Summary
Denne protokol beskriver en høj overførselshastighed metode til funktionelt skærmen for protein-baserede arv i S. cerevisiae.
Abstract
Kodning af biologiske oplysninger, der er tilgængeligt for fremtidige generationer er generelt opnået via ændringer i DNA-sekvens. Langlivede arv kodet i protein kropsbygning (snarere end sekvens) har længe været set som paradigme-skift, men sjældne. De bedste karakteriserede eksempler på sådanne epigenetiske elementer er prioner, som besidder en selvsamlende adfærd, der kan drive den arvelige manifestation af nye fænotyper. Mange arketypiske prioner vise en slående N/Q-rige sekvens bias og samle til en amyloid fold. Disse usædvanlige egenskaber har informeret de fleste screening bestræbelserne på at identificere nye prion-proteiner. Dog havnen mindst tre kendte prioner (herunder den stiftende prioner, PrPSc) ikke disse biokemiske egenskaber. Vi har derfor udviklet en alternativ metode til at probe omfanget af protein-baserede arv baseret på en ejendom massevirkningsloven: den forbigående overekspression af prioner proteiner øger den hyppighed, hvormed de erhverve en self-templating kropsbygning. Dette papir beskriver en metode til at analysere gær ORFeome evne til at fremkalde proteinbaseret arv. Bruger denne strategi, vi tidligere har konstateret, at > 1% af gær proteiner kunne brændstof fremkomsten af biologiske træk, der var langlivet og stabil, og rejste sig oftere end genetiske mutation. Denne tilgang kan være ansat i høj overførselshastighed på tværs af hele ORFeomes eller som en målrettet screening paradigme for specifikke genetiske netværk eller miljømæssige stimuli. Ligesom fremad genetiske skærme definere utallige udviklingsmæssige og signalering veje, give disse teknikker en metode til at undersøge indflydelsen af protein-baserede arv i biologiske processer.
Introduction
Biologiske systemer oplever ofte forbigående udsving i protein overflod. Om disse har en varig indvirkning i udformningen af Fænotypen af en organisme eller fremtidige generationer er fortsat uklart. De mest kendte forekomster af denne biologi indebærer en sjælden klasse af protein, prioner, som drive fremkomsten af arvelige træk uden genom ændring. I stedet sender disse proteinaceous og ifectious partikler fænotyper via selvforstærkende ændringer i protein kropsbygning1,2. Denne type af arv blev opdaget som årsag til usædvanligt arv mønstrene af en ødelæggende neurodegenerativ sygdom. Dog har undersøgelser i organismer spænder fra svampe til pattedyr3,4,5,6,7,8,9,10 siden afslørede at prion-lignende elementer kan indebære adaptive værdi. Ikke desto mindre har prioner blevet set som en fascinerende men sjældne biologiske særhed.
Denne fremherskende visdom holdes delvist fordi karakterisering af protein-baserede arv har længe været begrænset af et lille sæt af eksempler. Seneste bestræbelser på systematisk screening har udvidet dette billede betydeligt ved at identificere flere nye Bonafide prioner11 og næsten to dusin protein domæner12 med kapacitet til brændstof prion-lignende konformationelle konvertering. Men fordi disse tilgange har generelt fokuseret på stærk aminosyre sekvens bias, af prioner, som er blevet opdaget deler de biokemiske egenskaber af stiftende gær prioner [PSI+]13,14, [URE3]15og [RNQ+]11,16. Disse omfatter: 1) modulære domæner, der er rig på længe polymere strækninger af asparagin (N) og glutamin (Q), 2) samling i en amyloid [PRION+] kropsbygning17,18,19, og 3) fuldstændig afhængighed af disaggregase Hsp104 funktion for trofaste overførslen fra mor til datter13,20,21. Faktisk, mange Bonafide prioner, herunder [GAR+], [Het-s], og selv den oprindelige prioner (PrPSc), vil blive savnet under sådanne strenge kriterier. Måske endnu vigtigere, ville de være i stand til at fange nogen roman mekanismer af protein-baserede arv22. Således, den sande biologiske bredde af sådanne fænomener kan være langt mere udbredt i naturen end hidtil antaget.
For at undersøge dette spørgsmål, var en høj overførselshastighed, proteom-dækkende strategi ansat. Kendetegnende for alle prioner, herunder PrPSc, [GAR+], og [Het-s], er at den forbigående overekspression af de kausale proteiner kraftigt øger antallet af prioner erhvervelse15,23,24,25,26. Vi tog fordel af denne funktion til systematisk spørge, på tværs af hele gær ORFeome, hvis stabil protein-baseret, epigenetiske stater kunne indledes af forbigående inducerende overekspression af individuelle proteiner. Det er velkendt, at protein overekspression kan ændre fænotyper27. Dog er prion proteiner usædvanlig, fordi deres midlertidige overproduktion producerer et skift i fænotype, der er arvelige for mange hundredvis af generationer efter den indledende overekspression. Tidligere tog vi fordel af denne funktion, samt de usædvanlige arv mønstre af protein-baserede genetiske elementer, til at identificere snesevis af proteiner, der er i stand til at heritably re-kabler fænotypiske landskaber uden at ændre genom28. Selv om nogle identificeret var proteiner tidligere kendt som prioner, de fleste var ikke, understreger kraften i denne tilgang til at afdække nye former for protein-baserede arv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De første gær prioner blev identificeret ved deres usædvanlige fænotyper og indviklede mønstre af arv. Karakteristik af disse prioner blev derefter brugt til at bygge algoritmer og beregningsmæssige redskaber til at screene for yderligere prion proteiner. Metoden beskrevet her, derimod er eksperimentel og afhængig af forbigående overekspression at skabe en varig forandring-en stabil stat-kodet i protein kropsbygning. Dog hvis effektivitet "seeding" prion forsamling af overekspression for enhver given protein er meget lav, at protein vil hele tiden komme ud som en falsk negativ i overekspression skærme af denne type. En sådan ændring at korrigere dette ville være at bruge en 2-micron plasmid for protein overekspression fremover eksperimenter. Endelig hver induceret prion har sit eget unikke sæt af vækst fænotyper og vil ikke være synlige i hver tilstand analyseres. Således er begrænser antallet af forskellige betingelser og testede doser antallet af hits.
Vigtigere, vil ikke alle typer af protein-baserede arv være lige så genoprettet ved hjælp af denne metode. Proteiner, der ikke kan være overexpressed effektivt eller uden toksicitet vil naturligvis blive savnet hele tiden. Mitotically ubestandige stoffer, såsom "mnemons," ville aldrig blive overført til døtre efter indledende overekspression22. Derimod kan andre typer af langlivede bistabile switches teoretisk være fremkaldt via forbigående overekspression42,43. Disse stater er dog typisk ikke afhængig af protein homeostatiske maskiner eller overføres via "seedet" proteiner. Derudover ville prioner, der er afhængige af andre chaperoner (uden for Hsp70 og Hsp104) eller ekstra arme af protein homøostase netværk for formering mislykkes de anstandsdame-afhængighed assays beskrevet her. Endelig, en lav overflod proteiner, som også danner amyloid muligvis smitteevne priser under detektionsgrænsen i protein transformation setup.
Denne protokol beskriver en teknik for inducerende stabil proteinbaseret epigenetiske stater via protein overekspression samt yderligere downstream trin til at validere om hver induceret epigenetiske stat er en Bonafide prioner. Eksemplet præsenteres i dette papir, Psp1, er et eksempel på et protein, der viser en "prion-lignende" aminosyre bias og teoretisk kunne inddrives ved hjælp af tidligere udviklet bioinformatic algoritmer. Dog Psp1 manglende evne til at danne amyloid og sin usædvanlige anstandsdame afhængighed (Hsp104) vil have hurtigt diskvalificeret det fra yderligere analyser og dermed elimineret det fra prion overvejelse. Men de screening teknikker præsenteret i dette papir er agnostiker til disse antagelser og i stedet fokusere på de underliggende mønstre af arv og tilstrækkeligheden af protein alene til at overføre de tilsvarende fænotyper. Ja, størstedelen af protein-baserede arv inddrives med denne metode var N/Q-rige sekvens bias.
Denne metode blev brugt til at probe hele gær ORFeome for sin evne til at fremkalde proteinbaseret arv i en fordomsfri måde ved hjælp af kun et lille antal stressfaktorer (25 mM cadmium chlorid, 1 mM cobalt chlorid, 2 mM kobber sulfat, 1 mM diamide, 0,2 mM fluconazol, 50 mM hydroxyurea, 20 mM mangan chlorid, 0,75 mM paraquat, 50 mM radicicol, 80 J/m2 UV-bestråling og 10 mM zinksulfat). Denne tilgang kunne dog let ændres til skærmen genetiske netværk eller specifikke cellulære svar mere målrettet. For eksempel, funktionelt relaterede proteiner eller alle proteiner er reguleret i kunne en diskret signaling netværk induceret via forbigående overekspression og screenes med stressorer relateret til deres biologiske funktion. Derimod kunne en større række proteiner screenes med et mere omfattende sæt af stressfaktorer at undersøge om specifikke cellulære svar naturligt har udviklet sig til havnen prion switche. Endelig, selv om vi har foretaget disse undersøgelser i gær, mange aspekter af eksperimenter (fx forbigående protein udtryk, anstandsdame "hærdning", etc.) kunne generaliseres til andre modelsystemer i fremtiden. For eksempel pattedyr vævskultur er indstillet til overekspression via plasmid-baserede systemer, og fluorescens foci kunne også bruges som en udlæsning for arvelige samlesæt, som beskrevet tidligere28. Desuden kan protein-kodning sekvenser fra andre organismer udtrykt i gær og testet for deres evne til at fremkalde prion-lignende arv ved hjælp af de metoder, der beskrives her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She og Susan Lindquist for deres bistand udvikle assays anvendes i dette papir, som anmeldere for deres tankevækkende kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
| Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
| 5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
| BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
| FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
| Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
| Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
| Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
| CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
| CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
| CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
| CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
| CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
| peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
| bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
| yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
| agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
| Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
| Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
| Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
| Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
| Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
| RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
| biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
| zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
| Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
| Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
| Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |
References
- Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).
- Byers, J. S., Jarosz, D. F. Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions. PLoS Pathog. 10 (4), 1003992 (2014).
- Jarosz, D. F., et al. Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism. Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).
- True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146 (3), 448-461 (2011).
- Cai, X., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
- Majumdar, A., et al. Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory. Cell. 148 (3), 515-529 (2012).
- Khan, M. R., et al. Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator. Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).
- Fioriti, L., et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).
- Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106 (2), 171-182 (2001).
- Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137 (1), 146-158 (2009).
- Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
- Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science. 273 (5275), 622-626 (1996).
- Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
- Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).
- Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).
- Glover, J. R., et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
- King, C. Y., et al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).
- Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation. Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).
- Caudron, F., Barral, Y. A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship. Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).
- Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta]. Methods. 39 (1), 3-8 (2006).
- Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).
- Brown, J. C., Lindquist, S. A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).
- Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).
- Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
- Chakrabortee, S., et al. Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits. Cell. 167 (2), 369-381 (2016).
- Hu, Y., et al. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).
- Swain, P. S., et al. Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes. Nat Commun. 7, 13766 (2016).
- Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425 (1992).
- Formosa, T., Nittis, T. Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).
- Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).
- Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition. Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. (17), (2008).
- Rogoza, T., et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).
- Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).
- Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).
- Tanaka, M., Weissman, J. S. An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).
- Roberts, B. T., Wickner, R. B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation. Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli. Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).
