Summary
Синаптосомальных допамина поглощения и жидкостной хроматографии высокой производительности представляют экспериментальные инструменты для анализа расследовать допамина гомеостаза у мышей путем оценки функции транспортер дофамина и уровни допамина в полосатой ткани, соответственно. Здесь мы представляем протоколы измерения содержания дофамина ткани и оценить функциональность транспортер дофамина.
Abstract
Допамин (DA) является модулирующее нейромедиатором контроль двигательной активности, вознаграждение процессы и когнитивные функции. Обесценение синапсах дофаминергической (DAergic) прочно ассоциируется с несколькими центральной нервной системы ассоциированных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, внимание дефицит гиперактивностью и зависимость от наркотиков1,2 ,3,4. Разграничение болезни механизмов с участием DA дисбаланс зависит критически животных моделей имитировать аспекты заболеваний, и таким образом протоколы, которые оценить конкретные части гомеостаза да важно предоставить новые идеи и возможности терапевтического цели для этих заболеваний.
Здесь, мы представляем две полезные экспериментальные протоколы что, при сочетании обеспечивают функциональные считывания DAergic системы у мышей. Биохимических и функциональных параметров гомеостаза да получаются путем оценки уровней да и допамина транспортера (DAT) функциональность5. При расследовании да системы, способность надежно измерять эндогенными уровнями да от взрослого мозга имеет важное значение. Таким образом мы представляем как для выполнения высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на ткани головного мозга от мышей для определения уровней DA. Мы проводим эксперимент на ткани от дорсальной стриатума (р) и прилежащем ядре (NAc), но метод подходит также для других областей DA-иннервируются мозга.
DAT имеет важное значение для reuptake Да в пресинаптическом терминал, таким образом контролируя временных и пространственных активность выпустила DA. Зная, уровни и функциональность DAT в стриатума имеет большое значение при оценке да гомеостаза. Здесь мы предоставляем протокол, который позволяет одновременно выводить информацию о поверхности земли и функции с помощью пробирного поглощение синаптосомальных6 да.
Нынешние методы в сочетании со стандартной immunoblotting протоколы обеспечивают исследователь с соответствующими инструментами для характеристики системы DAergic.
Introduction
Допамин (DA) является критической для моторное поведение, вознаграждение и когнитивные функции1,,78,9модулирующее нейромедиатором. Дисбаланс в DA гомеостаза причастны несколько нервно-психических заболеваний, как синдром дефицита внимания и гиперактивности, наркомания, депрессия и болезни Паркинсона1. Да освобождается от Пресинаптический нейрон в синаптическую щель, где он связывает и активирует рецепторы на предварительной и постсинаптической мембраны, тем самым дальнейшей передачи сигнала. Уровень Да в синапсе после выпуска пространственно и временно управляется DAT3,10. Транспортер секвестров да из внеклеточного пространства и таким образом поддерживает да физиологические уровни3,11. Генетическая удаление DAT в мышей вызывает дофамина фенотип характеризуется повышенными уровнями синаптических Да, истощения внутриклеточных да бассейнов и глубокие изменения в постсинаптической DAergic сигнализации10,12.
Здесь представлены два отдельных протоколов, один метод измерения да ткань содержание и другой, чтобы оценить функциональность DAT. совмещенное с поверхности biotinylation assay, описываемого Габриэль et al.13 эти два методы предоставляют информацию о да содержание и функциональные уровни DAT для тщательной оценки да гомеостаза. С помощью этих методов да гомеостаза различных трансгенных мышей или модели заболеванием можно охарактеризовать и описаны. Эти инструменты были реализованы и оптимизированы и стандартного использования в наших лабораториях. Текущие исследования служили исследовать последствия на DA гомеостаза изменяя C-терминал DAT14 или выражая Cre рекомбиназа под тирозин гидроксилазы (TH) промоутер 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
руководящие принципы датской инспекции экспериментов животных (разрешение номер: 2017-15-0201-01160) последовал и эксперименты в полностью АААЛЖ аккредитованных Фондом под наблюдением местных животных Комитет.
1. синаптосомальных поглощение дофамина (метод 1)
Примечание: этот протокол для параллельной оценки два мозга, но может успешно использоваться для выполнения синаптосомальных да поглощение эксперименты с четырьмя мозги в параллельные.
- Препараты
- этикетка 48 1,5 мл микро центрифуга трубы в таблице 1 (24 для каждого мозга). Используйте разные цвета для труб, принадлежащие каждой мозга для предотвращения путаницы между выборками
- Label 51 сцинтилляционные трубки #1-51.
- Место фосфат буфер солевой раствор (PBS) на льду. Это будет использоваться для держать мозг охлажденные.
- Повернуть на центрифуге для предварительно охладите до 4 ° с.
- Заранее взвесить два микро-пробирок получить точное ткани вес во время синаптосомальных подготовки (раздел 2.6).
- Подготовка гомогенизации буфер путем смешивания 4 мм HEPES и 0,32 М сахарозы. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 и держать на МКО.
Примечание: Гомогенизации буфер может храниться в аликвоты при-20 ° C и талой день эксперимента. - Подготовка поглощение буфера, объединяя следующих: 25 мм HEPES, 120-мм NaCl, 5 мм KCl, 1,2 мм CaCl 2, 1,2 мм MgSO 4, 1 мм аскорбиновой кислоты (0,194 г/Л), 5 мм D-глюкоза (0.991 г/Л). Скорректировать рН 7,4 с NaOH (приводит к концентрации натрия примерно 130-мм) и держать на льду
Примечание: Для 2 мозги, подготовьте 1500 мл поглощение буфера. Подготовить поглощение буфера как 10 x Стоковый раствор без аскорбиновой кислоты и глюкозы в 4 ° C. Make 1 x рабочий раствор свежего на день, дополняющего с аскорбиновой кислотой и глюкозой. Отрегулируйте пэ-аша с NaOH до 7,4. - Подготовка поглощение буфера + лиганд, объединяя следующие: 25 мм HEPES, 120-мм NaCl, 5 мм KCl, 1,2 мм CaC l2, 1,2 мм MgSO 4, 1 мм аскорбиновой кислоты (0,194 г/Л), 5 мм D-глюкоза (0.991 г/Л), 1 мкм pargyline, 100 Нм дезипрамин, 10 Нм Ингибиторы катехол-О-метил трансферазы (КОМТ). Отрегулируйте к пэ-ашу 7.4 с NaOH и держать на льду
Примечание: Используйте буфер поглощение 50 мл и добавить лиганда. Pargyline добавляется для предотвращения деградации да путем окисления через моноаминоксидазы (Мао). КОМТ ингибитора (RO-41-0960) добавляется к предотвращению деградации Да (катехоламинов в целом) через КОМТ. Тормозят поглощение через транспортеры норадреналина и серотонина и тем самым сделать поглощения результатов конкретный для DAT. добавляется дезипрамин - Подготовка поглощение буфера + лигандом + кокаина, объединяя следующие: 25 мм HEPES, 120-мм NaCl, 5 мм KCl, 1,2 мм CaCl 2, 1,2 мм MgSO 4, 1 мм аскорбиновой кислоты (0,194 г/Л), 5 мм D-глюкоза (0.991 г/Л), 1 pargyline мкм, 100 Нм дезипрамин , 10 Нм КОМТ ингибитор, 500 мкм кокаина. Скорректировать рН 7,4 с NaOH и держать на льду
Примечание: Используйте буфер поглощения 7 мл + лиганда и добавить кокаина. Кокаин добавляется фон измерения поглощения да неспецифические для вычитания из данных, оставив только DAT-конкретных поглощение (поскольку SERT и NET являются тормозится дезипрамин, как описано выше). Кроме того, очень мощным и конкретных DAT ингибитор GBR-12935, вместо него может использоваться.
Важно: Не все на льду отныне .
- Синаптосомальных подготовка
- пожертвовать одной мыши одновременно шейки матки вывихов и обезглавливание.
- Вырезать кожу с помощью ножниц выявить черепа и отрезать любой избыток тканей кзади череп слева от обезглавливание. Вырезать черепа с небольшой прямые ножницы вдоль sutura sagittalis заканчивается максимально кпереди.
- Советы двух ножниц в каждый глаз мыши и прорваться через череп, чтобы удалить оставшуюся часть черепа и мозга нетронутыми. Быстро удалить мозга и поместите его в ледяной PBS. Это будет держать холодной, а второй мозг тренированное.
- С помощью матрицы мозга, вскрыть 3 мм корональных ломтик стриатума (передний задний: 1,5 мм -1,5 мм) следуют тонкие диссекции с нокаутером. Смотрите Рисунок 1 для зоны Панч.
- Держите ткани на льду на все времена движение вперед.
- Передавать микро пластиковых пробирок 1.5 мл для взвешивания ткани.
Примечание: Этот вес будет использоваться на шаге 1.2.14. - 1.2.1-1.2.6 повторить шаг второй мозг.
- После того, как вес был получен для обоих мозги, передачи ткани для гомогенизации стекла, содержащие 1 мл ледяной гомогенизации буфера.
- Гомогенизировать ткани с помощью мотор приводом пестиком в 800 об/мин, 10 даже ударов.
Примечание: Один ход равно одно вверх и вниз действий, первого удара должна быть около 5 сек, следующие 3-4 s. гомогенизации в изотонический среде имеет важное значение для предотвращения разрыва синаптосомах 6. С помощью соответствующих сил и изотонический среднего позволит Пресинаптический терминалы для запечатывания включающего цитоплазмы, синаптических пузырьков, митохондрии и Цитоскелет 15. - Передавать микро пластиковых пробирок 1.5 мл огневки и собирать оставшихся огневки из стекла гомогенизации, полоскание с 0,5 мл дополнительные гомогенизации буфера.
- Держите образец на льду во время гомогенизированные ткани от головного мозга. Параллельно два мозги в шаги 1.2.12-1.2.13.
- Гранулы ядер и клеточной мусора путем центрифугирования (1000 x g, 10 мин, 4° C).
- Передавать новый 1,5 мл пробирок microcentrifuge супернатант (S1) (содержащие клеточных мембран и цитоплазмы) и центрифуги на 16000 x g 20 мин на 4 ° C.
- Удалить супернатант (содержащих цитоплазму) и Ресуспензируйте Пелле (P2) (содержащие сырой синаптосомах) в 40 мкл буфера гомогенизации / мг ткани (на основании веса, полученного на шаге 1.2.6). Нежно ресуспензируйте сырой синаптосомальных дроби с пипеткой p1000, как слишком много сил будет разорвать синаптосомах.
Примечание: Важно, чтобы в конечном итоге с по крайней мере 280 мкл. Если нет, то необходимо будет разбавления с более чем 40 мкл на мг. 1.2.1-1.2.13 шаги должны быть выполнены как можно быстрее, и все должно храниться на льду. Как только сырая синаптосомах были высокомобильна в буфере гомогенизации они являются довольно стабильными, пока они хранятся на льду 6 , , 15 16.
2. Поглощение эксперимент
- Добавить 440 мкл буфера поглощение + лиганд + кокаина в 440 мкл буфера поглощения и назначенный 12 труб microcentrifuge 1,5 мл + лигандом для 36, оставшиеся 1,5 мл microcentrifuge трубы (см. таблицу 1 для макета).
Примечание: Удалите их из льда 15 мин до начала эксперимента по довести их до комнатной температуры, но держать на льду пока, то для сохранения ингибиторов. - Подготовить кривой насыщения (Допамин (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H допамина) (91.1 Ci/ммоль) в различных концентрациях окончательный (0,031, 0.0625, 0,125, 0,25, 0,5 и 1,0 мкм)).
- Ярлык шесть 2 мл microcentrifuge трубы 10, 5, 2.5, 1.25, 0,62 и 0.31.
- Добавить 750 мкл буфера поглощение + лиганд в 5 microcentrifuge труб с наименьшим номером.
- Добавить 1,455.4 мкл буфера поглощение + лиганд, 14,6 мкл допамина (1 мм), 30 мкл 3-H допамина (11 мкм) трубки помечены 10.
- Передачи 750 мкл из трубки помечены 10 на трубу, помечены 5. Хорошо перемешайте и передать 2,5 труба 750 мкл от этой трубки. Повторите этот разрежения с оставшейся трубы.
- Предварительной промывки фильтры из микрофибры стекла с 4 мл поглощение буфера после размещения их на ведро 12 хорошо фильтр.
- Добавить 10 мкл суспензии синаптосомальных мембран в первые 24 1,5 мл микро центрифуга трубки (см. таблицу 1 для макета) содержащий 440 мкл буфера. Вихревой тщательно и спин вниз вскоре обеспечить что синаптосомах погружали в буфере. Оставить на 37 o C на 10 мин
Примечание: Важно быть точным на раз в ходе эксперимента поглощение за справедливое сравнение между мозгом. Использовать секундомер для точности. - Добавьте 50 мкл допамина концентрация 10 и 5 мкм (раздел 2.2) первые две колонки и отпуск на 37 o C на 5 мин при встряхивании. После ровно 5 мин остановите реакции, добавив 1 мл ледяной поглощение буфера. Сделайте то же самое с концентрацией 2.5 и 1,25 мкм (раздел 2.2), а затем с концентрацией 0,62 и 0,31 мкм.
- Добавить образцы фильтры предварительно промыть из микрофибры и мыть с 5 x 4 мл ледяной поглощение буфера. Когда первые 12 образцов были добавлены фильтры, переместить фильтры сцинтилляционные трубы. Повторите это с следующие 12 образцов.
- Повторить шаг 2.4-2.6 для следующего мозга.
- Подготовить 3 Макс подсчет трубки, поместив микрофибры фильтр в нижней части трубы сцинтилляционные 49-51 и добавив 25 мкл максимальная допамина концентрации на вершине (10 мкм).
- Оставьте все 51 сцинтилляционные, трубы Зонта на 1 ч.
- Добавить 3 мл сцинтилляционные жидкости к каждому сцинтилляционные трубки и трясти энергичные на шейкер на 1 ч.
- Игр [3 H]-Да в бета счетчик на 1 мин
- Откройте программу и выберите: Метки: H-3, плита/фильтр: 4 мл во флаконе, 4, 6, Assay типа: нормальный и подсчета времени: 1 мин
Примечание: Этот шаг может выполняться следующий день если более удобным. Образцы, покрыты фольгой на ночь оставить.
- Откройте программу и выберите: Метки: H-3, плита/фильтр: 4 мл во флаконе, 4, 6, Assay типа: нормальный и подсчета времени: 1 мин
- Определение белка
- использовать стандартный набор BCA Assay протеина для определения концентрации белка синаптосомах для корректировки с сиг / мин (cpm) фмоль/мин/мкг и для правильного сравнения поглощения между выборками.
3. Анализ данных
- использования данных от поглощения эксперимент сделать насыщенность кривой для каждой группы и рассчитать скорость реакции (V max) и константа Михаэлиса Menten (M K).
Примечание: Значение K M отражает концентрации субстрата, необходимые для достижения половина V Макс. Соответственно, V Макс непосредственно отражает функции DAT (максимальную емкость поглощения), который зависит от количества DAT на поверхности и как может модулировать свою деятельность Посттрансляционная модификаций и/или взаимодействия белков, а также на изменения в Ион градиентов. Значение K M является косвенным показателем сходства субстрат для транспортера, важно также может модулировать Посттрансляционная модификаций и/или взаимодействия белков. Чтобы полностью оценить функциональные изменения Поэтому важно непосредственно определить уровни поверхности выражения, например поверхности biotinylation assay. Описание reuptake допамина и разработка на смысл K М и V максимальные значения были рассмотрены Schmitz et al. 17.
4. Высокая производительность жидкостной хроматографии (метод 2)
- мозга рассечение
- Label и весят microcentrifuge трубы; один на каждый регион на мышь.
- Пожертвовать одной мыши одновременно шейки матки вывихов и обезглавливание. Быстро удалите мозга, как описано в разделе 1.2. Сразу выполнить далее диссекции.
- С помощью матрицы мозга, вскрыть 3 мм корональных ломтик стриатума следуют тонкие двусторонние рассечение NAc и р-н с нокаутером. Смотрите Рисунок 3 области Панч.
- Передача ткани для 1.5 мл пробирок microcentrifuge и быстро на сухой лед. Вес ткани и поместите его обратно на сухой лед немедленно.
Примечание: Вес ткани имеет важное значение для расчета концентрации позже.
4.1.1-4.1.4 - повторите шаги с следующим мыши.
Примечание: Место ткани на 80 o C до дальнейшей обработки или немедленно приступить к обработке ткани.
5. Подготовка тканей
- поворот на центрифугу, чтобы дать ему остыть до 4 ° C в предварительно
- подготовить решение гомогенизации (0,1 N хлорной кислоты (4 HClO)) и держать на ДВС.
- Использование гомогенизации решения, готовить свежие 0.1 пмоль/мкл допамина стандарт от 1 мм раствор (10000 x разрежения).
Примечание: Стоковый раствор готовится путем растворения допамина в буфере гомогенизации запасов концентрацию 1 мм, который может храниться при температуре 20 ° C около одного месяца. Если интерес представляют других областях мозга, концентрация стандарта будет должны быть изменены, поскольку других областях мозга, включая prefrontral коры, гиппокамп, substantia nigra и брюшной вентральная область обладают до 100 раз меньше да, по сравнению с стриатума. - Добавить 500 мкл гомогенизации решение для каждой выборки (т.е. NAc и г ткани; раздел 4.1) и гомогенизации образцы с использованием ультра гомогенизатор на полной скорости для приблизительно 30 s. держать образец в ледяной воде во время гомогенизации. Между каждой выборки, очистить ultra гомогенизатор с водой (полная скорость 30 s).
- Центрифугуйте образцы на 30 мин при 4 ° C, 14.000 x g.
- Передачи примерно 200 мкл пример стекла 0,22 мкм фильтр (1 см в диаметре), используя пластиковый шприц 1 мл.
Примечание: Использование стеклянных фильтров является не важных, поскольку фильтры выбрали 0,22 мкм для удаления высокомолекулярных веществ. - Анализ образцов, электро химической Обнаружение (EC)-ВЭЖХ методологии 18 как описано в разделе 6.
6. Анализ жидкостей хроматографии высокой производительности
- подготовить следующие решения для мобильных фазы: ацетат натрия сульфатоктановая кислота Na 2 ЭДТА 0,1 мм, Ацетонитрил 8%, уксусная кислота 0,1 М, 1 мм, 55 мм pH = 3.2.
Примечание: Настройки рН 0,1 М уксусной кислотой. Важно быть точным с рН. Раствор должен быть degassed на он-лайн дегазатор (составной частью ВЭЖХ системы). Сделать 2 Л мобильных фазы и менять его примерно раз в месяц (изменить его, когда шум становится заметным). Из-за колебаний он принимает около 24 ч для регулировки после изменения этапа мобильных. - Настройки детектора:
- набор Вольт выход до 700 мВ и температура 32 ° C на детектор печи, это очень важно. Сделайте программу диапазон, используя онлайн руководство. Смотрите в руководстве для более подробной информации). Добавить время программы согласно таблице 2.
Примечание: В этом исследовании, программа устанавливается автоматически изменить текущий набор удержания время, держать ВЭЖХ на оптимальный ток и держать на вершины Хроматограмма как расширен как можно скорее, но по-прежнему в представлении. Это был оптимизирован для полосатой мозга лизатов от мышей.
- набор Вольт выход до 700 мВ и температура 32 ° C на детектор печи, это очень важно. Сделайте программу диапазон, используя онлайн руководство. Смотрите в руководстве для более подробной информации). Добавить время программы согласно таблице 2.
- Когда программы добавлен детектор, сделать 3 точки калибровочной кривой, вводя стандарт три раза (5, 10 и 15 мкл).
Примечание: Стандарт (10 мкл (10 мкл x 0.1 пмоль/мкл = 1 пмоль DA)) следует вводить каждый десятый образца и образцы, калиброванные в ближайший стандарт. Штрафа настройки системы предыдущий день, регулируя стандарт 3-точка и проверки, если Хроматограмма выходит в ожидаемый диапазон. Если наблюдается значительный шум, измените мобильные фазы. Если пик выше, чем 990 mV, то снова залить образца в низкой громкости, или сделать новую программу диапазон и новой стандартной кривой. Предел обнаружения измеряется как 3 раза значение шума в МВ до низкого пикового значения, вводят для каждого стандарта (NA, DOPAC, да, 5-HIAA, с высокой добавленной стоимостью, 3-м и 5-HT).- Установка системы, открыв LC решения и активация начинается 1; Этот анализ в режиме онлайн. Введите идентификатор пользователя и пароль и нажмите кнопку ОК. Ожидание для LC решения для подключения к документам. Перейти к пакетной таблицы и заполнения данных (например, образец типа: неизвестных образцов и std для стандартных, анализ типа: он QT, объем inj: 10, ISTD amt: уровень 1 кон). Сохранить файл (перейдите к файл - > сохранить пакетный файл как - > спасти).
- Сделать систему ввести первый образец, нажав ' Начало Пакетная '. Это приведет к инъекций 10 мкл пример Автоматический пробоотборник с модулем растворителя доставки.
Примечание: Используйте насос расхода 0,15 мл/мин и C18 столбца с разворота фазы. Здесь был использован Амперометрическое детектор для электрохимических обнаружения. Электрод стеклоуглерода должно быть присвоено 0,8 V с Ag/AgCl электродов ссылки. С целью анализа допамина, использовать хроматографии 3 мкг ОРВ (3) C18 (DA 2 мм x 100 мм, частиц размером 3 мкм) для достижения хроматографического разделения. - Экстракт пик зарегистрированных и расчетных областей.
- Перейти к сбора данных следовать Хроматограмма, когда образцы закончили. Перейти к Lc, после выполнения анализа - > выбрал имя файла (Хроматограмма откроет) - > нажмите кнопку Просмотр. На панели ручной интеграции, добавьте все вершины быть интегрированы - > идти для данных отчета и распечатать чтения.
Примечание: Здесь программное решение LC был использован для данных анализа и системы управления.
- Перейти к сбора данных следовать Хроматограмма, когда образцы закончили. Перейти к Lc, после выполнения анализа - > выбрал имя файла (Хроматограмма откроет) - > нажмите кнопку Просмотр. На панели ручной интеграции, добавьте все вершины быть интегрированы - > идти для данных отчета и распечатать чтения.
- Из районов, пик, рассчитать концентрацию дофамина в образце, следующим с помощью известной концентрации стандарта:
- использовать площади пика стандарта (равен 1 пмоль) для получения фактор а.
- использовать фактор для получения образцами концентрации.
Концентрация образца (в пмоль 10 мкл) = коэффициент A × площади пика образца - использовать эту формулу для получения образца концентрация нг.
Пример концентрации пмоль / 10 мкл x 500 мкл x МВт допамина = концентрация образца в нг
образец концентрация (в НГ) = концентрация образца (в пмоль 10 мкл) x 500 мкл x МВт допамина - использовать образец концентрация в НГ, чтобы получить t Он образец концентрация в тканях ПГ/г (образец концентрации ПГ / ткань g = ткани ПГ/г).
- использовать площади пика стандарта (равен 1 пмоль) для получения фактор а.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Текущий протокол да поглощения (рис. 1) включает в себя все шаги, необходимые для оценки функции DAT в синаптосомах от мышей. Наши репрезентативных данных метода поглощения DA (рис. 2) изображает кривой насыщения с нескорректированных данных (рис. 2B) и скорректировать данные (рисунок 2A). Насыщенность кривая показывает поглощения от мышей дикого типа. Обычно один бы да поглощения для сравнения с мутант мыши, которая приведет к кривой насыщения для каждого генотипа5. В этом случае различия между дикого типа и мутантов мышей в 2A и 2B можно объяснить несколькими факторами. Более тщательное экспериментатор — после каждого шага протокола, меньше разница между изображением сырья (2B) и белок скорректирована (2A) данных будет. The Most очевидные причины различий i) неточный весом ткани в шаге 1.2.6, ii) потеря ткани во время передачи и из стекла гомогенизации в шаг 1.2.8-1.2.10 и iii) неточность при передаче супернатант в шаге 1.2.13 и Удаление супернатант в шаге 1.2.14. Рекомендуется выполнять предварительную эксперимента мышей дикого типа для улучшения точности.
Допамин EC-ВЭЖХ метод (рис. 3) включает в себя все шаги, необходимые для ослов количество Да в г и NAc мышей. Наши репрезентативных данных (рис. 4 и Таблица 3) изображают итоги эксперимента на мышей дикого типа.
Рисунок 1: схема рабочего процесса, изображающие различные шаги в освоении синаптосомальных да эксперимент протокол. Мышь приносится в жертву шейки матки дислокации, следуют мозга диссекции и размещение в матрице мозга. 3 мм толщиной корональных ломтик рассекается от головного мозга, и тонкой диссекция производится удар двусторонних небольшой площади сразу под мозолистого. Дорсальная стриатума гомогенизации в 1 мл гомогенизации буфера путем механического нарушения, следуют 10 мин центрифугированием при низкой скорости. Супернатант передан чистой трубки и центрифугируется на высокой скорости на 20 мин. Гранулы, содержащие синаптосомах, ресуспензированы и готов для поглощения эксперимента. Поглощение выполняется путем добавления triplicates разные [3H]-Да концентрациях от конечной концентрации 0,031 до 1 мкм. Кроме того различной концентрации третируют да добавляются в примере элемента управления, содержащий 500 мкм кокаина. И наконец, образцы учитываются в бета счетчик и проводится анализ данных, выявление кривой насыщения DAT. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель результаты от синаптосомальных эксперимент поглощение да четыре дикого типа мышей C57Bl/6 от штамма мыши Drd1a-cre. (A) репрезентативных данных с изображением кривой насыщения да поглощения через DAT синаптосомальных препаратов из дикого типа мыши (n = 4). Черные точки являются значения четырех мышей, показаны отдельно, зеленая кривая показывает, как данные будут быть изображен обычно путем объединения данных из 4-6 мышей на группу. Этот график объединяет данные из четырех мышей. (B) насыщенность граф необработанных данных, без регулировки для фактической белка концентрацию образцов. По сути это нескорректированные версия данных в данные а. (C) элемента управления. Этот график показывает отсчеты от кокаина содержащих образцов, которые используются для вычитание фона от поглощения данных. Этот элемент управления имеет существенно важное значение для определения надежности данных поглощения, но редко показано в статьях. Если эти данные по некоторым причинам не линейности, он указывает на критическую проблему с настройки, которая должна быть определены и решены вывести что-нибудь от данных. R в квадрате: n1 = 0.9852, n2 = 0.9584, n3 = 0.9606, n4 = 0.9913. (D) гистограммы показаны емкость поглощения DAT (MAXV). VMAX = 43.13 ± 3,2 фмоль/мин/мкг белка). Данные отображаются в виде среднее ± SEM. (E) Гистограмма показывает KM для DAT быть 0,1 мкм ± 0,03, хорошо соответствует метод вольтамперометрии вращающегося диска, изображающие значения KM DAT быть 0,6 мкм19. Значения KM 0,22 мкм, которые были получены путем стимуляции моделей стимулировало да переполнения в20,стриатума21также хорошо соответствует значение KM 0,1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: схема рабочего процесса, изображающие различные шаги в протоколе высокопроизводительных жидкостная хроматография. Мышь приносится в жертву шейки матки дислокации, следуют мозга диссекции и размещения в матрице мозга. 3 мм толщиной корональных ломтик рассекается от головного мозга, и тонкой диссекция производится штамповкой два небольших районов, разделив стриатума г и САС на двусторонней основе. Гомогенизированные ткани, а затем быстро центрифугированием. Стандарт с известным да концентрации, а также supernatants образцов запускаются в ВЭЖХ, производство хроматограммы. Области различные вершины используются для расчета концентрации Да в образцах, изображенные в гистограмму. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель результаты эксперимента высокопроизводительных жидкостная хроматография. (A) ВЭЖХ Хроматограмма 10 мкл пример от р-н вводят C18 (2 x 100 мм) столбец, используемый для малых молекул. Время удержания; 3.7 мин норадреналин (NA), 6.7 мин для dihydroxyphenylacetic кислоты (DOPAC), 8,3 мин для DA, 10,7 мин для 5-hydroxyindoleacetic кислоты (HIAA), 15,3 мин для Гомованилиновая кислоты (HVA), 18,8 мин для 3-methoxytyamine (3-MT) и 20,8 мин для 5-hydroxtryptamine (5-HT). В этом исследовании вычисляются только значения Да пиков. (B) гистограммы показаны концентрации Да в NAc и г-на chromatrogram основе. ВЭЖХ анализ полосатой областей, включая р и мышей C57BL/6 НАК (n = 7). Данные отображаются как среднее± SEM. 
указывает на изменение сопротивления и был добавлен к Хроматограмма вручную. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 + coc | 5 + coc | 2.5 + coc | 1.25 + coc | 0,62 + coc | 0,31 + coc |
Таблица 1: Microcentrifuge трубки макет для синаптосомальных подготовки.
| Время | Диапазон | Фильтр | Клапан | Авто нуля | Смещение | E ячейки |
| 0 | 1nA | 0.5 Гц | загрузить | не | 30% | 0.7 V |
| 0.2 | 1nA | 0.5 Гц | загрузить | набор | 30% | 0.7 V |
| 5 | 500pA | 0.5 Гц | загрузить | не | 30% | 0.7 V |
| 5.2 | 500pA | 0.5 Гц | загрузить | набор | 30% | 0.7 V |
| 9.4 | 200pA | 0.5 Гц | загрузить | не | 30% | 0.7 V |
| 9.6 | 200pA | 0.5 Гц | загрузить | набор | 30% | 0.7 V |
| 12 | 100pA | 0.5 Гц | загрузить | не | 30% | 0.7 V |
| 12.2 | 100pA | 0.5 Гц | загрузить | набор | 30% | 0.7 V |
| 16.2 | 50pA | 0.5 Гц | загрузить | не | 30% | 0.7 V |
| 16.4 | 50pA | 0.5 Гц | загрузить | набор | 30% | 0.7 V |
| Конец времени 25 мин | ||||||
Таблица 2: ВЭЖХ время программы, используемые в данном исследовании.
| Пик # | Время в отставке | Площадь | Высота | Площадь % | Высота % |
| 1 | 3745 человек | 230451 | 18500 | 0.299 | 0.626 |
| 2 | 6,691 | 5573485 | 382143 | 7,228 | 12,922 |
| 3 | 8,336 | 13209342 | 510378 | 17,131 | 17,258 |
| 4 | 10.760 | 16443198 | 831182 | 21,325 | 28,106 |
| 5 | 15,344 | 7129795 | 282473 | 9,247 | 9,552 |
| 6 | 18,830 | 11279424 | 346248 | 14,628 | 11,708 |
| 7 | 20,846 | 23241754 | 586419 | 30,142 | 19,829 |
| Итого | 77107450 | 2957344 | 100 000 | 100 000 |
Таблица 3: пик анализ, показывающий площадь и высота различных вершин, используемых для расчета концентраций в Рисунок 4B .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта рукопись описывает полезными экспериментальные протоколы разграничить да гомеостаза в любой мыши модели выбора. Мы предоставляем подробные протоколы для измерения уровней Да в ткани мозга от мышей с помощью ВЭЖХ и синаптосомальных да поглощения для оценки функциональных да транспорта через DAT. Ниже будут разработаны процедуры, протоколы и ограничения для ВЭЖХ эксперимент и синаптосомальных да поглощение assay.
Протокол синаптосомальных поглощение может предоставить полезную информацию для функциональности DAT. совмещенное с поверхности biotinylation эксперимент13, знания на сумму, уровня поверхности и функциональность DAT может быть получена. Учитывая важную роль DAT и его влияния на передачу да и его участие в различных заболеваний, он был основной целью установить анализов, которые можно моделировать DAT функции. Одним из преимуществ синаптосомальных да поглощение эксперимента является, что она может быть выполненной пост в естественных условиях манипуляций таких как после chemogenetic манипуляции также различные в естественных условиях медикаментозного лечения или поведенческие обучение в дополнение к исследования на генетически измененных мышей. Медикаментозное лечение может выполняться после синаптосомальных подготовки, вместо того, чтобы в естественных условиях если они предпочитают, что делает его можно протестировать влияние наркотиков на DAT непосредственно22.
Альтернативы для выполнения синаптосомальных да поглощения, — выполнить поглощение эксперименты на DAT transfected клеточных культур или в нейрональных культур, естественным образом выражая транспортера. Assays культуры клеток может быть предпочтительным для предварительного расследования различных модификаций DAT23, тогда как нейронов основных культур с эндогенного перевозчик может предоставить более физиологически достоверной картины транспортера Функция в естественных условиях. Даже несмотря на то, что нейрональных культур производятся непосредственно из животных, есть преимущества использования синаптосомах вместо. Нейрональных культур обычно сделаны от дородовой или незрелых нейронах, которые могут повлиять на функции и выражения DAT, тогда как синаптосомальных препараты представляют собой физиологические препараты, которые могут быть получены от взрослых и даже пожилых животных без трудности в6,14.
Существует несколько преимуществ использования синаптосомальных поглощение эксперимента исследовать функции DAT, но важные ограничения должны быть рассмотрены. Синаптосомах имеют ограниченный жизнеспособность6. Держать их на льду имеет важное значение для получения надежных результатов с низкой вариации. Если на льду и необходимых питательных веществ, очищенный синаптосомах жизнеспособным для часов и возьми и освободить нейротрансмиттеров эффективно15. Это можно заморозить синаптосомах, но метод замораживания большое значение15. Небольшие вариации в экспериментальной процедуры может привести к широкие вариации в итоговом документе. Таким образом, экспериментальные протоколы должны быть оптимизированы на дикого типа условий (например, мышей дикого типа) до тех пор, пока воспроизводимые результаты получаются и сопоставления могут проводиться следующие различные генетические или фармакологических манипуляции. Синаптосомальных пробирного поглощение да это простой, надежный и действительный экспериментальный инструмент для получения воспроизводимых данных с очень низкой вариации в ключевых параметров в DA гомеостаза, DAT функциональность (рисунок 2A). Ограничения являются сильно перевешивают преимущества возможность выполнить эксперимент на сохранившихся нервных окончаний от взрослых мышей6.
В настоящее время используемые методы для анализа уровня да в ткани, поддерживаются гистохимические методы, разработанные в 1950 году. Важность разработки методов как ВЭЖХ для измерения уровней Да, был очевидным после обнаружения существенное снижение Да в базальном ganglia Паркинсона пациентов, таким образом основания принцип лечения пациентов, страдающих от Паркинсона с24l-допы. После этого открытия были разработаны более продвинутые методы для анализа тканей да уровней, но как с другими методами есть ловушки. Один из основных недостатков этих методов является нестабильным характер моноаминов (дофамин, норадреналин и серотонина). Как правильно подготовить Подготовка тканей, чтобы избежать потери моноаминов обсуждался в мельчайших подробностях Atack et al. 25 и не будет обсуждаться далее в этой статье, за исключением, чтобы подчеркнуть важное значение размещения ткани на сухой лед непосредственно после рассечения и не добавляя гомогенизации раствора непосредственно перед анализом ВЭЖХ. Из нашего опыта ткани может храниться в-80 oC на срок до одного месяца без какого-либо ухудшения да если решения не была добавлена. Atack et al обсудить Подготовка тканей для методов, начиная от фтор спектрометрическим методом до передовых методов ВЭЖХ, позволяя предел обнаружения до 3 нг/мл ткани25. Метод, который мы расскажем в этой статье основан на тех же принципах. Современные передовые технологии позволяют более изысканный анализа и выявления уровня да в концентрациях фмоль. С помощью флуоресцентного метода ВЭЖХ, даже более надежные моноаминооксидазы анализа можно получить26. Благодаря надежности метода, ВЭЖХ широко используется для получения информации об изменениях в уровнях моноаминов и прекурсоров и метаболитов в различных областях мозга, такие как Да в Полосатое тело, чтобы проверить модели болезни Паркинсона у мышей, обезьян и minipigs27,,2829. Здесь мы проводим эксперимент на ткани от г и NAc, но метод подходит также для других областей DA-иннервируются мозга, таких как prefrontral коры, гиппокамп, substantia nigra и брюшной вентральная область 30. В этих областях более разбавленного стандартного образца будет необходимо для правильного определения уровней да. Наш анализ содержания да показывают более высокие уровни в полосатой subcompartments по сравнению с предыдущих расследований, но это можно объяснить экспериментально. Во-первых мы расчленены две части стриатума (NAc и р-н) в отличие от расследования всей стриатума, которые могли бы учитывать разницу по сравнению с предыдущим докладам12,31. Полосатой измерения будет иметь более низкие уровни Да, по сравнению с измерения в чистый р-н, поскольку уровни в НАК существенно ниже по сравнению с р. У нас также есть предыдущие исследования, подтверждающие наши уровни да5.
Каждый пробирного имеет свои ограничения. Анализы разрабатываются в попытке модель и предоставить информацию по конкретным аспектам процесса, сотовой, и они могут оставить важные детали или слишком обобщенное представление процесса реального мира. Важное ограничение следует учитывать при выборе ВЭЖХ, является, что он только предоставляет моментальный снимок нейротрансмиттера уровнях. Однако нейротрансмиттера уровнях подвержены колебаться в течение дня, недели или месяца32,33, в котором подчеркивается необходимость получения образцов в узком время окна, вместо сравнения образцов, взятых часов, дней или месяцев друг от друга, как Хотя они были доставлены в тот же час. Однако данные ВЭЖХ может предоставить полезную информацию о содержании да и выявить аномальные изменены уровни, такие, как те свидетельствует DAT-KO и DAT-KD трансгенные мыши линии, где генетических удаления или НОК Даун DAT значительно влияет да гомеостаза отмерена да reuptake. Эти данные Фуrthermore продемонстрировать, что полосатой да бассейны преимущественно состоят из поглощенных да вместо de-novo синтезированных да и что пополнения бассейнов да внутриклеточных полосатой зависит reuptake процесса12,34. Один из важных ловушкой для рассмотрения является, что рассечение тканей может ограничить более конкретные и точные описания содержимого Да в зоне мозга в любой момент времени. Различия в концентрации Да в областях различных мозга значительно варьируется. Таким образом точность рассечение имеет большое значение, которое может быть улучшена путем рассечения небольших районов, чтобы убедиться, что только ткани из области интересов входит.
Более функциональный мера эндогенного да бассейны могут быть проанализированы с помощью микродиализом. Это разработана и впервые в Ungerstedt и др. использование вертикальных микродиализом зонд35. Метод микродиализом делает возможным для измерения концентрации моноаминов в мозг свободно перемещающихся животных и различных мозговых структур. Еще одно преимущество над выборки ткани через ВЭЖХ метода микродиализом является возможность измерения и следовать моноаминооксидазы изменения через большой промежуток времени. Это значительное преимущество по сравнению с выборки ткани мозга, где только один момент времени возможна на животное, как и в протоколе ВЭЖХ. Хотя, микродиализом может обеспечить понимание выпуска Да, выборки ткани, следуют ВЭЖХ вместо покажет изменения эндогенного бассейны и везикулярного DA. Для получения в реальном времени информацию о да релиз кинетики в различных областях мозга, методы как быстро сканирования циклической вольтамперометрии36,37 или38 высокоскоростной chronoamperometry может быть реализован.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана UCPH 2016 Программа Excellence (уг, а.р., К.Я), Lundbeck Foundation (м.р.) Lundbeck фонд центр биомембран в наномедицины (уг), национального института из здравоохранения грантов P01 да 12408 (уг), датский Совет независимых исследований - медицинских наук (уг).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
References
- Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
- Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
- Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
- Hornykiewicz, O.
- Schultz, W.
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
- Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
- Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
- Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Whittaker, V. P.
- Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D.
- Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
- Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
- Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
- Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
- Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
- Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
- Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
- Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
- Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
- Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
- Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
- Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
- Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
- Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
- Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
- Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
- Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
- Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).
