Summary
Capture de la dopamine et de chromatographie liquide à haute performance représentent expérimentale des outils d’analyse pour étudier l’homéostasie de la dopamine chez les souris en évaluant la fonction de transporteur de la dopamine et les niveaux de dopamine dans le tissu du striatum, respectivement. Nous présentons des protocoles afin de mesurer la teneur en tissu dopamine et d’évaluer les fonctionnalités du transporteur de la dopamine.
Abstract
La dopamine (DA) est un neurotransmetteur modulatrice contrôlant l’activité motrice, les processus de récompense et les fonctions cognitives. Altération de la neurotransmission dopaminergique (DAergic) est fortement associée à plusieurs maladies associées au système nerveux central telles que la maladie de Parkinson, troubles de l’attention-hyperactivité et drogues toxicomanie1,2 ,3,4. Délimitant les mécanismes des maladies impliquant le déséquilibre DA critique repose sur des modèles animaux pour imiter les aspects des maladies et des protocoles qui permettent d’évaluer des parties spécifiques de l’homéostasie de la DA sont donc importants de proposer des idées nouvelles et thérapeutique possible cibles pour ces maladies.
Nous présentons ici deux protocoles expérimentaux utiles que lorsqu’il est combiné fournissent un affichage fonctionnel du système DAergic chez la souris. Les paramètres biochimiques et fonctionnelles sur l’homéostasie DA sont obtenus au moyen d’évaluation des niveaux de DA et de dopamine transporter (DAT) fonctionnalité5. Lors d’enquêtes sur le système de DA, la possibilité de mesurer de manière fiable des taux endogènes de DA du cerveau adulte est essentielle. Par conséquent, nous présentons comment effectuer la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) sur les tissus cérébraux de souris pour déterminer les niveaux de l’AA. Nous effectuons l’expérience sur le tissu du striatum dorsal (dStr) et le noyau accumbens (NAc), mais la méthode convient également pour d’autres zones du cerveau DA-innervés.
DAT est essentiel pour le recaptage de la DA dans la terminaison présynaptique, contrôlant ainsi l’activité spatiale et temporelle de l’AA publié. Connaître les niveaux et les fonctionnalités de DAT dans le striatum est d’une importance majeure lors de l’évaluation de l’homéostasie du DA. Ici, nous fournissons un protocole qui permet de déduire simultanément des informations sur les niveaux de surface et fonction à l’aide d’un test d’absorption de synaptosomes6 DA.
Les méthodes actuelles combinées avec des protocoles standard immunoblotting fournissent le chercheur avec des outils pertinents pour caractériser le système DAergic.
Introduction
La dopamine (DA) est un neurotransmetteur modulatrice critique pour comportement moteur, de récompense et de la fonction cognitive1,7,8,9. Les déséquilibres dans l’homéostasie de la DA sont impliqués dans plusieurs maladies neuropsychiatriques tels que le trouble d’hyperactivité avec déficit de l’attention, la toxicomanie, la dépression et la maladie de Parkinson,1. DA est libéré du neurone présynaptique dans la fente synaptique, où il se lie à et active les récepteurs sur la membrane pre- et post-synaptiques, véhiculant ainsi davantage le signal. Le niveau de DA dans la synapse, après que la libération est spatialement et temporellement contrôlée par DAT3,10. Le transporteur séquestre DA de l’espace extracellulaire et soutient donc physiologique DA niveaux3,11. Suppression génétique des DAT chez la souris provoque un phénotype hyperdopaminergique caractérisé par des niveaux élevés de DA synaptiques, épuisement des réserves intracellulaires de DA et des changements profonds en postsynaptique DAergic signalisation10,12.
Ici, deux protocoles distincts sont présentés, une méthode pour la teneur en tissu mesure DA et un autre pour évaluer la fonctionnalité de DAT. combiné avec le test de surface biotinylation décrit par Gabriel et coll.13 ces deux méthodes renseignent sur DA contenu et fonctionnelles niveaux de DAT pour une évaluation approfondie de l’homéostasie de la DA. Avec ces méthodes DA l’homéostasie des diverses souris transgéniques ou des modèles de maladies peut être caractérisé et décrit. Ces outils ont été mis en place et optimisés et sont utilisation standard dans nos laboratoires. Les tests actuellement ont servi à étudier les conséquences sur l’homéostasie DA pourrait modifier le C-terminal de DAT14 ou exprimant une recombinase Cre en vertu de la tyrosine hydroxylase (TH) promoteur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
les directives de l’inspection d’expérimentation animale danois (numéro d’autorisation : 2017-15-0201-01160) a été suivie et expériences effectuées dans un établissement entièrement AAALAC accrédité sous la supervision d’un bien-être animal local Comité.
1. absorption synaptosomes de Dopamine (méthode 1)
Remarque : ce protocole est pour évaluation parallèle de deux cerveaux, mais peut être utilisé avec succès pour effectuer des expériences d’absorption DA synaptosomes avec quatre cerveaux en parallèles.
- Préparations
- Label 48 mL 1,5 micro-centrifuge tubes par le tableau 1 (24 pour chaque cerveau). Utiliser des couleurs différentes pour les tubes appartenant à chaque cerveau pour éviter toute confusion entre les échantillons
- Label 51 scintillation tubes #1-51. Tamponnée au phosphate
- Place salin (PBS), sur la glace. Cela servira à garder les cerveaux réfrigérés.
- Mettre en marche la centrifugeuse pour laisser refroidir préalablement à 4 ° C.
- Peser les deux tubes de micro-centrifuge pour obtenir le poids exact de tissu lors de la préparation de la (section 2.6). Tampon
- Prepare homogénéisation en mélangeant 4 mM HEPES et 0,32 M de sucrose. Ajuster le pH à 7,4 et garder sur glace
NOTE : Tampon homogénéisation peut être gardé en aliquotes à-20 ° C et décongelé le jour de l’expérience.
Tampon d’absorption - Prepare en combinant ce qui suit : 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 5 mM 1 mM d’acide ascorbique (0,194 g/L), 5 mM D-glucose (0,991 g/L). Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH (entraîne une concentration en sodium d’environ 130 mM) et de garder sur glace
Remarque : Pour 2 cerveaux, préparer 1 500 mL de tampon de capture. Préparer le tampon d’absorption comme un 10 x solution mère sans l’acide ascorbique et du glucose conservés à 4 ° C. faire 1 x solution de travail fraîchement sur le jour, compléter avec l’acide ascorbique et du glucose. Ajuster le pH avec du NaOH à 7.4.
Tampon de capture - Prepare + ligand en combinant ce qui suit : 25 mM HEPES, NaCl, KCl, 5 mM à 120 mM 1,2 mM MgSO 4, l’acide ascorbique (0,194 g/L), 5 mM D-glucose (0,991 g/L) de 1 mM, 1,2 mM ACC l2, 1 μM pargyline, 100 désipramine nM, 10 nM Inhibiteur de la catéchol-O-méthyl-transférase (COMT). Ajuster le pH 7,4 avec NaOH et garder sur glace
Remarque : Utilisez 50 mL de tampon de capture et ajoutez ligand. Pargyline est ajouté pour aider à prévenir la dégradation de la DA par oxydation par le biais de la monoamine oxydase (MAO). Inhibiteur de la COMT (RO-41-0960) est ajouté à prévenir la dégradation de la DA (catécholamines en général) par le biais de COMT. Désipramine est ajoutée à inhibent l’absorption par les transporteurs de la noradrénaline et la sérotonine et ainsi rendre les résultats de l’absorption spécifique pour DAT.
Tampon de capture - Prepare + ligand + cocaïne en combinant ce qui suit : 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM d’acide ascorbique (0,194 g/L), D-glucose (0,991 g/L), de 5 mM à 5 mM 1 μM pargyline, 100 désipramine nM , 10 inhibiteur de la COMT nM, cocaïne 500 μM. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH et garder sur glace
Remarque : Utilisez 7 mL de tampon de capture + ligand et ajouter la cocaïne. Cocaïne est ajouté pour obtenir une mesure de fond d’absorption DA non-spécifique à soustraire des données, laissant seulement l’absorption spécifique DAT (car SERT et NET sont inhibées par la désipramine, tel que décrit ci-dessus). Alternativement, un inhibiteur de la DAT très puissant et spécifique GBR-12935, peut être utilisé à la place.
Important : Maintenir le tout sur la glace par la suite .
- La préparation
- sacrifier une souris à la fois par la dislocation cervicale et décapitation.
- Couper la peau à l’aide de ciseaux pour révéler le crâne et couper n’importe quel postérieur de l’excès de tissu de skull gauche de décapitation. Couper le crâne avec des petits ciseaux droites le long de la sutura sagittalis se terminant vers le haut que vers l’avant que possible.
- Placer les pointes de deux ciseaux dans chaque oeil de la souris et coupez à travers le crâne pour enlever le reste du crâne et du cerveau intact. Rapidement enlever le cerveau et le placer dans du PBS glacée. Cela permet de garder froid, tandis que le deuxième cerveau est disséqué.
- à l’aide d’une matrice de cerveau, disséquer une tranche de 3 mm coronale du striatum (antéro-postérieur : +1,5 mm à-1,50 mm) suivie d’une dissection plus fine avec un perforateur. Voir la Figure 1 pour punch domaine.
- Garder le tissu sur la glace à tout moment aller de l’avant.
- Transférer le tissu dans un tube à centrifuger-micro 1,5 mL pour le pesage.
Remarque : Ce poids sera utilisé à l’étape 1.2.14. - Répéter étape 1.2.1-1.2.6 pour le deuxième cerveau.
- Une fois que le poids a été obtenu pour les deux cerveaux, transférer le tissu dans un verre d’homogénéisation contenant 1 mL de tampon d’homogénéisation glacee.
- Homogénéiser le tissu à l’aide d’un pilon de moteur moteur à 800 tr/min, 10 coups même.
Remarque : Un seul coup soit égal à un et descendre de l’action, le premier coup doit être environ 5 s, le 3-4 s. homogénéisation dans un milieu isotonique est important pour éviter l’éclatement des synaptosomes 6 qui suit. En utilisant la force appropriée et milieu isotonique permettra les terminaisons présynaptiques reseal cytoplasme englobante, vésicules synaptiques, mitochondries et cytosquelette 15. - Transférer l’homogénat dans un tube à centrifuger-micro 1,5 mL et à percevoir l’homogénat restant le verre d’homogénéisation en rinçant avec 0,5 mL de tampon de l’homogénéisation supplémentaires.
- Conserver l’échantillon sur la glace tandis que le tissu de l’autre cerveau soit homogène. Les deux cerveaux s’exécuter en parallèle dans les étapes 1.2.12-1.2.13.
- Les noyaux de granule et débris de cellules par centrifugation (1 000 x g, 10 min, 4° C).
- Transférer le surnageant (S1) (contenant les membranes cellulaires et le cytoplasme) dans de nouveaux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et centrifuger à 16 000 x g pendant 20 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant (contenant du cytoplasme) et Resuspendre le culot (P2) (contenant des synaptosomes bruts) dans le tampon de l’homogénéisation 40 μL / mg de tissu (selon le poids obtenu à l’étape 1.2.6). Resuspendre doucement la fraction synaptosomale brute avec une pipette p1000 car trop de force se brisera les synaptosomes.
Remarque : Il est important de se retrouver avec au moins 280 μL. Si ce n’est pas le cas, diluer avec plus de 40 μL / mg sera nécessaire. 1.2.1-1.2.13 étapes doivent être effectuées aussi rapidement que possible et tout doit être gardé sur glace. Dès que les synaptosomes bruts ont été resuspendues dans le tampon de l’homogénéisation ils sont relativement stables, tant qu’ils sont tenus en glace 6 , 15 , 16.
2. Expérience de captation
- Ajouter 440 μl tampon de capture + ligand + cocaïne les désigné 12 tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et 440 tampon d’absorption μL + ligand pour les 36 autres tubes de microcentrifuge de 1,5 mL (voir le tableau 1 pour la mise en page).
Remarque : Les supprimer de glace 15 min avant le début de l’expérience à amener à température ambiante, mais gardez sur la glace jusqu'à puis conserver inhibiteurs. - Courbe de saturation Prepare (dopamine (2, 5, 6-[3H]-DA) (3 H dopamine) (91,1 Ci/mmol) à différentes concentrations finales (0,031 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 et 1,0 μM)).
- Qualifier de six tubes de microcentrifuge de 2 mL 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 et 0,31.
- Tampon de capture ajouter 750 μL + ligand pour les tubes de microcentrifuge 5 avec le nombre le plus bas.
- Tampon de capture 1,455.4 Ajouter μL + ligand, 14,6 μL la dopamine (1 mM), dopamine de 3 H 30 μl (11 μM) au tube marqué 10.
- Transfert 750 μl du tube marqué 10 au tube marqué 5. Bien mélanger et transférer 750 μL de ce tube dans le tube de 2,5. Répétez cette dilution avec les tubes restants.
- Rincez d’abord les filtres en microfibre de verre avec 4 mL de tampon de capture après leur mise sur un seau de 12 filtre bien.
- Ajouter 10 μL de la suspension de la membrane pour les 24 premières mL 1,5 micro-centrifuge tubes contenant tampon de μL 440 (voir tableau 1 pour la mise en page). Vortex avec soin et tournez en bas peu de temps pour s’assurer que les synaptosomes soient immergés dans la mémoire tampon. Sortir à 37 o C pendant 10 min.
Remarque : Il est important d’être précis sur les temps au cours de l’expérience de l’absorption d’une comparaison équitable entre le cerveau. Utiliser un chronomètre de précision. - Ajouter 50 μL de dopamine de concentration 10 et 5 μM (section 2.2) à la première deux colonnes et laisser à 37 o C pendant 5 min avec agitation. Après exactement 5 min, arrêter la réaction en ajoutant 1 mL de tampon de capture glacée. Faire la même chose avec concentration, 1,25 et 2,5 μM (section 2.2), puis avec concentration 0,62 et 0,31 μM.
- Ajouter les échantillons aux filtres rincés au préalable en microfibre et laver avec 5 x 4 mL de tampon de capture glacée. Lorsque les 12 premiers échantillons ont été ajoutés aux filtres, déplacer les filtres aux tubes de scintillation. Répétez cette opération avec les prochain 12 échantillons.
- Recommencez l’étape 2,4 à 2,6 pour le cerveau suivant.
- Max-comptage de préparer 3 tubes en plaçant un filtre en microfibre dans le bas des tubes de scintillation 49-51 et en ajoutant 25 µL de la concentration maximale de la dopamine sur le dessus (10 μM).
- Laisser tous les tubes de scintillation 51 sous une hotte pour 1 h.
- Ajouter 3 mL scintillation liquide sur chaque tube de scintillation et secouez vigoureusement sur un agitateur pendant 1 h.
- Comte [3 H]-DA dans un compteur-bêta pendant 1 min.
- , Ouvrez le programme et choisissez : Label : H-3, / filtre à plaques : flacon de 4 mL, 4 par 6, le type de test : Normal et compter le temps : 1 min.
Remarque : Cette étape peut être effectuée le lendemain, si il est plus commode. Laisser les échantillons recouverts de papier d’aluminium pendant la nuit.
- , Ouvrez le programme et choisissez : Label : H-3, / filtre à plaques : flacon de 4 mL, 4 par 6, le type de test : Normal et compter le temps : 1 min.
- Détermination des protéines
- utiliser un kit de dosage protéique BCA standard pour déterminer les concentrations de protéine des synaptosomes des adaptations de chefs d’accusation par minute (cpm) μg/min/fmol et pour comparaison appropriée d’absorption entre les échantillons.
3. Analyse des données
- utiliser les données provenant de l’absorption de l’expérience pour faire une saturation de la courbe pour chaque groupe et calculer le taux de la réaction (V la max) et la constante de Michaelis Menten (K, M).
Remarque : La valeur de K M reflète la concentration de substrat nécessaire pour atteindre la moitié du V max. Par conséquent, V max reflète directement la fonction de DAT (capacité d’absorption maximale), qui dépend du nombre de DAT sur la surface et comment son activité pourrait être modulée par des modifications post-traductionnelles et/ou protéines qui interagissent ainsi que sur changements des gradients ioniques. La valeur de K M est une mesure indirecte de l’affinité du substrat pour le transporteur qui, ce qui est important peut également être modulée par des modifications post-traductionnelles et/ou protéines qui interagissent. Pour évaluer pleinement les changements fonctionnels, il est donc important de déterminer directement les niveaux d’expression de surface par exemple un test de surface biotinylation. Une description du recaptage de la dopamine et une élaboration sur le sens des valeurs max K, M et V ont été revus par Schmitz et al. 17.
4. Chromatographie liquide haute performance (méthode 2)
- de la dissection du cerveau
- tubes de microcentrifuge Label et peser ; une par région et par la souris.
- Sacrifier une souris à la fois par la décapitation et la dislocation cervicale. Rapidement enlever le cerveau tel que décrit à la section 1.2. Lancer d’autres dissection immédiatement.
- à l’aide d’une matrice de cerveau, disséquer une tranche de 3 mm coronale du striatum suivie plus fine bilatérale dissection du CNA et dStr avec un perforateur. Voir la Figure 3 pour punch domaine.
- Transférer le tissu aux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et placer rapidement sur la glace sèche. Peser le tissu et le placer sur la glace sèche immédiatement.
Remarque : Le poids du tissu est important pour le calcul de la concentration par la suite.
4.1.1-4.1.4 - répéter les étapes avec la souris suivante.
NOTE : Placer le tissu en 80 o C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure ou de procéder immédiatement au traitement des tissus.
5. Préparation du tissu
- tour sur centrifugeuse afin qu’il puisse refroidir préalablement à 4 ° C de
- préparer la solution d’homogénéisation (0,1 N acide perchlorique (HClO 4)) et de garder sur la glace.
- Solution d’homogénéisation Using, préparer une norme frais 0,1 dopamine pmol/μL d’une solution mère de 1 mM (une dilution de 10 000 x).
Remarque : La solution étalon est préparée en dissolvant la dopamine dans le tampon d’homogénéisation à une concentration de stock de 1 mM, qui peuvent être conservé à 20 ° C pendant environ un mois. Si d’autres zones du cerveau sont d’intérêt, concentration de l’étalon devra être modifié, depuis d’autres régions du cerveau y compris prefrontral cortex, hippocampe, nigra de substantia et l’aire tegmentale ventrale possèdent jusqu'à 100 fois moins DA par rapport au striatum. - Ajouter 500 μL de solution homogénéisation à chaque échantillon (c'est-à-dire les tissus du CNA et dStr ; article 4.1) et homogénéiser les échantillons à l’aide d’un ultra-homogénéisateur à pleine vitesse pour environ 30 s. garder l’échantillon dans l’eau glacée pendant l’homogénéisation. Entre chaque échantillon, nettoyer l’homogénéisateur ultra avec de l’eau (pleine vitesse pendant 30 s).
- Centrifuger les échantillons pendant 30 min à 4 ° C, 14 000 x g. Échantillon de
- transfert environ 200 μL d’un filtre en verre 0,22 μm (1 cm de diamètre) à l’aide d’une seringue en plastique de 1 mL.
Remarque : L’utilisation de filtres en verre n’est pas important, tant que les filtres choisis sont 0,22 μm à éliminer les substances de poids moléculaire élevé. - Analyser des échantillons de détection électrochimique (EC)-HPLC méthodologie 18 tel que décrit à la section 6.
6. Analyse par chromatographie liquide de haute performance
solution- Prepare ce qui suit pour la phase mobile : acétate de Sodium 55 mM, sulfonate acide 1 mM, Na 2 EDTA 0,1 mM, acétonitrile 8 %, acide acétique 0,1 M, pH = 3.2.
Remarque : Ajuster le pH avec de l’acide acétique 0,1 M. Il est important d’être précis avec le pH. La solution devrait être degassed par le dégazeur en ligne (partie intégrante du système HPLC). Faire 2 L de la phase mobile et le changer une fois par mois (le changer quand le bruit est perceptible). En raison des fluctuations, cela prend environ 24h à régler après avoir changé la phase mobile. - Mise en place du détecteur :
- Set volts sortie à 700 mV et température de 32 ° C sur le four détecteur ; c’est très important. Faire un programme de gamme en utilisant le manuel en ligne. Voir le manuel pour plus de détails). Ajouter le programme de temps selon le tableau 2.
Remarque : Dans cette étude, le programme est prévu pour modifier automatiquement le courant au temps de rétention définie, pour garder la CLHP avec le courant optimal et de garder les pics du chromatogramme aussi grande que possible, mais toujours dans la vue. Cela a été optimisé pour striatale lysats de cerveau de souris.
- Set volts sortie à 700 mV et température de 32 ° C sur le four détecteur ; c’est très important. Faire un programme de gamme en utilisant le manuel en ligne. Voir le manuel pour plus de détails). Ajouter le programme de temps selon le tableau 2.
- Lorsque le programme a été ajouté au détecteur, faire une courbe d’étalonnage 3 points, soit en injectant la norme trois fois (5, 10 et 15 μL).
NOTE : Standard (10 μL (10 μL x 0,1 pmol/μl = 1 pmol DA)) doit être injecté chaque dixième échantillon et échantillons étalonné par rapport à la norme le plus proche. Fine tune le système la veille en ajustant la norme 3-point et en vérifiant si le chromatogramme sort dans les limites prévues. Si le bruit important est observé, changer la phase mobile. Si un pic est plus élevé que 990 mV puis ré-injecter l’échantillon dans un volume inférieur, ou faire un nouveau programme de gamme et une nouvelle courbe d’étalonnage. La limite de détection est mesurée comme 3 fois la valeur de bruit en mV à la plus faible valeur de crête injectée pour chaque norme (NA, DA, DOPAC, 5-HIAA, HVA, MT-3 et 5-HT).- Système de réglage en ouverture de la solution de la LC et en activant commence à 1 ; cette analyse en mode en ligne. Tapez l’ID utilisateur et mot de passe, puis cliquez sur OK. Attendez que la solution LC pour se connecter aux instruments. Aller à la table des lots, puis renseignez les informations de données (par exemple, le type d’échantillon : inconnu pour échantillons et std pour standard, type d’analyse : il QT, inj volume : 10, amt ISTD : niveau 1 con). Enregistrez le fichier (allez dans fichier - > enregistrer le fichier de commandes comme - > sauver).
- Que le système soit injecter l’échantillon premier en appuyant sur ' Batch Démarrer '. Cela se traduira par l’injection de l’échantillon de 10 μL de l’échantillonneur automatique avec un module de livraison solvant.
Remarque : Utiliser un débit de pompe de 0,15 mL/min et une colonne C18 à phase d’inversion. Ici, un détecteur ampérométrique de détection électrochimique a été utilisé. L’électrode de carbone vitreux doit être défini sur 0,8 V avec une électrode de référence Ag/AgCl. Afin de doser la dopamine, utiliser la chromatographie 3 µ ODS C18 (3) (DA 2 mm x 100 mm, particule taille 3 µm) qui permet la séparation chromatographique. - Extrait de la surface des pics enregistrés et calculée.
- Go pour l’acquisition de données pour suivre le chromatogramme lorsque les échantillons ont terminé. Allez dans Lc post exécuter une analyse - > choisit le nom de fichier (le chromatogramme ouvrira) - > cliquez sur Afficher. Dans la barre d’intégration manuelle, ajouter tous les pics intégrable - > aller au rapport de données et imprimer la lecture.
NOTE : Ici le logiciel solution de LC a été utilisé pour le contrôle de système et analyse de données.
- Go pour l’acquisition de données pour suivre le chromatogramme lorsque les échantillons ont terminé. Allez dans Lc post exécuter une analyse - > choisit le nom de fichier (le chromatogramme ouvrira) - > cliquez sur Afficher. Dans la barre d’intégration manuelle, ajouter tous les pics intégrable - > aller au rapport de données et imprimer la lecture.
- De la surface des pics, calculer la concentration de dopamine dans un échantillon, comme suit en utilisant la concentration de la norme :
- la surface du pic de l’étalon (correspond à 1 pmol) permet d’acquérir le facteur A.
- utilisation de facteur A pour obtenir la concentration des échantillons de.
Concentration de l’échantillon (en pmol par 10 μL) = facteur de A × surface du pic de l’échantillon - utiliser cette formule pour obtenir la concentration de l’échantillon dans ng.
Échantillon concentration pmol / 10 µL x 500 µL x MW de dopamine = concentration de l’échantillon en ng
échantillon concentration (en ng) = concentration de l’échantillon (en pmol par 10 μL) x 500 μL x MW de dopamine - utiliser la concentration de l’échantillon en ng pour obtenir t il l’échantillon concentration en pg/g de tissu (échantillon concentration en pg / g de tissu = pg/g de tissu).
- la surface du pic de l’étalon (correspond à 1 pmol) permet d’acquérir le facteur A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protocole d’absorption DA actuel (Figure 1) comprend toutes les étapes nécessaires pour évaluer les fonctionnalités de DAT synaptosomes de souris. Nos données représentatives de la méthode de captation de DA (Figure 2) représente une courbe de saturation avec données non désaisonnalisées (Figure 2 b) et données (Figure 2 a). La courbe de saturation montre absorption des souris de type sauvage. Habituellement, on ferait DA absorption pour la comparaison avec une souris mutante, qui conduirait à une courbe de saturation pour chaque génotype5. Dans ce cas, les différences entre le type sauvage et souris mutantes en 2 a et 2 b peuvent s’expliquer par plusieurs facteurs. Plus approfondie l’expérimentateur est en suite à chaque étape du protocole, au moins il y aura entre représentant brut (2 b) et protéine ajustée (2 a) données de différence. The Most raisons évidentes différences sont i) imprécis pesant du tissu à l’étape ii) perte de tissu 1.2.6, tout en transférant vers et à partir de verre homogénéisation dans l’étape 1.2.8-1.2.10 et iii) imprécision tout en transférant le surnageant à l’étape 1.2.13 et retrait de surnageant à l’étape 1.2.14. Nous recommandons de procéder à une expérience préliminaire chez les souris de type sauvage pour améliorer la précision.
La dopamine méthode HPLC-EC (Figure 3) comprend toutes les étapes nécessaires à la quantité d’ânes de DA dStr et CNA de souris. Nos données représentatives (Figure 4 et tableau 3) représentent le résultat d’une expérience effectuée sur des souris de type sauvage.
Figure 1 : workflow schématique illustrant les différentes étapes dans l’absorption de DA synaptosomes expérimenter protocole. La souris est sacrifiée par dislocation cervicale, suivie de la dissection du cerveau et le placement dans une matrice de cerveau. Une tranche coronale une épaisseur de 3 mm est disséquée par le cerveau, et dissection fine est effectuée par un coup de poing bilatéraux d’une petite zone immédiatement sous le corps calleux. Striatum dorsal est homogénéisé dans 1 mL de tampon de homogénéisation par rupture mécanique suivi par centrifugation à 10 min à basse vitesse. Surnageant est transférée dans un tube propre et centrifugé à haute vitesse pendant 20 min. Le culot, contenant les synaptosomes, est remis en suspension et prêt pour l’expérience de l’absorption. L’absorption s’effectue en ajoutant réanalysés des différentes [3H]-les concentrations de DA, allant d’une concentration finale de 0,031 à 1 μM. En outre, les diverses concentrations de tritiée DA sont ajoutées à un échantillon témoin contenant 500 cocaïne μM. Enfin, les échantillons sont comptés dans un compteur-bêta et analyse des données s’effectue en révélant la courbe de saturation de DAT. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : représentant les résultats d’une expérience d’absorption DA synaptosomes de quatre souris de type sauvage de C57Bl/6 d’une souche de souris Drd1a-cre. (A) les données représentatives représentant la courbe de saturation de DA l’absorption par le biais de la DAT des préparations de synaptosomes de souris de type sauvage (n = 4). Points noirs sont les valeurs des quatre souris indiqués séparément, que la courbe verte montre la façon dont les données seraient normalement être dépeint en combinant les données provenant de souris de 4 à 6 par groupe. Ce graphique combine les données de quatre souris. (B) le graphique de la saturation des données brutes, sans rajustement pour la concentration de protéines réelle des échantillons. Essentiellement, c’est la version non ajustée les données en données d’a. (C) contrôle. Ce graphique présente les comtes des échantillons contenant de cocaïne, qui servent à soustraire de fond à partir des données de capture. Ce contrôle est essentiel pour déterminer la fiabilité des données capture, mais est rarement montré dans les articles. Si ces données pour une raison quelconque ne montrent pas de linéarité, cela indique un problème sérieux avec la mise en place, qui doit être identifié et résolu pour déduire quoi que ce soit à partir des données. R au carré : n1 = 0.9852, n2 = 0.9584, n3 = 0.9606, n4 = 0.9913. (D) histogramme montrant la capacité d’absorption de DAT (VMAX). VMAX = 43,13 ± 3,2 fmol/min/μg de protéines). Les données apparaissent comme moyenne ± SEM. (E) histogramme représentant le KM pour DAT à 0,1 ± 0,03 μM, correspondant bien à la méthode de voltampérométrie disque tournant représentant les valeurs de KM de DAT à 0.6 μM19. Une valeur de KM de 0,1 μM correspond aussi bien aux valeurs KM de 0,22 μM qui ont été obtenues par des modèles de stimulation du trop-plein de DA stimulée dans le striatum20,21. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : flux de travail schématique illustrant les différentes étapes dans le protocole de chromatographie liquide à haute performance. La souris est sacrifiée par dislocation cervicale, suivie de la dissection du cerveau et le placement dans la matrice de cerveau. Une tranche coronale une épaisseur de 3 mm est disséquée par le cerveau, et la dissection fine est effectuée par poinçonnage bilatéralement deux zones plus petites, divisant le striatum de la dStr et le CNA. Le tissu est homogénéisé, suivie d’une centrifugation rapide. Un étalon ayant connu DA concentrations ainsi que des échantillons, les surnageants sont exécutés dans l’HPLC, produisant des chromatogrammes. Les surfaces des pics différents sont utilisés pour calculer la concentration de DA dans les échantillons dans un histogramme. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : résultats représentatifs d’une expérience de chromatographie liquide à haute performance. (A), HPLC chromatogramme de l’échantillon de 10 μL de dStr injecté à un C18 colonne (2 x 100 mm) utilisé pour les petites molécules. Temps de rétention ; 3,7 min de noradrénaline (NA), 6,7 min l’acide dihydroxyphénylacétique (DOPAC), 8,3 min pour DA, 10,7 min pour l’acide 5-hydroxyindolacétique (HIAA), 15,3 min pour l’acide homovanillique (HVA), 18,8 min pour 3-methoxytyamine (3-MT) et 20,8 min pour 5-hydroxtryptamine (5-HT). Seules les valeurs des pics DA sont calculées dans cette étude. (B) histogramme indiquant la concentration de DA en NAc et dStr basé sur chromatrogram. Analyse par CLHP de domaines striatale dStr et CNA de C57BL/6 mâles (n = 7). Les données sont présentées sous forme de moyenne± SEM. 
indique un changement dans la résistance et a été ajouté dans le chromatogramme manuellement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 + coc | 5 + coc | 2,5 + coc | 1.25 + coc | 0,62 + coc | 0,31 + coc |
Tableau 1 : Mise en page de tube de Microcentrifuge de la préparation.
| Temps | Gamme | Filtre | Vanne | Auto zéro | Compensé | Cellule E |
| 0 | 1NA | 0,5 Hz | charge | pas | 30 % | 0,7 V |
| 0,2 | 1NA | 0,5 Hz | charge | ensemble | 30 % | 0,7 V |
| 5 | 500pA | 0,5 Hz | charge | pas | 30 % | 0,7 V |
| 5.2 | 500pA | 0,5 Hz | charge | ensemble | 30 % | 0,7 V |
| 9.4 | 200pA | 0,5 Hz | charge | pas | 30 % | 0,7 V |
| 9.6 | 200pA | 0,5 Hz | charge | ensemble | 30 % | 0,7 V |
| 12 | 100Pa | 0,5 Hz | charge | pas | 30 % | 0,7 V |
| 12.2 | 100Pa | 0,5 Hz | charge | ensemble | 30 % | 0,7 V |
| 16.2 | 50pA | 0,5 Hz | charge | pas | 30 % | 0,7 V |
| 16,4 | 50pA | 0,5 Hz | charge | ensemble | 30 % | 0,7 V |
| Heure de fin 25 min | ||||||
Tableau 2 : Programme de temps HPLC utilisée dans cette étude.
| PIC # | Temps de RET. | Zone | Hauteur | % De la superficie | % De la hauteur |
| 1 | 3 745 | 230451 | 18500 | 0,299 | 0,626 |
| 2 | 6 691 | 5573485 | 382143 | 7 228 | 12 922 |
| 3 | 8 336 | 13209342 | 510378 | 17 131 | 17 258 |
| 4 | 10 760 | 16443198 | 831182 | 21 325 | 28 106 |
| 5 | 15 344 | 7129795 | 282473 | 9 247 | 9 552 |
| 6 | 18 830 | 11279424 | 346248 | 14 628 | 11 708 |
| 7 | 20 846 | 23241754 | 586419 | 30 142 | 19 829 |
| Total | 77107450 | 2957344 | 100 000 | 100 000 |
Tableau 3 : analyse de pointe montrant la zone et la hauteur des sommets différents utilisés pour calculer les concentrations montrées dans Figure 4 b .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce manuscrit décrit les protocoles expérimentaux utiles pour délimiter l’homéostasie DA dans n’importe quel modèle de souris de choix. Nous fournissons des protocoles détaillés pour mesurant les niveaux de DA dans le tissu de cerveau de souris HPLC et la captation de DA pour évaluer fonctionnelle DA transport par le biais de DAT. Les procédures, les protocoles et les limites pour l’expérience HPLC et dosage de captation synaptosomes DA seront précisés ci-dessous.
Le protocole de la captation peut fournir des observations utiles à la fonctionnalité de DAT. combiné avec une surface biotinylation experiment13, connaissances sur le montant total, niveau de la surface et fonctionnalité de DAT peuvent être obtenue. Étant donné le rôle majeur des DAT et son influence sur la transmission DA et sa participation dans diverses maladies, il a été des principaux objectifs d’établir des tests qui peuvent modéliser la fonction DAT. Un des avantages de l’expérience de captation DA synaptosomale est qu’il peut être post réalisée in vivo des manipulations comme sur chemogenetic manipulation comme bien aussi différents en vivo traitements médicamenteux ou comportemental formation en plus de enquêtes sur des souris génétiquement modifiées. Traitement de la toxicomanie peut être réalisée après la préparation, au lieu d' en vivo si vous préférez, ce qui permet de tester l’effet des drogues sur DAT directement22.
Lorsque vous exécutez la captation de DA, des solutions de rechange est d’effectuer des expériences d’absorption sur des cultures cellulaires DAT transfectée ou dans les cultures de neurones exprimant naturellement le transporteur. Essais de culture de cellules pourraient être préférés pour des enquêtes initiales sur différentes modifications de la DAT23, tandis que neuronales cultures primaires avec le transporteur endogène peuvent fournir une image plus physiologiquement fiable du transporteur function in vivo. Même si les cultures de neurones sont directement issus des animaux, il y a des avantages d’utiliser plutôt des synaptosomes. Les cultures de neurones sont généralement fabriqués à partir des neurones prénatales ou immatures, qui pourraient influer sur la fonction et l’expression de DAT, tandis que les préparations de synaptosomes représentent des préparations physiologiques qui peuvent être obtenues auprès des animaux adultes et même les vieux sans difficultés de6,14.
Il y a plusieurs avantages à utiliser l’expérience de la captation d’enquêter sur la fonction de DAT, mais les restrictions importantes sont à considérer. Les synaptosomes ont limité la viabilité6. Garder sur la glace est essentiel pour obtenir des résultats fiables avec de faibles variations. Si gardé sur glace et fourni des éléments nutritifs nécessaires, synaptosomes purifiées sont viables pendant des heures et prenez et libérer des neurotransmetteurs efficacement15. Il est possible de congeler des synaptosomes, mais la méthode de congélation est de grande importance15. Petites variations dans la procédure expérimentale peuvent entraîner des variations importantes dans les résultats. Par conséquent, les protocoles expérimentaux doivent être optimisés sur les conditions de type sauvage (p. ex. les souris de type sauvage) jusqu'à ce que vous obtiendrez des résultats reproductibles et ensuite les comparaisons peuvent être faites suite à diverses manipulations génétiques ou pharmacologiques. Dosage de captation synaptosomes DA est un outil expérimental simple, fiable et valide d’acquérir des données reproductibles avec une très faible variation dans un paramètre clé dans l’homéostasie des DA, des fonctionnalités DAT (Figure 2 a). Les limites sont largement compensés par les avantages d’être en mesure de réaliser l’expérience sur les terminaisons nerveuses préservé de souris adultes6.
Les méthodes actuellement utilisées pour analyser les niveaux de DA dans les tissus sont pris en charge par des méthodes histochimiques développés dans les années 1950. L’importance de développer des méthodes comme la CLHP pour mesurer les niveaux de la DA, a été évidente depuis la découverte de la diminution substantielle de DA dans les noyaux gris centraux des malades de Parkinson, fondant ainsi le principe du traitement de patients souffrant de la maladie de Parkinson avec24de L-DOPA. Depuis cette découverte, des techniques plus avancées pour l’analyse des tissus des niveaux DA ont été développés, mais comme avec toute autre technique il y a des pièges. Un des écueils majeurs de ces techniques est le caractère instable des monoamines (dopamine, noradrénaline et sérotonine). Comment se préparer correctement la préparation du tissu pour éviter la perte des monoamines a été examinée en détail par Atack et al. 25 et ne seront pas discutées plus loin dans cet article, sauf à souligner l’importance de placer le tissu sur la glace sèche directement après dissection et ne pas ajouter la solution d’homogénéisation que juste avant l’analyse CLHP. D’après notre expérience, tissus peuvent être conservé à-80 oC pendant jusqu'à un mois sans aucune dégradation de DA si aucune solution n’a été ajoutée. Atack et coll. discuter préparation du tissu pour les méthodes allant de la méthode spectrométrique de fluoro à des méthodes avancées de HPLC permettant une limite de détection jusqu'à 3 ng/mL de tissu25. La méthode que nous décrivons dans cet article est basée sur les mêmes principes. Actuelle des technologies de pointe permettent des analyses plus raffinée et la détection des niveaux DA fmol concentrations. En utilisant une technique HPLC fluorescente, analyse de monoamine encore plus robuste peut être obtenu26. En raison de la robustesse de la méthode, HPLC est largement utilisé pour obtenir des informations sur les changements dans les concentrations des monoamines et précurseurs et métabolites dans diverses régions du cerveau, comme DA dans le striatum, à valider les modèles de la maladie de Parkinson chez les souris, singes et minipigs27,28,29. Ici, nous avons réaliser l’expérience sur les tissus de la dStr et NAc, mais la méthode est également adaptée aux autres régions du cerveau DA-innervés, tels que le prefrontral cortex, l’hippocampe, le substantia nigra et l’aire tegmentale ventrale 30. Dans ces domaines, un échantillon standard plus dilué sera nécessaire pour la détermination correcte des niveaux DA. Notre analyse de la teneur en DA montrent des niveaux plus élevés dans le striatum sous-compartiments par rapport aux enquêtes précédentes, mais cela peut s’expliquer de façon expérimentale. Tout d’abord, nous avons disséqué les deux parties du striatum (CNA et dStr) plutôt que d’enquêter sur le striatum entier, ce qui pourrait expliquer la différence par rapport aux précédents rapports12,31. Mesures du striatum aura DA plus faibles par rapport aux mesures en pure dStr, étant donné que les niveaux dans le NAc sont substantiellement plus bas comparés à dStr. Nous avons également des études antérieures, confirmant notre DA niveau5.
Chaque test a ses limites. Essais sont mis au point dans le but de modéliser et de fournir des informations sur des aspects spécifiques d’un processus cellulaire, et qu’ils pourraient laisser de côté les détails importants possibles ou brosser un tableau trop généralisé le processus du monde réel. Une limitation importante à considérer en choisissant HPLC, est qu’il fournit seulement un aperçu des niveaux de neurotransmetteur. Toutefois, les niveaux de neurotransmetteur sont sujettes à fluctuer dans une journée, semaine ou mois32,33, qui met l’accent sur la nécessité d’obtenir des échantillons à une fenêtre de temps étroit, au lieu de comparer des échantillons prélevés en heures, jours ou mois d’intervalle comme même si elles ont été prises dans la même heure. Cependant, données HPLC peuvent fournir des informations utiles sur le contenu de la DA et révéler aberrantes niveaux modifiés tels que ceux témoignent la DAT-KO et les souris transgénique DAT-KD lignes, lorsque délétion génétique ou précipitation du DAT significativement influence DA homéostasie par perturbant le recaptage DA. Ces données furthermore démontrent que piscines DA striatale consistent principalement en DA séquestré plutôt que de-novo synthétisé DA et cette reconstitution des piscines DA striatale intracellulaire est gravement dépendante sur le recaptage processus12,34. Un écueil important à considérer est que la dissection des tissus pourrait limiter une description plus spécifique et plus précise du contenu dans une zone du cerveau DA à un moment donné. La variation de la concentration de DA dans certaines zones du cerveau différentes varie grandement. Par conséquent, la précision de la dissection est d’une grande importance, ce qui peut être améliorée en disséquant des zones plus petites afin de s’assurer seulement les tissus de la zone d’intérêt sont inclus.
Une mesure plus fonctionnelle des piscines DA endogènes peut être analysée à l’aide de la microdialyse. Cela a été développé et mis au point par Ungerstedt et al. à l’aide de la sonde de microdialyse verticale35. La technique de la microdialyse rend possible de mesurer les concentrations de monoamine dans le cerveau de déplacer librement les animaux et dans les structures cérébrales différentes. Un autre avantage de la technique de la microdialyse sur l’échantillonnage de tissus par HPLC est la possibilité de mesurer et de suivre l’évolution de la monoamine sur une grande fenêtre de temps. Il s’agit d’un avantage considérable par rapport au prélèvement d’échantillons de tissu cérébral où un seul point dans le temps est possible par animal comme dans le protocole de CLHP. Alors que, microdialyse peut donner un aperçu de la libération de DA, échantillonnage de tissus suivi par HPLC révélera plutôt changements dans les piscines endogènes et da vésiculaire Pour obtenir des informations en temps réel sur la cinétique de libération DA dans différentes zones du cerveau, méthodes comme le balayage rapide voltampérométrie cyclique36,37 ou chronoampérométrie à grande vitesse38 peut être mis en œuvre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l’UCPH 2016 programme d’Excellence (UG, A.R., K.J.), la Fondation de Lundbeck (M.R.) la Fondation Lundbeck Center for Biomembranes en nanomédecine (UG), le National Institute of santé subventions P01 DA 12408 (UG), le danois Conseil pour la recherche indépendante - Sciences médicales (UG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
References
- Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
- Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
- Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
- Hornykiewicz, O.
- Schultz, W.
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
- Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
- Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
- Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Whittaker, V. P.
- Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D.
- Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
- Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
- Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
- Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
- Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
- Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
- Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
- Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
- Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
- Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
- Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
- Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
- Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
- Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
- Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
- Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
- Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
- Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).
