Summary
Denne protokollen beskriver en høy gjennomstrømming metode å funksjonelt skjermen for protein-basert arv i S. cerevisiae.
Abstract
Koding av biologiske informasjon som er tilgjengelig for fremtidige generasjoner er generelt oppnås via endringer i DNA sekvensen. Varige arv kodet i protein konformasjon (snarere enn sekvens) har lenge vært betraktet som paradigme-skifter, men sjelden. De beste preget eksemplene på epigenetic elementer er prioner, som har en selvstendig montering atferd som kan kjøre arvelige manifestasjonen av nye fenotyper. Mange arketypiske prioner viser en slående N/Q-rik sekvens bias og sette sammen til en amyloid fold. Disse uvanlige funksjoner har informert om de fleste screening innsats for å identifisere nye prion proteiner. Imidlertid tre kjente prioner (inkludert den opprinnelige prion, PrPSc) ikke havn disse biokjemiske egenskaper. Vi derfor utviklet en alternativ metode å undersøke omfanget av protein-basert arv basert på en egenskap massevirkningsloven: det forbigående overuttrykte prion proteiner øker frekvensen som de skaffe en selv-templating konformasjon. Denne artikkelen beskriver en metode for å analysere kapasiteten til gjær ORFeome å framprovosere protein-basert arv. Bruker denne strategien, vi tidligere funnet som > 1% av gjær proteiner kunne drivstoff fremveksten av biologiske egenskaper som var lang levetid, stabil, og oppsto oftere enn genetisk mutasjon. Denne tilnærmingen kan anvendes i høy gjennomstrømming over hele ORFeomes eller som et målrettet screening paradigme for bestemte genetisk nettverk eller miljømessige stimuli. Like frem genetisk skjermer definerer mange utviklingsmessige og signalnettverk trasé, gi disse teknikkene en metodikk for å undersøke påvirkning av protein-basert arv i biologiske prosesser.
Introduction
Biologiske systemer opplever ofte forbigående svingninger i protein overflod. Om disse har en varig innvirkning på forme fenotypen av en organisme eller fremtidige generasjoner er fortsatt uklart. De mest kjente forekomstene av denne biologi innebære en sjelden klasse av proteiner, prioner, som styrer fremveksten av arvelige egenskaper uten Genova endringer. I stedet overføre disse proteinaceous og ifectious partikler fenotyper via selvtillit perpetuating endringer til protein konformasjon1,2. Denne typen arv ble oppdaget som forårsaker uvanlig arv mønstre av en ødeleggende neurodegenerative sykdom. Imidlertid har studier i organismer mellom sopp pattedyr3,4,5,6,7,8,9,10 siden avdekket at prion-liknende elementer kan gi adaptive verdi. Likevel har prioner vært betraktet som en fascinerende men sjelden biologiske særhet.
Denne rådende visdom holdes delvis fordi karakterisering av protein-basert arv har lenge vært begrenset av et lite sett med eksempler. Siste systematisk screening innsats har utvidet dette bildet betraktelig ved å identifisere flere nye bona fide prioner11 og nesten to dusin protein domener12 med kapasitet til drivstoff prion-lignende conformational konvertering. Men fordi disse har generelt fokuserer på sterk aminosyre sekvens biases, dele prioner som har blitt oppdaget biokjemiske egenskaper av grunnleggerne gjær prioner [PSI+]13,14, [URE3]15og [RNQ+]11,16. Disse inkluderer: 1) modulære domener som er rike på lenge polymere strekninger av asparagine (N) og glutamin (Q), 2) forsamlingen en amyloid [PRION+] konformasjon17,18,19, og 3) fullføre avhengigheten disaggregase Hsp104 funksjonen for trofast overføringen fra mor til datteren13,20,21. Faktisk mange bona fide prioner, inkludert [GAR+], [Het-s], og selv den opprinnelige prion (PrPSc), ville gå glipp under slike strenge kriterier. Kanskje enda viktigere, ville de kunne fange alle romanen mekanismer protein-basert arv22. Således kan ekte biologiske bredden av slike fenomener være langt mer vanlig i naturen enn tidligere antatt.
For å undersøke dette spørsmålet, var en høy gjennomstrømning og proteom hele strategi ansatt. Et kjennetegn på alle prioner, inkludert PrPSc, [GAR+], og [Het-s], er at det forbigående overuttrykte kausale proteiner sterkt øker frekvensen av prion oppkjøpet15,23,24,25,26. Vi tok nytte av denne funksjonen å systematisk stille, over hele gjær ORFeome, hvis stabil protein-basert, epigenetic stater kan startes ved å indusere transiently overuttrykte av personlige proteiner. Det er velkjent at protein overuttrykte kan endre fenotyper27. Men er prion proteiner uvanlig fordi deres midlertidig overproduksjon produserer en endring i fenotypen som er arvelig for mange hundre generasjoner etter den første overuttrykte. Vi har tidligere tok nytte av denne funksjonen, samt uvanlige arv mønstre av protein-basert genetiske elementer, identifisere dusinvis av proteiner som kan heritably nytt ledningsnett fenotypiske landskap uten å endre de genom28. Selv om noen identifisert var proteiner tidligere kjent som prioner, de fleste var ikke, understreker kraften i denne tilnærmingen å avdekke nye former for protein-basert arv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De første gjær prioner ble identifisert av deres uvanlig fenotyper og forvirrende mønstre av arv. Egenskapene til disse prioner ble deretter brukes til å lage algoritmer og beregningsorientert verktøy til skjermen for ekstra prion proteiner. Metoden beskrevet her, derimot er eksperimentell og stoler på forbigående overuttrykte opprette en varig endring-en stabil tilstand-kodet i protein conformation. Men hvis effektiviteten av "frø" prion montering av overuttrykte for en gitt protein er svært lav, vil at protein kontinuerlig fremstå som en falsk negativt i overuttrykte skjermer av denne typen. En slik endring å korrigere dette ville være å bruke en 2-mikron plasmider for protein overuttrykte i fremtiden eksperimenter. Endelig hver indusert prion har sin egen unike sett med vekst fenotyper og vil ikke være synlig i hver tilstand assayed. Dermed begrenser antall ulike forhold og doser testet antall treff.
Viktigere, gjenopprettes ikke alle typer protein-basert arv like ved hjelp av denne metoden. Proteiner som ikke kan være overexpressed effektivt eller uten toksisitet vil selvsagt bli kontinuerlig savnet. Mitotically ustabil elementer, for eksempel "mnemons," ville aldri overføres til døtre etter de første overuttrykte22. I kontrast, kan andre typer varige utløserstatusen brytere teoretisk bli indusert via forbigående overuttrykte42,43. Disse landene er imidlertid vanligvis ikke avhengig av protein homøostatisk maskiner eller overføres via "seeded" proteiner. I tillegg ville prioner som bruker andre chaperones (utenfor Hsp70 og Hsp104) eller ekstra riksvåpen protein homeostase nettverket for overføringen mislykkes Anstandsdame-avhengighet analyser beskrevet her. Til slutt, en lav overflod proteiner som også danne amyloid kan ha infectivity priser under grensen for påvisning i protein transformasjon oppsettet.
Denne protokollen beskriver en teknikk for inducing stabil protein-basert epigenetic stater via protein overuttrykte, samt ytterligere nedstrøms trinn for å validere om hver indusert epigenetic staten er en bona fide prion. Eksemplet i dette papiret, Psp1, er et eksempel på et protein som viser en "prion-like" aminosyre bias og kunne teoretisk gjenopprettes ved hjelp av tidligere utviklet bioinformatic algoritmer. Men russernes Psp1 til amyloid og uvanlig Anstandsdame forholdet (Hsp104) ville ha raskt diskvalifisert det fra videre analyser og dermed fjernet det fra prion vurdering. Men screening teknikker som presenteres i denne utredningen er agnostiker til dette og i stedet fokusere på underliggende mønstre av arv og tilstrekkelig protein alene for å overføre de tilsvarende fenotyper. Faktisk var det store flertallet av protein-basert arv med denne metoden uten N/Q-rik sekvens bias.
Denne metoden ble brukt til å undersøke hele gjær ORFeome for sin evne til å lokke fram protein-basert arv på en objektiv måte med bare et lite antall stressfaktorer (25 mM kadmium klorid, 1 mM kobolt klorid, 2 mM kobber sulfat, 1 mM diamide, 0.2 mM flukonazol, 50 mM hydroxyurea, 20 mM mangan klorid, 0,75 mM paraquat, 50 mM radicicol, 80 J/m2 UV-bestråling og 10 mM sinksulfat). Men kan denne tilnærmingen enkelt endres til skjermen genetisk nettverk eller bestemte mobilnettet svar i en mer målrettet måte. For eksempel funksjonelt relaterte proteiner eller alle proteiner regulert i kan et diskret signalnettverk nettverk indusert via forbigående overuttrykte og vist med stressfaktorer knyttet til deres biologisk funksjon. Derimot kan et større sett med proteiner bli vist med en mer omfattende rekke stressfaktorer undersøke om bestemte mobilnettet svar naturlig utviklet seg til Båtplass prion brytere. Til slutt, selv om vi har gjennomført disse studiene i gjær, mange aspekter av eksperimenter (f.eks forbigående protein uttrykk, Anstandsdame "herding", etc.) kan generaliseres til andre modellsystemer i fremtiden. For eksempel pattedyr vev kultur er mottakelig for overuttrykte via plasmider-baserte systemer og fluorescens foci kunne også brukes som en avlesning for arvelige selvtillit forsamlingen, som beskrevet tidligere28. Videre kan protein-koding sekvenser fra andre organismer, uttrykt i gjær og testet for deres evne til å lokke fram prion som arv med metodene som er beskrevet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She og Susan Lindquist for deres hjelp til å utvikle analyser brukt i dette dokumentet, i tillegg til korrekturleserne for sine gjennomtenkte kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
| Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
| 5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
| BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
| FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
| Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
| Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
| Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
| CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
| CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
| CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
| CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
| CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
| peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
| bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
| yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
| agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
| Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
| Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
| Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
| Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
| Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
| RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
| biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
| zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
| Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
| Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
| Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |
References
- Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).
- Byers, J. S., Jarosz, D. F. Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions. PLoS Pathog. 10 (4), 1003992 (2014).
- Jarosz, D. F., et al. Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism. Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).
- True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146 (3), 448-461 (2011).
- Cai, X., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
- Majumdar, A., et al. Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory. Cell. 148 (3), 515-529 (2012).
- Khan, M. R., et al. Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator. Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).
- Fioriti, L., et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).
- Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106 (2), 171-182 (2001).
- Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137 (1), 146-158 (2009).
- Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
- Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science. 273 (5275), 622-626 (1996).
- Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
- Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).
- Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).
- Glover, J. R., et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
- King, C. Y., et al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).
- Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation. Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).
- Caudron, F., Barral, Y. A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship. Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).
- Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta]. Methods. 39 (1), 3-8 (2006).
- Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).
- Brown, J. C., Lindquist, S. A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).
- Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).
- Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
- Chakrabortee, S., et al. Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits. Cell. 167 (2), 369-381 (2016).
- Hu, Y., et al. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).
- Swain, P. S., et al. Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes. Nat Commun. 7, 13766 (2016).
- Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425 (1992).
- Formosa, T., Nittis, T. Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).
- Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).
- Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition. Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. (17), (2008).
- Rogoza, T., et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).
- Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).
- Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).
- Tanaka, M., Weissman, J. S. An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).
- Roberts, B. T., Wickner, R. B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation. Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli. Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).
