Summary
Questo protocollo descrive una metodologia di alto-rendimento allo schermo funzionalmente per base di proteine di ereditarietà in S. cerevisiae.
Abstract
La codifica di informazioni biologiche che sono accessibile alle generazioni future è generalmente ottenuta tramite modifiche alla sequenza di DNA. Longeva eredità codificati in proteina conformazione (anziché sequenza) lungamente è stato osservato come lo spostamento di paradigma, ma rara. Esempi di tali elementi epigenetici meglio caratterizzati sono i prioni, che possiedono un comportamento auto-assemblante che può guidare la manifestazione ereditabile di nuovi fenotipi. Molti prioni archetipici visualizzare un notevole pregiudizio sequenza N/Q-ricco e assemblare un ovile dell'amiloide. Queste caratteristiche insolite hanno informato la maggior parte degli sforzi di screening per identificare nuove proteine prioniche. Tuttavia, almeno tre prioni noti (tra cui il prione fondatore, PrPSc) non porto queste caratteristiche biochimiche. Abbiamo pertanto sviluppato un metodo alternativo per sondare l'ambito dell'eredità a base di proteine basata su una proprietà di azione di massa: la sovraespressione transiente di proteine prioniche aumenta la frequenza in cui acquisiscono una conformazione di auto-applicazione di modelli. Questo articolo descrive un metodo per analizzare la capacità del lievito ORFeome a suscitare l'ereditarietà a base di proteine. Utilizzando questa strategia, abbiamo trovato in precedenza che > 1% di proteine del lievito potrebbe alimentare l'emergere dei tratti biologici che erano longevi, stabile e ha presentato più di una mutazione genetica. Questo approccio può essere impiegato in elevato throughput attraverso ORFeomes intero o come un paradigma di screening mirato per reti genetiche specifiche o stimoli ambientali. Come schermi genetici avanti definiscono numerose vie di segnalazione e di sviluppo, queste tecniche forniscono una metodologia per indagare l'influenza dell'eredità di base di proteine nei processi biologici.
Introduction
Sistemi biologici spesso esperienza transitorie fluttuazioni in abbondanza di proteine. Se questi hanno un impatto duraturo nel plasmare il fenotipo di un organismo o delle generazioni future rimane poco chiaro. I più noti casi di questa biologia coinvolgono una rara classe di proteine, i prioni, che guidano l'emergere dei tratti ereditari senza alcuna modifica del genoma. Invece, queste particelle di fectious proteinaceous e neltrasmettono fenotipi tramite auto-perpetuante cambiamenti di conformazione della proteina1,2. Questo tipo di ereditarietà è stato scoperto come la causa dei modelli di ereditarietà insoliti di una devastante malattia neurodegenerative. Tuttavia, gli studi negli organismi che variano dai funghi ai mammiferi3,4,5,6,7,8,9,10 da allora hanno rivelato che il prione-come gli elementi possono conferire valore adattativo. Ciò nonostante, i prioni sono stati visti come un affascinante ma rara stranezza biologica.
Questa saggezza prevalente si svolge in parte perché la caratterizzazione di base proteica eredità lungo è stata limitata da un piccolo insieme di esempi. I recenti sforzi di screening sistematico hanno ampliato significativamente questa immagine individuando diversi nuovi bona fide prioni11 e quasi due dozzine di proteina domini12 con la capacità di conversione conformazionali del prione-come combustibile. Tuttavia, poiché questi approcci sono generalmente concentrati su pregiudizi di sequenza dell'amminoacido forte, i prioni che sono stati scoperti condividono le proprietà biochimiche del fondatore lievito prioni [PSI+]13,14, [URE3]15e [RNQ+]11,16. Questi includono: 1) modulare domini che sono ricchi di tratti lungo polimerici di asparagina (N) e glutammina (Q), 2) assembly in un amiloide [PRION+] conformazione17,18,19e 3) completano dipendenza da disaggregase funzione di Hsp104 per la propagazione di fedeli da madre a figlia13,20,21. Infatti, molti bona fide prioni, tra cui [GAR+], [Het-s] e anche l'originale del prion (PrPSc), sarebbe saltato sotto tali criteri rigorosi. Forse ancora più importante, sarebbero in grado di catturare qualsiasi nuovi meccanismi di ereditarietà su base proteica22. Quindi, l'ampiezza biologica vera di tali fenomeni può essere molto più comune in natura di quanto si pensasse.
Per studiare questa domanda, una strategia di alto-rendimento, tutto il proteoma è stato impiegato. Un segno distintivo di tutti i prioni, tra cui PrPSc, [GAR+], e [Het-s], è che la sovraespressione transitoria delle proteine causale aumenta fortemente il tasso del prione acquisizione15,23,24,25,26. Abbiamo approfittato di questa funzionalità per sistematicamente chiedere, su tutto il lievito ORFeome, se stati stabili basati su proteine, epigenetici potrebbero essere iniziati inducendo transitoriamente la sovraespressione delle singole proteine. È ben noto che la sovraespressione della proteina può alterare fenotipi27. Tuttavia, proteine prioniche sono insoliti perché loro sovrapproduzione temporanea produce un cambiamento nel fenotipo che è ereditabile per molte centinaia di generazioni dopo la sovraespressione iniziale. Abbiamo precedentemente preso vantaggio di questa funzione, così come i modelli di ereditarietà insoliti di elementi genetici basati su proteine, per identificare decine di proteine che sono in grado di heritably necessità di cablaggio fenotipiche paesaggi senza alterare il genoma28. Anche se alcuni identificati proteine precedentemente erano conosciuti come i prioni, la maggior parte erano non, sottolineando la potenza di questo approccio per scoprire nuove forme di ereditarietà a base di proteine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I prioni lievito primi sono stati identificati dai loro fenotipi insoliti e perplessi modelli di ereditarietà. Le caratteristiche di questi prioni furono poi utilizzate per costruire algoritmi e strumenti computazionali alla schermata per proteine prioniche aggiuntive. Il metodo descritto qui, al contrario, è sperimentale e si basa sulla sovraespressione transitoria per creare un duraturo cambiamento-a stabile stato codificato nella conformazione della proteina. Tuttavia, se l'efficienza di "semina" Assemblea del prion da sovraespressione per qualsiasi data proteina è molto bassa, che la proteina continuamente emergerà come un falso negativo nelle schermate di sovraespressione di questo tipo. Una tale modifica per risolvere il problema sarebbe utilizzare un plasmide di 2 micron per la sovraespressione della proteina in futuro esperimenti. Infine, ogni prionica indotto ha relativo proprio insieme unico dei fenotipi di crescita e sarà non essere evidente in ogni condizione analizzati. Così, il numero di condizioni diverse e dosi testate limita il numero di colpi.
Cosa importante, non tutti i tipi di ereditarietà su base proteica saranno ugualmente recuperati utilizzando questo metodo. Ovviamente ci mancherà continuamente proteine che non possono essere sovraespresso in modo efficiente o senza tossicità. Elementi mitotically instabili, ad esempio "mnemons," non avrebbero mai propagare a figlie seguire la sovraespressione iniziale22. Al contrario, altri tipi di Interruttori bistabili longevo teoricamente potrebbero essere indotto tramite sovraespressione transiente42,43. Tuttavia, questi Stati sono in genere non dipendente da macchinari omeostatico della proteina o trasmissibile tramite proteine "seminato". Inoltre, i prioni si basano su altri chaperoni (di fuori di Hsp70 e Hsp104) o bracci aggiuntivi della rete omeostasi della proteina per propagazione fallirebbe i dosaggi di chaperone-dipendenza descritti qui. Infine, una proteine di abbondanza bassa che anche formano amiloide potrebbero avere tariffe inferiori al limite di rilevazione di infettività nel programma di installazione di trasformazione proteina.
Questo protocollo descrive una tecnica per indurre stati epigenetici basati su proteine stabili tramite sovraespressione della proteina, come pure più ulteriormente a valle procedura per convalidare se ciascuno indotta stato epigenetico è un prione bona fide . L'esempio presentato in questa carta, Psp1, è un esempio di una proteina che visualizza una polarizzazione dell'amminoacido "del prion-like" e potrebbe teoricamente essere recuperato utilizzando precedentemente sviluppato algoritmi bioinformatici. Tuttavia, l'incapacità di Psp1 per formare amiloide e la sua dipendenza insolito chaperone (Hsp104) sarebbe rapidamente squalificato da ulteriori analisi e quindi eliminato dal conto del prion. Tuttavia, le tecniche di screening presentate in questa carta sono indipendente da questi presupposti e invece concentrano sui sottostanti modelli di ereditarietà e la sufficienza della proteina da solo per trasmettere i fenotipi corrispondenti. Infatti, la stragrande maggioranza della base di proteine eredità recuperata con questo metodo era privo di pregiudizi sequenza N/Q-ricco.
Questo metodo è stato utilizzato per sondare il lievito intero ORFeome per la sua capacità di suscitare ereditarietà a base di proteine in modo imparziale, utilizzando solo un piccolo numero di fattori di stress (cloruro di cadmio di 25 mM, 1 mM di cloruro di cobalto, solfato di rame di 2 mM, 1 mM diammide, fluconazole 0,2 mM, 50mm hydroxyurea, cloruro di manganese 20 mM, il paraquat 0,75 mM, 50mm radicicol, 80 J/m2 irradiazione UV e solfato di zinco 10 mM). Tuttavia, questo approccio potrebbe essere facilmente modificato per reti genetico schermo o specifiche risposte cellulari in modo più mirato. Per esempio, proteine funzionalmente correlate o tutte le proteine regolato una discreta rete di segnalazione potrebbe essere indotta tramite sovraespressione transitoria e proiettata con fattori di stress legate alla loro funzione biologica. Al contrario, un più ampio insieme di proteine potrebbe proiettato con un set più completo di fattori di stress per indagare se specifiche risposte cellulari si sono evoluti naturalmente per harbor interruttori da prioni. Infine, anche se abbiamo condotto questi studi in lievito, molti aspetti degli esperimenti (ad esempio, l'espressione della proteina transitoria, chaperon "curare", ecc.) potrebbe essere generalizzata ad altri sistemi di modello in futuro. Ad esempio, coltura di tessuti dei mammiferi è favorevole alla sovraespressione tramite sistemi basati su plasmide e fuochi di fluorescenza potrebbero essere anche essere utilizzato come una lettura per ereditabile auto-assemblaggio, come descritto in precedenza28. Inoltre, sequenze codificanti proteine da altri organismi potrebbero essere espresso in lievito e testati per la loro capacità di suscitare da prioni-come eredità utilizzando i metodi descritti qui.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She e Susan Lindquist per la loro assistenza nello sviluppo i dosaggi utilizzati in questa carta, come pure gli utenti per i loro commenti riflessivo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
| Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
| 5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
| BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
| FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
| Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
| Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
| Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
| CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
| CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
| CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
| CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
| CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
| peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
| bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
| yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
| agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
| Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
| Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
| Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
| Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
| Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
| RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
| biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
| zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
| Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
| Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
| Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |
References
- Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).
- Byers, J. S., Jarosz, D. F. Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions. PLoS Pathog. 10 (4), 1003992 (2014).
- Jarosz, D. F., et al. Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism. Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).
- True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146 (3), 448-461 (2011).
- Cai, X., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
- Majumdar, A., et al. Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory. Cell. 148 (3), 515-529 (2012).
- Khan, M. R., et al. Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator. Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).
- Fioriti, L., et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).
- Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106 (2), 171-182 (2001).
- Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137 (1), 146-158 (2009).
- Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
- Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science. 273 (5275), 622-626 (1996).
- Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
- Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).
- Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).
- Glover, J. R., et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
- King, C. Y., et al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).
- Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation. Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).
- Caudron, F., Barral, Y. A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship. Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).
- Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta]. Methods. 39 (1), 3-8 (2006).
- Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).
- Brown, J. C., Lindquist, S. A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).
- Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).
- Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
- Chakrabortee, S., et al. Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits. Cell. 167 (2), 369-381 (2016).
- Hu, Y., et al. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).
- Swain, P. S., et al. Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes. Nat Commun. 7, 13766 (2016).
- Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425 (1992).
- Formosa, T., Nittis, T. Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).
- Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).
- Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition. Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. (17), (2008).
- Rogoza, T., et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).
- Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).
- Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).
- Tanaka, M., Weissman, J. S. An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).
- Roberts, B. T., Wickner, R. B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation. Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli. Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).
