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Artículo de método

Evaluación de las propiedades anticoagulantes y antiinflamatorias de las células endoteliales mediante cultivo celular 3D y sangre no anticoagulada

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DOI:

10.3791/56227

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5 de septiembre de 2017

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1Department of Clinical Research, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern, 3Immunology Research Centre, St. Vincent's Hospital Melbourne, 4Institute of Pathology, University of Bern, 5Institute of Molecular Animal Breeding and Biotechnology, Ludwig-Maximilian University

En este artículo

Resumen

Se presenta un modelo en vitro que permite el estudio y análisis de la coagulación en sangre no anticoagulada todo. Anticoagulación en el sistema depende el efecto de anticoagulación natural de las células endoteliales sanas y activación de células endoteliales resultará en la coagulación.

Resumen

In vivo, las células endoteliales son cruciales para la anticoagulación natural de sangre circulante. En consecuencia, activación de la célula endotelial conduce a la coagulación de la sangre. Este fenómeno se observa en muchas situaciones clínicas, como el trasplante de órganos en presencia de formados anticuerpos de anti-donantes, como xenotrasplante, así como en la isquemia/reperfusión. Con el fin de reducir la experimentación animal según el 3R estándares (reducción, reemplazo y refinamiento), en vitro modelos para estudiar el efecto de la célula endotelial, activación de la coagulación de la sangre sería muy deseable. Sin embargo, sistemas comunes de plano de la cultura de célula endotelial ofrecen una relación superficie a volumen de 1-5 cm2 de endotelio por mL de sangre, que no es suficiente para la anticoagulación natural, mediada por el endotelio. Cultivo de células endoteliales en la cuenta de la potencia puede aumentar la relación superficie-volumen 40-160 cm2/ml. Este ratio mayor es suficiente para asegurar la anticoagulación "natural" de sangre, por lo que puede evitarse el uso de anticoagulantes. Aquí se describe para estudiar los efectos de la modificación genética de las células endoteliales porcinas en coagulación de la sangre no anticoagulada todo, un en vitro potencia-sistema basado. En el análisis descrito, células endothelial aórticas porcinas primarias, ya sea tipo salvaje (WT) o transgénicos para humanos CD46 y trombomodulina, crecido en granos de potencia y luego expuesto a sangre humana recién extraída sin anticoagulante. Este modelo permite la medición y cuantificación de la liberación de citoquinas y activación marcadores de complemento y coagulación en el plasma sanguíneo. Además, la proyección de imagen de células endoteliales activadas y la deposición de inmunoglobulinas, complemento y coagulación de proteínas en los granos endotelizados fueron realizadas por microscopia confocal. Este ensayo también puede utilizarse para probar fármacos que se suponen para evitar la coagulación y, por tanto, la activación endotelial de la célula. Encima de su potencial para reducir el número de animales utilizados para tales investigaciones, el ensayo descrito es fácil de realizar y consistentemente reproducible.

Introducción

El endotelio vascular consiste en una monocapa de células endoteliales (CE) que recubren el lumen de los vasos sanguíneos. En un estado fisiológico, CE quieto son responsables por el mantenimiento de un entorno antiinflamatorio y anticoagulante. 1 esto es mediado por la expresión de anticoagulantes y antiinflamatorias proteínas en la superficie de la CE. Por ejemplo, activación de CE causada por isquemia/reperfusión lesiones o rechazo vascular (xeno-) trasplantados resultados de órganos en un cambio de la superficie endotelial de un anticoagulante y antiinflamatorio estado Pro coagulante y pro-inflamatoria Estado. 1

Para estudiar la fascinante y compleja interacción entre los factores del endotelio y coagulación, en vitro modelos que imitan como posible la situación en vivo son altamente deseables. Una limitación común que caracteriza a ensayos de coagulación convencional en vitro es el uso de sangre con anticoagulante que hace que el análisis de los efectos de la coagulación mediada por ardua y no se puede reproducir incluso recalcificación de la sangre entera citratado resultados obtenibles con sangre fresca sin anticoagulante. 2 además, en los sistemas de cultivo celular de plano tradicional es imposible explotar las propiedades anticoagulantes del endotelio como una suficiente superficie de la célula endotelial por el volumen de sangre no se puede llegar. El modelo presentado aquí supera estas limitaciones por CE el cultivo en la superficie de los granos de la potencia esférica, de modo que una proporción de superficie a sangre CE de > 16 cm2/ml puede ser alcanzado, que es similar a la situación en las pequeñas arteriolas o venas, y que fue descrito para ser suficiente para permitir la "natural" anticoagulación de la sangre por la superficie de la CE. 3 , 4 puede utilizarse sangre entera sin agregado anticoagulantes en este contexto. Muestras de sangre se pueden recoger durante el experimento y citoquinas, factores de coagulación y marcadores de la activación de complemento soluble pueden ser detectados y cuantificados. Además, granos recubiertos de CE potencia pueden analizarse para la deposición del complemento y de inmunoglobulinas así como la expresión de marcadores de activación de CE por microscopia confocal. Otra aplicación interesante incluye la prueba de drogas que se suponen para evitar la coagulación y, por tanto, la activación endotelial de la célula. 5 aunque este modelo no puede sustituir completamente los experimentos con animales, ofrece un método para probar hipótesis funcionales específicas ex vivo con células y reducir así el número de animales utilizados en investigación básica en isquemia/reperfusión trasplante de la lesión o (xeno).

El modelo descrito fue utilizado para imitar un xenotrasplante en que células endoteliales aórticas porcinas (PAEC) son cultivadas en los granos de potencia y se incubaron con todo, no anticoagulada sangre humana. Se analizaron diferentes PAEC transgénico, portadores de varios genes humanos como CD46 para la regulación del sistema del complemento o trombomodulina (hTBM) para la regulación del sistema de coagulación, por sus propiedades anticoagulantes. Sistemas de activación de complemento y coagulación de células endoteliales bien controlados y conectadas entre sí. 6 por lo tanto es importante entender cómo se comportan las células transgénicas diferentes tras la exposición a sangre humana con respecto a la expresión de la molécula de adhesión y liberación de citoquinas, vertimiento del glicocálix y pérdida de proteínas anticoagulantes. 7

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Protocolo

se utilizaron cerdos Landrace alemán (tipo salvaje criado en una granja local y transgénico criados en el Instituto de reproducción Animal Molecular y biotecnología, Universidad Ludwig-Maximilian, Munich, Alemania), peso entre 30 kg a 40 kg, en Este estudio. Todos los animales fueron alojados bajo condiciones estándar con alimentos y agua ad lib. Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a la ley de animales de Reino Unido (procedimientos científicos) y la guía de NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio, así como la ley de protección animal Suiza. Todos los estudios en animales el cumplimiento de las directrices de llegar. El Comité de experimentación animal del servicio veterinario cantonal (Cantón de Berna, Suiza) aprobó todos los procedimientos animales, permiso no. BE70/14. Protocolos experimentales fueron refinados según los principios de las 3R y estado de la técnica anestesia y manejo del dolor fueron utilizados para minimizar el número de animales y reducir la exposición de los animales al estrés y el dolor durante los experimentos.

se extrae sangre de individuos sanos por venopunción sistema cerrado acuerdo con Suiza pautas de competencia y ética del Hospital Universitario de Berna. La frase " sangre sin anticoagulante " significa que la sangre no haya sido tratada con cualquier anticoagulante.

los siguientes pasos se realizan bajo condiciones estériles. Familiaridad con técnica estéril de la cultura de célula básica es necesario.

1. aislamiento de PAEC

Nota: se obtuvieron segmentos de aorta torácica de 6 a 10 cm de sacrificaron cerdos Landrace alemán de 3 a 6 meses de edad (para otros experimentos en vivo) e inmediatamente transferido a una botella de vidrio de 500 mL que contiene medio de transporte (DMEM + 1% de penicilina/estreptomicina).

  1. Pre-recubrir una placa de 6 pozos con fibronectina 12.5 μg/mL en PBS 1 x y colocarlo en una incubadora a 37 ° C durante 1 h.
  2. Caliente previamente estéril PBS 1 x y la célula cultura medio (DMEM).
  3. Sacar la aorta porcina de medio de transporte.
  4. Coloque la aorta en una placa de poliestireno.
  5. Lavar con PBS caliente suavemente antemano.
  6. Cortar la aorta longitudinalmente y fijarla con agujas de.
  7. Agregar medio de cultivo celular caliente en la superficie del recipiente interno.
  8. Aspirar el medio de cultivo celular de fibronectina y agregar medio de cultivo de células frescas (DMEM suplementado con 10% FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 0.4% de endotelial célula crecimiento medio suplemento Mix).
  9. Empapar una torunda de algodón en el medio de cultivo celular. El capullo de algodón en la parte superior de la superficie del recipiente interno de pads suavemente y poco a poco en la misma dirección.
  10. Frotar las células en un pozo de placa de 6 pozos ronda por ronda.
  11. Lo mismo para el resto de los pozos de.
  12. Verificar las células bajo el microscopio y coloque la placa de 6 pozos en incubadora a 37 ° C, 5% CO 2.
  13. Cambiar el medio en el segundo día y cambiarla otra vez cada 2-3 días.
  14. Cuando las células van a ser confluentes, trypsinize células y semilla en un frasco de T75 (PAEC P1).

2. Caracterización de PAEC

  1. la capa de un pozo de 8 chamberslide con fibronectina 12.5 μg/mL en PBS 1 x y colocarlo en una incubadora a 37 ° C durante 1 h.
  2. Semilla de 5 x 10 4 células/pocillo e incubar durante la noche en la incubadora a 37 ° C.
  3. Lavan las células dos veces con PBS ++ (PBS suplementado con CaCl 2 y MgCl 2), 300 μL/pocillo.
  4. Fijar las células con paraformaldehido 3,7% por 10 min a temperatura ambiente, 200 μL/pocillo.
  5. Lavar las células 3 veces con PBS ++, 300 μL/pocillo.
  6. Añadir 300 μL de PBS 1 x-3_% BSA (solución amortiguadora de bloqueo) y dejar 30 min a temperatura ambiente.
  7. Aplicar anticuerpos primarios (anti-VE-cadherina, anti-CD31, anti-vWF) diluidos en detergente 1x-1%BSA-0.05% de PBS, 160 μL/pocillo e incubar 1 h a temperatura ambiente.
  8. Lave 3 veces con PBS ++ (200 μL/pocillo).
  9. Aplicar anticuerpos secundarios y DAPI diluida en detergente 1x-1%BSA-0.05% de PBS, 160 μL/pocillo e incubar 1 h a temperatura ambiente.
  10. Lave 3 veces con PBS ++ (200 μL/pocillo).
  11. Montaje de diapositivas con medio de montaje en base de glicerol y verificar la expresión de marcadores de células endoteliales bajo un microscopio de fluorescencia.
    Nota: Se llega a células endoteliales aórticas porcinas cultura en un matraz T175 (DMEM glucosa baja medio + 10% FBS, penicilina/estreptomicina de 1% y 0,4% de células endoteliales crecimiento medio suplemento mezcla) hasta 90% de confluencia. (siembra células de densidad 1 x 10 6, 90% de confluencia corresponden aproximadamente a 5 x 10 6 células).

3. Capa de los granos de la potencia de

  1. 7 mL de granos de la potencia de la mezcla con 42 mL de solución de colágeno en un tubo de 50 mL (100 μg/mL, diluida en una solución de ácido acético del 0,2%) e incubar 1 h a temperatura ambiente.
  2. Lavar granos dos veces con 25 mL de pH 7.4 de PBS (añadir 25 mL de PBS, mezclar bien con la pipeta y espere hasta que los granos se colocan hacia abajo entonces descarte el sobrenadante y repetir) y una vez con 25 mL de medio DMEM.
  3. Cubierta de los granos en el tubo de 50 mL con 10mL de medio 199 suplementado con 10% FBS, penicilina/estreptomicina de 1%, 1% L-glutamina, 0.4% de células endoteliales crecimiento medio suplemento mezcla y 25 μL de heparina (5000 UI/mL) y permite equilibrar durante 10 min. antes de cualquier uso.

4. Recolección de células

  1. Retire el medio de cultivo celular del frasco de T175 conteniendo PAEC y añadir 5 mL de pH PBS 7.4.
  2. PBS Retire del frasco T175.
  3. Añadir 5 mL de EDTA Trypsin-0.05% e incubar durante 3-4 minutos a 37 ° C.
  4. Recoger las células enjuagando el frasco con 15 mL de medio de cultivo celular y transferir la suspensión en un tubo de 50 mL.
  5. Centrifugar las células a 1.200 x g por 8 min a temperatura ambiente, quitar exceso medio y resuspender el precipitado en 5 mL de medio de cultivo celular.

5. Siembra de células en el matraz de agitador

  1. Añadir 20 mL de medio de cultivo celular para la suspensión de células y resuspender.
  2. Añadir 20 mL medio de cultivo celular (sin células) en el matraz de agitador magnético 500 mL.
  3. Añadir las células a los granos lavados potencia de paso 3.3 y mezclar cuidadosamente con una pipeta serológica de 25 mL.
  4. Transferencia de la mezcla de granos de la célula en la cubeta magnética spinner.
  5. Enjuague el tubo de 50 mL con 10 mL de medio de cultivo celular para recoger las células restantes.
  6. Agregar un adicional 85 mL de medio de cultivo celular en el matraz de spinner y colóquelo en la incubadora durante la noche a 37 ° C en un agitador (100 x g, mezcla de intervalo: 3 min cada 45 min).
  7. Añadir 50 mL de medio de cultivo celular (volumen total 200 mL) y continuar la agitación adicional 24 h a 37 ° C en un agitador (100 x g, mezcla de intervalo: 3 min cada 45 min).
  8. Agregar medio descolorido de RPMI (suplementado con 10% FBS, penicilina/estreptomicina de 1%, 1% L-glutamina, 0.4% de células endoteliales crecimiento medio suplemento mezcla y 25 μL de heparina) hasta 320 mL de volumen total.
  9. Cambiar el medio cada 48 h: quitar 100 mL de medio viejo y añadir 100 mL de fresco RPMI incoloro suplido.
  10. Las células de cultivo durante 5 a 7 días. El tiempo depende del estado de la confluencia de los granos recubiertos de celular.
< clase p = "jove_title "> 6. Verificación de confluencia

  1. recoger 200 μL de granos recubiertos de células con una pipeta y transferirlos a un tubo de polipropileno.
  2. Lave los granos 3 veces con 600 μL de PBS 1 x (Añadir PBS, incline el tubo y mezcle suavemente para evitar el desprendimiento de las células, espere los granos para establecerse, descartar el PBS y repetir).
  3. Fijar los granos durante 10 min mediante la adición de 200 μL de ácido parapicric.
  4. Lavar 3 veces con 600 μL de PBS 1 x.
  5. Añadir DAPI diluido en PBS 1 x y se incuba durante 10 minutos
  6. Transferencia de los granos en un portaobjetos de vidrio y se aplica un cubreobjetos usando glicerol base montaje medio.
  7. Visualizar las cuentas debajo de un microscopio confocal.

7. Procedimiento experimental

  1. Quite los granos recubiertos por células del frasco agitador magnético (procedimientos no debe hacerse en condiciones estériles) con una pipeta serológica de 10 mL y transferir a tubos de polipropileno de fondo redondo de 12 mL.
  2. Deja los granos colocan abajo (alrededor 1-2 min) y quitar exceso medio.
  3. Añadir más cuentas a los tubos hasta que cada tubo contiene exactamente 2 mL de granos de.
  4. Añada 5 mL RPMI claro a cada tubo y mezclar cuidadosamente con una pipeta serológica de 10 mL.
  5. Deja los granos colocan abajo y quitar exceso medio.
  6. Repetir el procedimiento de lavado una vez más con RPMI y quitar todo exceso medio.

8. Incubación con sangre sin anticoagulante

  1. lenta y cuidadosamente (con jet ni vacutainers) extraer la sangre de un voluntario sano y recoger en tubos polipropileno neutro (sin anticoagulante) con 9 mL.
  2. Transferir lentamente 8 mL de sangre con una pipeta serológica de 10 mL en cada uno de los tubos de polipropileno que contiene 2 mL de granos recubiertos de células (el volumen total será de 10 mL). Siempre Evite el manejo brusco de sangre o granos para evitar la activación prematura de la CE. El procedimiento toma 1-2 minutos
  3. Incline con cuidado la mezcla de sangre/grano para asegurar una mezcla igual y selle la tapa con la película de parafina.
  4. Colocar los tubos sobre una mesa giratoria horizontal (con suave inclinación los ajustes únicamente) dentro de una incubadora de 37 ° C y el registro de tiempos de coagulación.
    1. a intervalos de tiempo, por ejemplo, después de 10, 20, 30, 50, 70, 90 min, quitar al menos 1.5-2 mL de la mezcla de grano de sangre para análisis de suero o plasma de.
      Nota: para 6 puntos de tiempo sugerimos tener más de 3 repeticiones dentro de un grupo de células, como la toma de muestras de sangre se realizará en diferentes tubos.
    2. Para la recogida de suero, dejar la sangre a coagular. Para recoger el plasma, añadir EDTA o citrato a tubos con 2 mL antes de agregar las muestras de sangre.
    3. Almacenar los tubos en hielo, centrifugar a 2.500 x g durante 10 min a 4 ° C y almacenar suero o plasma a 80 ° C hasta su uso.
      Nota: Detalles en los materiales son proporcionados en la Tabla de materiales

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Resultados

Después de 7-10 días de cultivo en el matraz de spinner (figura 1) las células eran confluentes, cubriendo toda la superficie de los granos de potencia (figura 2). Verificación del estado confluency es un paso importante porque una monocapa no confluentes de CE de los microbeads conducirá a una disminución marcada en el tiempo de coagulación, dada la potencia superficie de granos de la es fuertemente Pro coagulante (tiempo de coa...

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Discusión

El modelo presentado aquí es conveniente para la coagulación relacionados con estudios, que permite el análisis de diferentes aspectos de la coagulación y su interacción con EC. 8 en la investigación del xenotransplantation, es un sistema útil para probar las propiedades anticoagulantes de la ECs porcinos genéticamente diferentes después de la incubación con sangre humana 9.

Los pasos más críticos del protocolo son los asegurar cobertura completa...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la Fundación Suiza de ciencia nacional (FNS, Grant No. 320030_156193). Los autores agradecen a Dr. Benoît Werlen para proporcionar los granos de potencia Biosilon. También agradecemos el Prof. Hans Peter Kohler y Prof. André Haeberli ayuda para configurar el modelo de grano potencia.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
PAECAislado de la aorta de cerdo en nuestro laboratorio
Microcarrier beads (Biosilon)Thermo Fisher Scientific160-250
Colágeno I, BovinoGibcoA10644-01
DMEMGibco21885-025
Medio 199SigmaM7528
RPMIGibco32404-014
Tubos neutrosSarstedt02.1726.001
Tubos de polipropilenoSimportT406-2A
Matraces agitadoresTecnomara
Agitador biológicoBrouwerMCS-104S
Rata anti CD31R& D SystemsMAB33871Dilución 1:100
Cabra anti-rata IgG-Cy3Jackson Immuno Research112-166-003Dilución 1:500
Cabra anti VE-cadherinaSanta Cruzsc-6458Dilución 1:100
Conejo anti vWFDAKOA0082Dilución 1:100
Dk anti Gt IgG – Alexa 488Sondas MolecularesA11055Dilución 1:500
Cabra anti Conejo - FITCSouthern Biotech4050-02Dilución 1:500
DAPISigma32670-25MG-FDilución 1 µ g/mL
0.05% Tripsina-EDTAGibco25300-054
FBSGibco10270-106Concentración: 10% en medio de cultivo celular
AdaptadorSarstedt14.1205
Microscopio confocalCarl ZeissLSM 710
Software de análisis de imágenesImage JDisponible gratuitamente en: https://imagej.net
Suplemento de Medio de Crecimiento Celular EndotelialMixPromoCellC-392162 mL en 500 mL de DMEM
Penicilina EstreptomicinaGibco15140-122Concentración: 1% en medio de cultivo celular
L-GlutaminaGibco25030-024Concentración: 1% en medio de cultivo celular
Heparinun natricumDrossa Pharm AGConcentración de stock: 5000 U.I./ mL
PortaobjetosBioswisstec AG30108
CaCl2 x 2H2OMerck2382.0500
MgCl2 x6 H2OMerck1.5833.1000
Tween 20Axon Lab AG9005-64-5
Albúmina sérica bovina (BSA)SigmaA7030
Medio de montaje de glicergel:DakoC0563

Referencias

  1. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
  2. Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
  3. Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
  4. Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
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  6. Cowan, P. J., d'Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
  7. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
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  9. Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
  10. Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
  11. Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).

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