar anticuerpos; anticuerpos que falta en la vitro presión selectiva no dará lugar a mutantes de escape. Sin embargo, esta limitación puede superarse con el uso de un panel de variantes de escape generada anticuerpos neutralizantes previamente caracterizados. Tan et al usaron una variante de escape de un mAb neutralizante para el virus H7N9 para mapear el epitopo de un anticuerpo no neutralizante⁷.

Sin embargo, elucidar los epítopos de anticuerpos a través de la generación de variantes de escape proporciona una alternativa viable a la microscopía Cristalografía y cryo-electrón, los cuales requieren una gran inversión de equipo. Otras alternativas son determinar la región mínima obligatoria de mAbs utilizando a mutantes de truncamiento/escaneo escaneo o péptido alanina. Exploración de mutagénesis de la alanina puede requerir una cantidad significativa de trabajo en la generación de un gran número de variantes durante la proyección²⁹, mientras que el análisis de péptidos se limita a epitopos lineales³⁰. El método descrito en el presente Protocolo no requiere equipo especial o técnica y de hecho, hace uso de los existentes en vitro neutralización análisis modificados para generar variantes de escape de los anticuerpos de interés.

El protocolo para generar variantes de escape que requieren múltiples pasos (p. ej., anticuerpos específicos del tallo) es altamente dependiente de la concentración inicial de anticuerpos en el paso 0. Es mejor pecar de cauteloso y empezar en un tronco en medio un registro inferior a la concentración inhibitoria máxima media de un anticuerpo y permiten crecimiento robusto del virus. El investigador puede especular que un cultivo de virus de alto título en presencia de baja presión inmunológica tendrá una gran variación genética en la población viral. Variantes de escape pueden seleccionarse para poco a poco aumentando la concentración de anticuerpos en los siguientes pasajes. En caso de que el crecimiento del virus disminuye, la cantidad de sobrenadante viral puede incrementarse en el pasaje siguiente manteniendo la misma cantidad de la concentración de anticuerpo en el paso anterior.

El objetivo de la mayoría de vacunas contra la influenza universal es provocar una respuesta de anticuerpo robusta hacia la región del tallo de la HA. El análisis de variantes de escape a los anticuerpos específicos del tallo son importantes en la definición de la relación entre la aptitud del virus de la gripe y la presión inmunológica. Curiosamente, virus mutante de escape resultante de mAbs específicos de tallo eran todo atenuado en vivo en murinos LD₅₀ estudios⁴. Estos estudios proporcionan un fuerte caso para plataformas de vacunación basada en tallo. Además, este protocolo puede utilizarse para identificar a mutantes de escape a otros compuestos anti-virales, como los inhibidores de molécula pequeña. Por último, esta metodología no se limita a glicoproteínas de superficie de virus de influenza, pero también puede aplicarse más ampliamente para determinar los epitopos de otras glicoproteínas virales.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este proyecto ha sido financiado en parte con fondos federales del Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas, institutos nacionales de salud, Departamento de salud y servicios humanos, bajo CEIRS contrato HHSN272201400008C (F.K.); U19AI109946 NIH-01 (F.K.); y P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

Materials

Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid	Corning, Inc.	353072	Assay plate use for the microneutralization assay
Falcon 96-well clear V-bottom plate	Corning, Inc.	353263	Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay
1X Minimal Essential Medium (MEM)	Gibco	11095080	Infection medium
Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin	Sigma-Aldrich	T8802	Cleaves immature HA₀ to HA₁ and HA₂
Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV)	EMD Millipore	MAB8258B	An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses
Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV)	EMD Millipore	MAB8260B-5	An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses
Streptavidin-HRP antibody	EMD Millipore	18-152	This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody
HRP substrate (SIGMAFAST-OPD)	Sigma-Aldrich	P9187-5SET	o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP
96-well V-bottom plate	Nunc	249662	Assay plate used for the hemagglutination assay
Chicken red blood cells	Lampire Biological Laboratories	7201403	Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate
TRIzol	Ambion	15596026	Extraction of RNA
Superscript III	Invitrogen	12574018	Reverse transcriptase
Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Isolation of amplified PCR product
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027	Transfection reagent
Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11013	Fluorescent secondary antibody for human antibodies
Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Fluorescent secondary antibody for murine antibodies
6-well polystyrene microplate	Corning, Inc.	353934
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
Nalgene long term storage Cryo-tubes	ThermoFisher Scientific	5012-0020	Freezing of viral culture supernatant
reassortant A/California/04/09 (H1)	Palese Laboratory		reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)
reassortant A/Shanghai/1/13 (H7)	Palese Laboratory		reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)
Bovine serum albumin solution (35%)	Sigma-Aldrich	A7979
Qiagen gel extration kit	Qiagen	28704	Silica-membrane-based purification of DNA fragments

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Leon, P. E., Wohlbold, T. J., He, W., Bailey, M. J., Henry, C. J., Wilson, P. C., Krammer, F., Tan, G. S. Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies. J. Vis. Exp. (126), e56067, doi:10.3791/56067 (2017).