Summary
이 프로토콜 기능 S. cerevisiae에 단백질 기반 상속에 대 한 화면을 높은 처리량 방법을 설명 합니다.
Abstract
미래 세대에 액세스할 수 있는 생물 학적 정보의 인코딩 변화 DNA 시퀀스를 통해 일반적으로 달성 된다. 수명이 긴 상속 단백질 구조 (보다는 오히려 순서)으로 인코딩된는 오래 패러다임 변화 하지만 드문으로 간주 되었습니다. 최고의 특징이 같은 후 성적인 요소는 prions, 새로운 고기의 상속 징후를 구동할 수 자가 조립 동작을가지고 있습니다. 많은 archetypal prions는 눈에 띄는 N/Q-풍부한 시퀀스 바이어스를 표시 하 고 녹말 체 접이식으로 조립. 이러한 비정상적인 기능 대부분 심사 노력 새로운 프리온 단백질 식별을 통보 했다. 그러나, 적어도 3 개의 알려진된 prions (를 포함 하 여 창립 프리온, PrPSc)이 생 화 확 적인 특성 항구 하지 않습니다. 우리는 따라서 대량 작업의 속성에 따라 단백질 기반 상속의 범위를 조사 하는 대체 방법 개발: 프리온 단백질의 과도 overexpression 증가 주파수는 그들은 자체 템플릿 구조 확보. 이 문서에서는 단백질 기반 상속을 유도 하는 효 모 ORFeome의 용량을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 이 전략을 사용 하 여, 우리가 이전에 발견 하는 > 1% 효 모 단백질의 수명이 긴, 안정, 그리고 유전자 변이 보다는 더 빈번 하 게 발생 생물학 특성의 출현을 연료 수. 이 방법은 전체 ORFeomes 또는 특정 유전자 네트워크 또는 환경 자극에 대 한 대상된 심사 패러다임으로 높은 처리량에 사용할 수 있습니다. 앞으로 유전 스크린 수많은 발달 및 신호 경로 정의 하는 것 처럼 이러한 기술을 생물학 과정에서 단백질 기반 상속의 영향을 조사 하는 방법을 제공 합니다.
Introduction
생물 학적 시스템 자주 단백질 풍부에 일시적인 동요를 경험 한다. 이러한 표현 형 유기 체 또는 미래 세대의 형성에 지속적인 영향을 미칠 여부 불분명 남아 있습니다. 이 생물학의 가장 잘 알려진 인스턴스 단백질, prions, 게놈 수정 없이 상속 특성의 출현을 드라이브의 드문 클래스를 포함 합니다. 대신, 이러한 프로teinaceous 그리고 에fectious 입자 고기 자기 영속적인 변화 단백질 구조1,2를 통해 전송합니다. 상속의이 유형은 치명적인 신경 퇴행 성 질병의 특이 한 상속 패턴의 원인으로 발견 되었다. 그러나, 유기 체 균 류에서 포유류3,4,5,6,7,8,,910 에 이르기까지 연구 이후 프리온 같은 요소 적응 값을 부여 수 있습니다 밝혀 있다. 그럼에도 불구 하 고, prions는 희귀 생물 이상한 하지만 매혹적인로 간주 되었습니다.
이 통용 지혜는 단백질 기반 상속의 특성 오래 예의 작은 세트에 의해 제한 되어 있기 때문에 부분에서 개최 됩니다. 최근 체계적인 심사 노력 식별 하 여 여러 가지 새로운 진실 fide prions11 명의 거의 단백질 도메인12 연료 프리온 같은 구조적 변환 용량이 사진을 크게 확대 했습니다. 그러나, 이러한 방식을 일반적으로 강한 아미노산 시퀀스 편견에 초점을 맞춘, 때문에 발견 되었습니다 prions 창립 효 모 prions [PSI+]13,14,15, [URE3] 및 [RNQ+]11,16의 생 화 확 적인 속성을 공유 합니다. 이러한 포함: 1) 모듈형 도메인을 아스파라긴 (N)과 글루타민 (Q), 2) 어셈블리는 녹말 체 [프리온+] 나 란17,,1819로 긴 고분자 뻗어 풍부 하 고 3) disaggregase 어머니 딸13,,2021에서 충실 한 전파에 대 한 Hsp104 함수에 대 한 의존도 완료. 실제로, 많은 진실 fide prions, 포함 한 [르+], [한-s], 그리고 원래 프리온 PrP (Sc), 이러한 엄격한 조건에서 놓친 것 이다. 아마도 더 중요 한 것은, 그들은 것입니다 수 없습니다 단백질 기반 상속22의 새로운 메커니즘을 캡처. 따라서, 이러한 현상의 진정한 생물학적 폭 자연 이전 생각 보다 훨씬 더 일반적인 수 있습니다.
이 문제를 조사, 높은 처리량, 프로테옴 전체 전략 고용 되었다. PrPSc, [르+]를 포함 하 여 모든 prions의 특징 [한-s]은 인과 단백질의 과도 overexpression 강하게 프리온 수집15,23,,2425,26의 비율을 증가. 우리는 뚜렷이 개별 단백질의 overexpression를 유도 하 여 안정적인 단백질 기반, 후 상태를 시작할 수 경우 체계적으로, 전체에 걸쳐 ORFeome, 효 모에이 기능을 이용을 했다. 잘 알려진 그 단백질 overexpression 고기27를 변경할 수 있습니다. 그러나 그들의 임시 과잉 생산 초기 overexpression 후 세대의 많은 수백에 대 한 상속을 표현 형에서 변화 하기 때문에, 프리온 단백질 평소 되지 않습니다. 우리는 이전 단백질 기반 유전 요소, heritably phenotypic 풍경 게놈28변경 하지 않고 다시 배선 수 있는 단백질의 수십을 식별 하기 위해 특이 한 상속 패턴 뿐만 아니라이 기능을 이용 했다. 비록 일부 확인 된 단백질 이전로 알려져 있었다 prions, 대부분, 새로운 형태의 단백질 기반 상속을 밝히기 위해이 접근의 힘을 강조 했다.
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Discussion
첫 번째 효 모 prions는 그들의 특이 한 고기 및 상속의 복잡 한 패턴에 의해 확인 되었다. 이러한 prions의 특성 다음 알고리즘 및 계산 도구 추가 프리온 단백질에 대 한 화면을 사용 했다. 여기서 설명 하는 방법을 반대로 실험 이며 지속적인 변화는 안정 상태 인코딩된 단백질 구조에서 만들 과도 overexpression에 의존. 그러나, "시드" 어떤 주어진된 단백질에 대 한 overexpression에 의해 프리온 어셈블리의 효율성 매우 낮은 경우에, 그 단백질이 유형의 overexpression 화면에서 거짓으로 지속적으로 나타날 것입니다. 이 문제를 해결 하려면 같은 한 수정 단백질 overexpression 미래에 대 한 2-미크론 플라스 미드를 사용 하 여 실험 것입니다. 마지막으로, 각 유발된 프리온에는 그것의 자신의 독특한 성장 고기 고 것입니다 하지 될 모든 조건에서 분석. 따라서, 다른 조건과 테스트 복용량 수 안타의 수를 제한 합니다.
중요 한 것은, 모든 유형의 단백질 기반 상속 것입니다 동등 하 게 복구할 수이 메서드를 사용 하 여. 효율적으로 overexpressed 수 없습니다 또는 독성 없이 놓친 것입니다 분명히 지속적으로 단백질. Mitotically 불안정 요소, "mnemons," 같은 것 절대 딸 초기 overexpression22다음에 전파 됩니다. 대조적으로, 긴 쌍 스위치의 과도 overexpression42,43를 통해 이론적으로 유도 될 수 있습니다. 그러나, 단백질 homeostatic 기계에 종속 또는 "시드" 단백질을 통해 전달할 수에 일반적으로 이러한 상태 하지. 또한, prions 다른 보호자 (외부 Hsp70 및 Hsp104) 또는 전파에 대 한 단백질 항상성 네트워크의 추가 무기에 의존 하는 여기에 설명 된 보호자 종속성 분석 실패 합니다. 마지막으로, 아 밀 로이드 형성 낮은 풍부한 단백질 단백질 변환 설정에서 검출 한계 이하의 infectivity 전송률을 할 수도 있습니다.
이 프로토콜 진실 fide 프리온은 단백질 overexpression 뿐만 아니라 추가 다운스트림 단계 각 유도 후 상태 확인을 통해 안정적인 단백질 기반 후 상태를 유도 하는 기법을 설명 합니다. 이 문서, Psp1에 소개 된 예제 "프리온-같은" 아미노산 바이어스를 표시 하 고 이전에 사용 하 여 복구할 수 이론적으로 단백질의 예로 bioinformatic 알고리즘 개발 이다. 그러나, 아 밀 로이드의 특이 한 보호자 의존 (Hsp104)를 Psp1의 무 능력 것가지고 신속 하 게 실격 추가 분석에서 고 따라서 프리온 고려 사항에서 그것을 제거. 그러나,이 문서에 소개 된 심사 기법 지론 이러한 가정은 고 대신 상속의 기본 패턴 및 해당 고기를 전송 하는 혼자 단백질의 자족에 초점. 실제로, 대부분이이 방법으로 복구 하는 단백질 기반 상속의 N/Q-풍부한 시퀀스 편견 없는 했다.
이 방법은 전체 효 모 스트레스 (25 m m 카드뮴 염화, 1mm 코발트 염화, 2 m m 구리 황산, 1 m m diamide, 0.2 m m fluconazole, 50mm hydroxyurea, 20mm 망간 염화, 0.75 m m 파라콰트, 50 m m radicicol, 80 J/m2 UV 방사선의 적은 수를 사용 하 여 편견된 패션에 단백질 기반 상속을 유도 하는 능력에 대 한 ORFeome을 사용 되었다 그리고 10 m m 아연 황산 염). 그러나,이 접근 수 쉽게 수정할 수 화면 유전자 네트워크 또는 특정 세포 응답에 더 많은 타겟 방식. 예, 기능적으로 관련된 단백질 또는 모든 단백질 규제에 대 한 개별 신호 네트워크 수 과도 overexpression 통해 유도 있고 그들의 생물학 기능에 관련 된 스트레스와 상영. 반면, 단백질의 더 큰 세트는 특정 세포 응답 프리온 스위치 항구를 자연스럽 게 진화 여부를 조사 하는 스트레스의 더 포괄적인 세트와 상영 수 있습니다. 마지막으로, 비록 우리가에서 이러한 연구를 실시 했습니다 효 모, 실험의 여러 측면 (예를 들어, 일시적인 단백질 표정, 보호자 "치료," 등) 다른 모델 시스템에 미래에 일반화 될 수 있다. 예를 들어 포유류 조직 배양 플라스 미드-기반 시스템 overexpression 의무가 이며 형광 foci 수 자기 조립,로 상속 설명 이전28도 판독으로 사용할 수. 또한, 다른 유기 체에서 단백질 코딩 순서 효 모에 표현 하 고 프리온 같은 상속 여기 설명 된 방법을 사용 하 여 유도 하는 능력에 대 한 테스트 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리가 그들의 도움으로 그들의 사려깊은 의견에 대 한 검토자가이 문서에서 사용 되는 분석 실험 개발에 대 한 Sohini Chakrabortee, 산드라 존스, 데이비드 가르시아, Bhupinder Bhullar, 아멜리아 장, 리처드 그녀와 Susan Lindquist 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
| Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
| 5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
| BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
| FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
| Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
| Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
| Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
| CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
| CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
| CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
| CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
| CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
| peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
| bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
| yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
| agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
| Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
| Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
| Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
| Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
| Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
| RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
| biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
| zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
| Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
| Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
| Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |
References
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