Evaluación de la invasión celular y el proceso de migración: una comparación de Video cero basado en el microscopio de la herida el análisis y el análisis de la cámara de Boyden

Migración y la invasión de células participan en la diseminación de células cancerosas, que es la principal causa de resistencia a los tratamiento¹ y pueden llevar a locorregional o metastásica recurrencia después de tratamiento del cáncer². La transición epitelial-mesenquimal (EMT) es el proceso inicial de invasión-migración de la célula en que el cáncer de las células cambia de un epitelio a un fenotipo mesenquimal. E-cadherina es un marcador extracelular del fenotipo epitelial³y aumento de la expresión de N-cadherina y vimentina es característica del fenotipo mesenquimal⁴. La migración también depende de la capacidad intrínseca de las células cancerosas invaden la matriz extracelular (ECM) a través de la acción de metaloproteasas de matriz⁵.

Este mecanismo de invasión, la migración se ha descrito para el cáncer en muchos lugares, particularmente en cáncer de cabeza y cuello⁶. Muchos investigadores se han centrado en los procesos de migración y la invasión para entender mejor cómo las células cancerosas se difusión en la esperanza de que este conocimiento conducirá a nuevas estrategias de tratamiento. Es crucial que estos estudios se realizan utilizando ensayos fiables y reproducibles.

Análisis in vitro de motilidad de la célula pueden ser difícil. Desarrollada hace muchos años, el análisis de la cámara de Boyden se considera para ser el estándar para la invasión – migración análisis⁷. Sin embargo, es lento y a menudo es inexacta. Una segunda prueba es la cicatrización ensayo⁸, que implica hacer un rasguño en un cultivo celular de monocapa y captura de imágenes de invasión celular y la migración a intervalos de tiempo fijo. Esta técnica ha sido ampliamente criticada debido a las grandes variaciones entre los resultados de dos pruebas sucesivas. Sin embargo, la aplicación de tecnologías modernas, especialmente en microscopia, ha mejorado la reproducibilidad de la prueba de scratch de la herida. Videos microscopios pueden introducirse fácilmente en incubadoras y pueden generar imágenes en tiempo real de la migración de la célula. Estos dispositivos registran datos microscópicos y proporcionan un análisis automático de confluencia celular de herida con el tiempo. El objetivo de este trabajo es describir el ensayo de cámara de Boyden y el herida rasguño optimizado el análisis y discutir las ventajas y debilidades de cada enfoque.

Nota: Los ensayos de cámara y cero de Boyden sin la inclusión del ECM se denominan el ensayo de migración, y el mismo análisis con el ECM se conoce como el ensayo de invasión.

1. ensayo de cámara de Boyden

Nota: Este protocolo está adaptado para la línea celular de SQ20B, que se deriva de un cáncer laríngeo recurrente de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) y se obtuvo de John Little (Boston, MA, USA).

Día 1

1. Siembra de células
   1. Semilla 2 10⁶ SQ20B células en 12 mL de medio de cultivo (CM) en un matraz de² 175 cm 72 h antes de primer día y permitir a las células a crecer hasta 80% confluencia de células.
      1. Para preparar las células de SQ20B CM, suplemento medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero fetal de ternero (FCS), hidrocortisona de 0.04 mg/mL, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina de 0.1 g/L.
   2. Bajo una campana de flujo laminar, trypsinize las células. Quitarlo del medio, lavan las células con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y añadir 2,5 mL de ácido de tripsina etilendiaminotetracético (EDTA) (0,5 g/L). Incube las células durante 5 min a 37 ° C y luego se para la reacción mediante la adición de 12,5 mL de CM calentado a 37 ° C. Contar el número de células usando un contador de células.
   3. Las células en un matraz de² de 25 cm a una densidad celular de 6 10⁵ células para cada condición que se evaluará de la semilla. Incube las células durante 24 h en 3 mL de CM.

Día 2

2. Hambre y preparación de cámaras revestidas de células
   1. Matar de hambre las células cambiar el medio en cada frasco con 3 mL de medio de suero baja fetal bovino (FBS) con 0.1% de albúmina sérica bovina (BSA) en lugar de FBS. Matar de hambre las células durante 24 horas en la incubadora.
      1. Para preparar el hambre CM (s-CM), suplemento de DMEM con 0.1% de BSA, hidrocortisona de 0.04 mg/mL, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina de 0.1 g/L.
   2. Para el análisis de la migración, vaya al paso 1.3.
   3. Para el análisis de la invasión, 12 h antes del día 3, preparar las cámaras Boyden revestidas por agregar 500 μL de s CM para cada compartimiento revestido. Usar preparados comercialmente cámaras revestidas de Boyden y mantenerlos a 4 ° C antes de usar. Coloque cada compartimiento de Boyden en la placa de compañero y colóquelo en la incubadora a 37 ° C durante la noche.

Día 3

3. Célula de siembra en la cámara de Boyden
   1. Utilizar la placa de compañero para preparar la chemoattractant. Llene cada uno bien de la placa de 24 pocillos compañero con 750 μL de medio completo con 10% FBS, hidrocortisona de 0.04 mg/mL, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina de 0.1 g/L.
      1. Adaptar la chemoattractant para cada línea celular y cada condición de tratamiento. Para preparar la chemoattractant CM (ca-CM), suplemento de DMEM con 10% FCS, hidrocortisona de 0,4 mg/mL, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina de 0.1 g/L.
   2. Transferencia de la cámara alta en la placa del compañero prellenada, teniendo cuidado para evitar burbujas.
   3. Para el análisis de la invasión, retire con cuidado 450 μL de CM de cada compartimiento de Boyden.
   4. Bajo una campana de flujo laminar, trypsinize las células. Quitarlo del medio, lavan las células con PBS estéril, Añadir 0,5 mL de tripsina EDTA (0.5 g/L) y luego incubar las células durante 5 min a 37 ° C. Detener la reacción añadiendo CM calentado a 37 ° C. Contar el número de células usando un contador de células.
   5. 3 10⁴ SQ20B células de semillas en 500 μL de medio de BSA 0.1%, dando una dilución final de 10 6⁴ células/mL.
      Nota: La concentración de células debe ser adaptada para cada línea celular.
   6. Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C durante 24 h.

Día 4

4. Fijación de la célula y la coloración
   1. Fijar las células antes del tiempo de duplicación específico a esa línea celular. Fijar las células SQ20B antes de 24 h.
   2. Extraer cada parte movible de la placa de compañero y retire con cuidado las células de la cámara superior utilizando un hisopo de algodón. Es particularmente importante eliminar todas las células en la cámara alta.
   3. Fix y la mancha Inserte individualmente para obtener coloración de May-Grunwald Giemsa⁹ utilizando el kit de tinción proporcionado. Como alternativa, utilizar paraformaldehído al 4% en otra placa de compañero para una fijación de 30 min.
   4. Mantenga los rellenos en una placa de vacío 24-bien compañero bajo una campana de laboratorio para secar cada cámara.

Día 5

5. Análisis microscópico
   1. Inserte la placa del compañero con los insertos en un microscopio de contraste de fase 20 y contar cada célula migrado en la parte inferior de la membrana. Optimizar la posición de foco derecho moviendo el objetivo de la parte inferior a la parte superior y la posición de parada en la parte inferior de la membrana.
   2. Calcular el cociente entre el número de células migradas y células sembradas. Repita cada cuenta para cada condición de tratamiento por triplicado.

2. cero herida ensayo: Migración de la célula

Nota: Las instrucciones deben ser adaptadas para cada tipo de célula.

Día 1

1. Siembra de células
   1. Semilla 2 x 10⁶ SQ20B células en 12 mL de CM en un matraz de² 175 cm 72 h antes de primer día y permitir a las células a crecer hasta 80% confluencia de células.
   2. Bajo una campana de flujo laminar, trypsinize las células. Quitarlo del medio, lavan las células con PBS estéril, añadir 2,5 mL de tripsina EDTA (0.5 g/L) e Incube las células durante 5 min a 37 ° C. Detener la reacción, añadir 12,5 mL de CM calentado a 37 ° C. Contar el número de células usando un contador de células.
   3. Generar una muestra prediluida con una densidad celular de 4 x 105/ml, lo que da una densidad final de 4 10⁴ células por 100 μL en cada pocillo. Esta concentración debe ser adaptada para cada línea celular y debe estar en el rango de 1 x 10⁴ 6 10⁴ células.
   4. Células de semilla en cada pocillo de una placa de 96 pocillos por depositar 100 μL de la solución preparada en el paso 2.1.2.
   5. Dejar la placa a temperatura ambiente durante 5 minutos dispersar las células uniformemente en el fondo de los pozos.
   6. Coloque la placa en la incubadora y permitir que las células se adhieran a la placa de 12 a 16 h (máxima) a 37 ° C.

Día 2

2. Rayar la herida ensayo
   1. Saque el preparado en el paso 2.1 de la incubadora.
   2. Bajo el capó, hacer una herida usando el dispositivo herido comercial según protocolo del fabricante.
   3. Retire inmediatamente el medio de cada pocillo con una pipeta con una punta cónica adaptada, teniendo cuidado de no para tocar la herida.
   4. Lavan las células dos veces por repetir la aspiración y el uso de 100 μL de CM calentado a 37 ° C por cada pozo.
   5. Eliminar los centímetros usando una pipeta con una punta cónica adaptada tras los pasos de lavado.
   6. Añada 100 μL de medio específico para cada condición de tratamiento a cada pocillo.
   7. Trate de evitar la creación de burbujas en los pocillos. Una técnica de pipeteo de reversa puede ser útil aquí. O bien, elimine las burbujas con una aguja de jeringa.
   8. Coloque la placa en el bastidor adaptado del video microscopio.
   9. Para mejorar la calidad de la imagen, deje que la plancha se caliente durante al menos 15 min antes de la primera exploración para evitar la condensación en la parte inferior de la placa.
   10. Programa el programa de análisis, utilizando el software del microscopio video en una sola imagen por pozo. Un intervalo máximo de 2 h se requiere para un experimento de invasión-migración. Si el objetivo del experimento es producir un video, un intervalo de 30 minutos máximo es preferido.
   11. Al final del experimento, lavar cuidadosamente el dispositivo hiriente y seguir cada uno de los cuatro pasos de lavado indicados por el fabricante.

Días 3, 4 y 5

3. Análisis de la migración usando el microscopio video
   1. Para un mínimo de 24 hs y un máximo de 5 días, vigilar y controlar la migración de la célula.
   2. Use una máscara de células apropiadas adaptada para cada tipo de célula para analizar la migración de la célula. Para obtener una mascarilla de células adaptada para cada línea celular, generan una célula proceso definición del software usando una colección de imágenes de células específicas.
   3. Trazar las curvas y exportar los datos a una hoja de cálculo, que puede utilizarse para analizar y comparar los resultados.

3. cero herida ensayo: Invasión de células

Nota: Las instrucciones deben ser adaptadas para cada tipo de célula.

Día 1

1. Siembra de células
   1. Utilizar el mismo protocolo para la siembra de células como se describe en el paso 2.1.

Día 2

2. Preparación del ECM
   1. Descongelar la matriz durante al menos 12 h antes de su uso a 4 ° C. Asegúrese de que no hay agregados son visibles. Si los agregados están visibles, mantener la matriz a 4 ° C durante un largo periodo hasta que desaparezcan los agregados. Mantener la matriz en el hielo. Usar puntas de pipeta preenfriada.
      Nota: La matriz solidificará si no mantener a 4 ° C.
   2. Enfriar los tubos de microcentrífuga en hielo durante 5 minutos.
   3. CM refrigerado a 4 ° C en el refrigerador y diluir la matriz en los tubos de microcentrífuga preenfriada para obtener una concentración final de 300 μg/mL.
   4. Devolver los tubos de microcentrífuga con matriz prediluido al refrigerador a 4 ° C.
      Nota: Un estante de enfriamiento adaptado para tubos de microcentrífuga es útil para mantener los tubos a 4 º C durante todo el experimento.

Día 2

3. Ensayo de rayado de la herida y tratamiento de lo ECM
   1. Retire la placa preparada en el paso 3.1 de la incubadora.
   2. Bajo el capó, hacer la herida usando el dispositivo herido comercial según protocolo del fabricante.
   3. Retire inmediatamente el medio de cada pocillo con una pipeta con una punta cónica adaptada teniendo cuidado de no para tocar la herida.
   4. Lavan las células dos veces por repetir la aspiración y el uso de 100 μL de CM calentado a 37 ° C.
   5. Después del segundo lavado, coloque la placa en la incubadora de 4 º C para equilibrar su temperatura durante 5 minutos.
   6. Retire el medio frío de cada pocillo con la pipeta de aspiración con un extremo cónico, teniendo cuidado al Pipetear cuidadosamente desde el borde y evitar tocar la herida.
   7. Añadir 50 μL de matriz prediluido a cada pocillo utilizando puntas cónicas preenfriadas a 4 ° C.
   8. Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C durante 30 minutos.
      Nota: Un bastidor de soporte precalentadas a 37 ° C es útil para acelerar el calentamiento de la placa de 96 pocillos.
   9. Retire la placa de la incubadora y añadir 100 μL de la CM adaptada a cada pocillo como se indica para cada condición de tratamiento.
   10. Trate de evitar la creación de burbujas en los pocillos. Una técnica de pipeteo de reversa puede ser útil aquí. O bien, elimine las burbujas con una aguja de jeringa.
   11. Coloque la placa en el bastidor adaptado al microscopio video.
   12. Para mejorar la calidad de la imagen, deje que la plancha se caliente durante al menos 15 min antes de la primera exploración para evitar la condensación en la parte inferior de la placa.
   13. Programa el programa de análisis, utilizando el software del microscopio video en una sola imagen por pozo, en el modo de exploración de Scratch de la herida. Un intervalo de 2 horas máximo en necesaria para un experimento de invasión-migración. Si el objetivo del experimento es producir un video, un intervalo de 30 minutos máximo es preferido.
   14. Al final del experimento, lavar cuidadosamente el dispositivo hiriente y seguir cada uno de los cuatro pasos de lavado indicados por el fabricante.

Días 3, 4 y 5

4. Análisis de la invasión de células utilizando un microscopio video.
   1. Repita el paso 2.3.

Aquí divulgamos dos métodos diferentes para analizar la migración y la invasión celular. La figura 1 muestra al Boyden experimento de cámara. Los rellenos se colocan en un plato acompañante con chemoattractant medio y las células se siembran en CM. La membrana puede ser sin recubrimiento (ensayo de migración) o cubierta (ensayo de invasión). Se siembran las células en la cámara alta en s-CM. La cámara baja está llena de CM como un chemoattractant. Las células se fijan antes del tiempo de duplicación.

La figura 2 muestra la membrana de Boyden después de la fijación de la célula. Figura 2A muestra un resultado subóptimo, con racimos de célula en la parte superior de la membrana. Figura 2B muestra un resultado óptimo con las células fijas y teñidas en azul en la membrana.

La figura 3 muestra un resultado óptimo de la prueba de scratch de la herida. La herida lineal se aprecia en la Figura 3A. No se observaron células en la herida y cicatrización de la herida se ha producido dentro de las 30 h. El tiempo en cicatrizar la herida depende de la línea celular y va de 24 a 50 h.

Figura 3B es una representación gráfica de la herida que cura en cuatro condiciones de tratamiento: ABT, ABT-199 (anti-Bcl-2), cetuximab (anti-EGFR) y control-199 + cetuximab. El ABT-199 + cetuximab combinación disminuyó significativamente la migración de la célula. Las curvas se obtienen utilizando el software de vídeo microscopio, que proporciona análisis de datos robusto de migración de la célula con el tiempo. Barras de error representan la desviación estándar (SD) para cada bien.

El 90% de confluencia es la densidad celular óptima para el análisis de la cicatrización. La siembra celular óptima depende de la línea celular y va desde 3 x 104 a 6 x 104 células. Figura 4A muestra la densidad óptima de la célula, y figura 4 muestra la densidad celular baja. Pozos deben lavarse dos veces para evitar racimos de célula, como se muestra en la Figura 4B.

Figura 1: representación esquemática del experimento de cámara de Boyden. Rellenos se colocan en un plato acompañante con chemoattractant medio y las células se siembran en CM. La membrana puede ser sin recubrimiento (A) o cubierta (B).

Figura 2: subóptimos y óptimos resultados microscópicos obtenidos en el experimento de la cámara de Boyden. (A) membrana subóptima con racimos de célula en la parte superior de la membrana y resultados no interpretables. Barra de escala = 300 μm. (B) membrana óptima con células contables en la parte inferior de la membrana teñida en azul. Barra de escala = 300 μm.

Figura 3: resultados óptimos obtienen en el experimento cicatrización. (A) imagen representativa del ensayo de rayado herida demostrado la cicatrización observada a 0, 15 y 30 h. Los criterios para un experimento de calidad son una herida lineal, no fragmentos celulares observan en la herida y la confluencia celular óptima. Barra de escala = 300 μm. (B) representación gráfica de la cicatrización que muestran la cuantificación de los parámetros de la confluencia de la célula de la herida (porcentaje) según la hora (h). Cuatro condiciones de tratamiento se analizan aquí, y los datos se muestran con la SD.

Figura 4: resultados subóptimos obtenidos en el experimento de cicatrización. (A) densidad de célula Ideal. (B) problemas que se lava el precipitado de células. (C) la densidad de baja celular. Barras de escala = 300 μm

Tabla 1: ventajas y desventajas de la Boyden cámara de experimentación y ensayo de cicatrización microscopio video. Experimentan las ventajas y desventajas de la cámara de Boyden y cero herida ensayo.

Los autores no tienen nada que revelar.