Summary
تفيد هذه الدراسة أسلوبين مختلفين لتحليل الخلية الغزو والهجرة: مقايسة الدائرة Boyden و في المختبر الفيديو المستندة إلى مجهر التئام المقايسة. وصف بروتوكولات لهذه التجارب اثنين، وتتم مقارنة مزايا وعيوب.
Abstract
قدرات الخلايا السرطانية الغزو والهجرة هي المساهمة الرئيسية في تطور السرطان والتكرار. العديد من الدراسات استكشاف قدرات الهجرة وغزو لفهم كيفية نشر الخلايا السرطانية، بهدف وضع استراتيجيات جديدة للعلاج. التحليل الأساس الخلوية والجزيئية لهذه القدرات قد أدى إلى توصيف الحراك الخلية والخصائص الفيزيائية الكيميائية سيتوسكيليتون والخلوية المكروية. لسنوات عديدة، كانت المقايسة الدائرة Boyden والمقايسة الجرح الصفر التقنيات القياسية لدراسة الخلية الغزو والهجرة. ومع ذلك، هذه التقنيات اثنين على قيود. والرزن الدائرة Boyden صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً، والمقايسة الجرح الصفر بإمكانية تكرار نتائج منخفضة. تطوير التكنولوجيات الحديثة، لا سيما في الفحص المجهري، زادت إمكانية تكرار نتائج لفحص الجرح الصفر. استخدام نظم تحليل قوي، يمكن استخدام مجهر فيديو "في حاضنة" تقديم تحليل في الوقت الحقيقي والتلقائي للهجرة الخلية والغزو. الهدف من هذه الورقة هو تقرير ومقارنة فحوصات اثنين المستخدمة في دراسة الخلية الغزو والهجرة: مقايسة الدائرة Boyden وأمثل في المختبر فيديو المستندة إلى مجهر الصفر الجرح المقايسة.
Introduction
غزو الخلية والهجرة تشارك في نشر الخلايا السرطانية، التي هي السبب الرئيسي لمقاومة للعلاج1 ويمكن أن تؤدي إلى لوكوريجيونال أو تكرار المنتشر بعد علاج السرطان2. المرحلة الانتقالية الظهارية الوسيطة (EMT) هو عملية الهجرة غزو الخلية فيها السرطان في خلايا التبديل من الظهارية إلى النمط الظاهري الوسيطة الأولى. ﻫ-كادهيرين علامة خارج الخلية الظهارية النمط الظاهري3، والتعبير زيادة N-كادهيرين وفيمنتين من سمات النمط الظاهري الوسيطة4. الهجرة يتوقف أيضا على قدرة الخلايا السرطانية المتأصلة لغزو المصفوفة خارج الخلية (ECM) من خلال عمل مصفوفة ميتالوبروتيسيس5.
لقد وصف هذا الغزو – الهجرة وآلية للسرطان في العديد من المواقع، لا سيما في سرطان الرأس والرقبة6. وركزت العديد من الباحثين في عمليات الهجرة والغزو فهم أفضل لكيفية نشر الخلايا السرطانية على أمل أن تؤدي هذه المعرفة إلى استراتيجيات جديدة للعلاج. من الأهمية بمكان أن هذه الدراسات تتم باستخدام فحوصات موثوقة واستنساخه.
تحليل في المختبر لحركية الخلية يمكن أن يكون تحديا. وضعت منذ سنوات عديدة، يعتبر فحص الدائرة Boyden لتكون معياراً لغزو – الهجرة التحليل7. ومع ذلك، فإنه مضيعة للوقت وغير دقيقة في كثير من الأحيان. اختبار ثاني هو التئام المقايسة8، الذي ينطوي على صنع الصفر على ثقافة أحادي الطبقة خلية، والتقاط الصور لغزو الخلية والهجرة في فترات زمنية محددة. وقد انتقد هذا الأسلوب على نطاق واسع بسبب الاختلافات الكبيرة بين نتائج الاختبارات المتتالية اثنين. ومع ذلك، تطبيق التكنولوجيات الحديثة، ولا سيما في الفحص المجهري، تحسنت إمكانية تكرار نتائج لفحص الجرح الصفر. ويمكن بسهولة إدخال في حاضنات مجاهر الفيديو ويمكن توليد الصور في الوقت الحقيقي للهجرة الخلية. تسجيل بيانات المجهري هذه الأجهزة وتقديم التحليل التلقائي لالتقاء الخلية الجرح على مر الزمن. الهدف من هذه الورقة هو وصف المقايسة الدائرة Boyden والمقايسة الجرح الصفر الأمثل، ومناقشة مزايا ونقاط الضعف في كل نهج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: فحوصات Boyden الدائرة ونقطة الصفر دون إدراج إدارة المحتوى في المؤسسة يشار إلى المقايسة الهجرة، وفحوصات نفسه مع إدارة المحتوى في المؤسسة يشار إلى المقايسة الغزو.
1-Boyden غرفة الفحص
ملاحظة: هذا البروتوكول تكييف لخط الخلية SQ20B، الذي يستمد من سرطان الحنجرة متكررة الرأس والعنق الخلايا الحرشفية (HNSCC) وتم الحصول عليها من جون قليلاً (بوسطن، ماجستير، الولايات المتحدة الأمريكية).
1 يوم
-
خلية البذر
- بذور 2 106 SQ20B الخلايا في 12 مل من الثقافة المتوسطة (سم) قارورة2 175 سم ح 72 قبل يوم واحد والسماح للخلايا أن تنمو إلى التقاء الخلية 80%.
- لتحضير سم لخلايا SQ20B، الملحق تعديل النسر المتوسطة دولبيكو (دميم) مع 10% مصل العجل الجنين (FCS) والهيدروكورتيزون 0.04 ملغ/مل 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 0.1 غرام/لتر.
- تحت غطاء الاندفاق الصفحي، تريبسينيزي الخلايا. إزالة المتوسطة وتغسل الخلايا مع المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS)، وإضافة 2.5 مل حمض الإيثيلين التربسين (يدتا) (0.5 غرام/لتر). احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ومن ثم إيقاف رد فعل بإضافة مل 12.5 سم استعد إلى 37 درجة مئوية. حساب عدد الخلايا باستخدام عداد خلايا.
- بذور الخلايا في قارورة 25 سم2 في كثافة خلية 6 105 خلايا لكل حالة يتم تقييمها. احتضان الخلايا ل 24 ح مل 3 سم.
- بذور 2 106 SQ20B الخلايا في 12 مل من الثقافة المتوسطة (سم) قارورة2 175 سم ح 72 قبل يوم واحد والسماح للخلايا أن تنمو إلى التقاء الخلية 80%.
2 يوم
-
خلية الموت جوعاً، وإعداد الدوائر المغلفة
- تجويع الخلايا بالاستعاضة عن المتوسط في كل قارورة مع 3 مل من المصل البقري منخفض الجنين (FBS) المتوسطة باستخدام 0.1% ألبومين المصل البقري (BSA) بدلاً من FBS. تجويع الخلايا ح 24 في الحاضنة.
- لإعداد المجاعة سم (s-سم)، الملحق دميم مع جيش صرب البوسنة 0.1% والهيدروكورتيزون 0.04 ملغ/مل 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 0.1 غرام/لتر.
- لفحص الهجرة، انتقل إلى الخطوة 1، 3.
- للمقايسة الغزو، ح 12 قبل يوم 3، إعداد الدوائر Boyden المغلفة بإضافة 500 ميكروليتر ق سم لكل دائرة المغلفة. استخدام الدوائر Boyden المغلفة المعدة تجارياً والاحتفاظ بها عند 4 درجة مئوية قبل الاستخدام. ضع كل دائرة Boyden في لوحة رفيق ووضعه في الحضانة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تجويع الخلايا بالاستعاضة عن المتوسط في كل قارورة مع 3 مل من المصل البقري منخفض الجنين (FBS) المتوسطة باستخدام 0.1% ألبومين المصل البقري (BSA) بدلاً من FBS. تجويع الخلايا ح 24 في الحاضنة.
3 يوم
-
خلية البذر في قاعة Boyden
- استخدم لوحة رفيق لإعداد تشيمواتراكتانت. ملء كل من لوحة رفيق 24-جيدا مع ميكروليتر 750 من المتوسطة كاملة مع 10% FBS الهيدروكورتيزون 0.04 ملغ/مل، 100 مل/يو البنسلين وستربتوميسين 0.1 غرام/لتر.
- تكييف تشيمواتراكتانت لكل خط الخلية وكل شرط المعاملة. لإعداد تشيمواتراكتانت سم (كاليفورنيا-سم)، الملحق دميم مع السفح 10% والهيدروكورتيزون 0.4 ملغ/مل 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 0.1 غرام/لتر.
- تحويل مجلس الشيوخ إلى لوحة رفيق المعبأة، مع الحرص على تجنب الفقاعات.
- للمقايسة الغزو، بعناية إزالة ميكروليتر 450 سم من كل دائرة Boyden.
- تحت غطاء الاندفاق الصفحي، تريبسينيزي الخلايا. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع PBS العقيمة، إضافة 0.5 مل التربسين يدتا (0.5 غرام/لتر)، واحتضان ثم الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. وقف رد الفعل بإضافة سم استعد إلى 37 درجة مئوية. حساب عدد الخلايا باستخدام عداد خلايا.
- الخلايا 3 104 SQ20B البذور في 500 ميكروليتر من 0.1% المتوسطة جيش صرب البوسنة، تعطي إضعاف نهائي 6 104 خلايا/مل.
ملاحظة: ينبغي تكييف تركيز خلية لكل خط الخلية. - ضع اللوحة في الحضانة عند 37 درجة مئوية ح 24.
- استخدم لوحة رفيق لإعداد تشيمواتراكتانت. ملء كل من لوحة رفيق 24-جيدا مع ميكروليتر 750 من المتوسطة كاملة مع 10% FBS الهيدروكورتيزون 0.04 ملغ/مل، 100 مل/يو البنسلين وستربتوميسين 0.1 غرام/لتر.
4 يوم
-
تثبيت الخلية وتلطيخ
- إصلاح الخلايا قبل مضاعفة وقت محدد لأن خط الخلية. إصلاح الخلايا SQ20B قبل 24 ساعة.
- قم بإزالة كل إدراج من لوحة رفيق وعناية الخلايا من الدائرة العليا باستخدام مسحه القطن. من المهم خصوصا لإزالة كافة الخلايا الموجودة في مجلس الشيوخ.
- فيكس ووصمة عار إدراج كل على حدة للحصول على Giemsa جرونوالد أيار التلون9 باستخدام طقم المصبوغة المقدمة. وبدلاً من ذلك، استخدم بارافورمالدهيد 4% في آخر مصاحب لوحة لتثبيت 30 دقيقة.
- الاحتفاظ إدراج في صفيحة فارغة 24-جيدا رفيق تحت غطاء مختبر الجاف لكل دائرة.
يوم 5
-
التحليل المجهري
- إدراج لوحة رفيق مع إدراج على مجهر تباين مرحلة 20 وحساب كل خلية تم ترحيله في الجزء السفلي من الغشاء. تحسين موضع التركيز الحق بتحريك الهدف من الأسفل إلى الأعلى، ووقف الموقف على الجزء السفلي من الغشاء.
- حساب النسبة بين عدد الخلايا التي تم ترحيلها وخلايا المصنف. كل عدد تكرار لكل شرط المعاملة في ثلاث نسخ.
2-الصفر الجرح المقايسة: الهجرة الخلية
ملاحظة: يجب أن تكيف الإرشادات لكل نوع من الخلايا.
1 يوم
-
خلية البذر
- SQ20B البذور 2 × 106 خلايا مل 12 سم قارورة2 175 سم ح 72 قبل يوم واحد، وتسمح للخلايا أن تنمو إلى التقاء الخلية 80%.
- تحت غطاء الاندفاق الصفحي، تريبسينيزي الخلايا. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع PBS العقيمة، وإضافة 2.5 مل التربسين يدتا (0.5 غرام/لتر)، واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. وقف رد الفعل بإضافة مل 12.5 سم استعد إلى 37 درجة مئوية. حساب عدد الخلايا باستخدام عداد خلايا.
- إنشاء عينة بريديلوتيد في كثافة خلية من 4 × 105/mL، إعطاء كثافة نهائي 4 104 خلايا كل ميكروليتر 100 في كل بئر. هذا التركيز يجب تكييفها لكل خط الخلية، وينبغي أن تكون في النطاق من 1 × 104 إلى 6 104 خلايا.
- بذور الخلايا في كل من لوحة 96-جيدا بإيداع ميكروليتر 100 الحل أعد الخطوة 2.1.2 جيدا.
- اترك اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لتفريق الخلايا بالتساوي على الجزء السفلي من الآبار.
- ضع اللوحة في الحاضنة وتسمح للخلايا على التمسك بلوحة ح 12 إلى 16 (الحد الأقصى) عند 37 درجة مئوية.
2 يوم
-
الصفر المقايسة الجرح
- إزالة لوحات إعدادها في الخطوة 2، 1 من الحاضنة.
- تحت غطاء محرك السيارة، جعل جرح باستخدام جهاز إصابة التجارية وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- فورا بإزالة المتوسطة من كل أيضا استخدام ماصة مع تلميح مخروطية تكييفها، مع الحرص على عدم لمس الجرح.
- تغسل الخلايا مرتين بتكرار التطلع واستخدام 100 ميكروليتر من سم استعد إلى 37 درجة مئوية لكل بئر.
- إزالة سم استخدام ماصة مع تلميح مخروطية تكييف بعد خطوات الغسيل.
- إضافة 100 ميكروليتر من المتوسطة المحددة لكل شرط المعاملة لكل بئر.
- في محاولة لتجنب خلق أي فقاعات في الآبار. تقنية بيبيتينج الاتجاه المعاكس قد يكون من المفيد هنا. وبدلاً من ذلك، إزالة الفقاعات بإبرة محقن.
- ضع اللوحة في الرف تكييف المجهر الفيديو.
- لتحسين جودة الصورة، تسمح لوحة الحارة لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الفحص الأولى لتجنب التكثيف في الجانب السفلي من اللوحة.
- برنامج الجدول الزمني للمسح، باستخدام البرمجيات مجهر الفيديو في صورة واحدة كل بئر. مطلوب فاصل 2-ح الحد أقصى لتجربة غزو وهجرة. إذا كان الهدف من هذه التجربة إنتاج شريط فيديو، فاصل زمني قدرة 30 دقيقة كحد أقصى المفضل.
- في نهاية التجربة، تغسل الجهاز مما أدى إلى إصابة بعناية واتبع كل من أربع خطوات الغسيل يتبين من الشركة المصنعة.
أيام 3 و 4 و 5
-
تحليل للهجرة باستخدام مجهر الفيديو
- للحد أدنى من 24 ح ويصل إلى 5 أيام، مراقبة وفحص الهجرة الخلية.
- استخدم قناع خلية مناسبة تكييفها لكل نوع من الخلايا لتحليل الهجرة الخلية. للحصول على قناع خلية المعدلة لكل خط الخلية، إنشاء خلية معالجة تعريف من البرمجيات باستخدام مجموعة صورة خلية محددة.
- تتبع المنحنيات وتصدير البيانات إلى جدول بيانات، التي يمكن استخدامها لتحليل ومقارنة النتائج.
3-الصفر الجرح المقايسة: غزو الخلية
ملاحظة: يجب أن تكيف الإرشادات لكل نوع من الخلايا.
1 يوم
-
خلية البذر
- استخدام البروتوكول نفسه للخلية البذر كما هو موضح في الخطوة 2، 1.
2 يوم
-
إعداد إدارة المحتوى في المؤسسة
- تذويب المصفوفة لمالا يقل عن 12 ح قبل الاستخدام عند 4 درجة مئوية. تأكد من أن المجاميع لا مرئية. إذا كانت المجاميع مرئية، إبقاء المصفوفة في 4 درجات مئوية لفترة أطول حتى تختفي المجاميع. الاحتفاظ بالمصفوفة على الجليد. استخدام تلميحات ماصة بريكوليد.
ملاحظة: المصفوفة سوف يصلب إذا لم تحفظ في 4 درجات مئوية. - تشيل أنابيب ميكروسينتريفوجي على الجليد لمدة 5 دقائق.
- خذ سم تبريده إلى 4 درجات مئوية من الثلاجة وتمييع المصفوفة في أنابيب ميكروسينتريفوجي بريكوليد للحصول على تركيز نهائي 300 ميكروغرام/مل.
- العودة الأنابيب ميكروسينتريفوجي مع مصفوفة بريديلوتيد إلى الثلاجة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: رف تبريد تكييفها لأنابيب ميكروسينتريفوجي مفيد للحفاظ على أنابيب عند 4 درجة مئوية طوال التجربة.
- تذويب المصفوفة لمالا يقل عن 12 ح قبل الاستخدام عند 4 درجة مئوية. تأكد من أن المجاميع لا مرئية. إذا كانت المجاميع مرئية، إبقاء المصفوفة في 4 درجات مئوية لفترة أطول حتى تختفي المجاميع. الاحتفاظ بالمصفوفة على الجليد. استخدام تلميحات ماصة بريكوليد.
2 يوم
-
فحص الجرح الصفر ومعاملة إدارة المحتوى في المؤسسة
- قم بإزالة لوحة إعدادها في الخطوة 3.1 من الحاضنة.
- تحت غطاء محرك السيارة، جعل الجرح باستخدام جهاز إصابة التجارية وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- فورا بإزالة المتوسطة من كل جيدا استخدام ماصة مع تلميح مخروطية تكييفها مع الحرص على عدم لمس الجرح.
- تغسل الخلايا مرتين بتكرار الإجراء الطموح واستخدام 100 ميكروليتر من سم استعد إلى 37 درجة مئوية.
- بعد الغسيل الثاني، ضع اللوحة في حاضنة 4 درجة مئوية حجته درجة الحرارة لمدة 5 دقائق.
- إزالة المتوسطة الباردة من كل بئر مع ماصة تطلع مع تلميح مخروطية، مع الحرص على "الماصة؛" بعناية من الحافة وتجنب لمس الجرح.
- إضافة 50 ميكروليتر من مصفوفة بريديلوتيد لكل بئر باستخدام تلميحات المخروطية بريكوليد في 4 درجات مئوية.
- ضع اللوحة في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: مفيد رف دعم بريوارميد في 37 درجة مئوية للتعجيل بارتفاع درجة حرارة اللوحة 96-جيدا. - إزالة اللوحة من الحاضنة وإضافة 100 ميكروليتر من سم تكييف لكل بئر وكما هو مبين لكل شرط المعاملة.
- في محاولة لتجنب خلق أي فقاعات في الآبار. تقنية بيبيتينج الاتجاه المعاكس قد يكون من المفيد هنا. وبدلاً من ذلك، إزالة الفقاعات بإبرة محقن.
- ضع اللوحة في الرف تكييف في المجهر الفيديو.
- لتحسين جودة الصورة، تسمح لوحة الحارة لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الفحص الأولى لتجنب التكثيف في الجانب السفلي من اللوحة.
- برنامج الجدول الزمني للمسح، باستخدام البرمجيات مجهر الفيديو في صورة واحدة كل بئر، في وضع المسح الضوئي "الصفر الجرح". فاصل 2-ح الحد أقصى في المطلوبة لتجربة غزو وهجرة. إذا كان الهدف من هذه التجربة إنتاج شريط فيديو، فاصل زمني قدرة 30 دقيقة كحد أقصى المفضل.
- في نهاية التجربة، تغسل الجهاز مما أدى إلى إصابة بعناية واتبع كل من أربع خطوات الغسيل يتبين من الشركة المصنعة.
أيام 3 و 4 و 5
-
تحليل لغزو الخلية باستخدام مجهر فيديو.
- كرر الخطوة 2، 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن تقرير هنا طريقتين مختلفتين لتحليل الخلية الغزو والهجرة. ويبين الشكل 1 Boyden تجربة الدائرة. إدراج توضع في لوحة رفيق مع المتوسطة تشيمواتراكتانت، والخلايا التي تبذر في سم. يمكن أن يكون الغشاء غير المصقول (مقايسة الهجرة) أو المغلفة (مقايسة الغزو). هي خلايا المصنف إلى مجلس الشيوخ في ق سم. مجلس النواب مليئة سم تشيمواتراكتانت. الخلايا ثابتة قبل وقت مضاعفة.
ويبين الشكل 2 الغشاء Boyden بعد تثبيت الخلية. ويبين الشكل 2 ألف نتيجة دون المستوى الأمثل، مع مجموعات الخلايا على الجانب العلوي من الغشاء. يظهر الشكل 2B نتيجة مثلى مع الخلايا الثابتة والملون باللون الأزرق على الغشاء.
ويبين الشكل 3 نتيجة مثلى لفحص الجرح الصفر. يمكن رؤية الجرح الخطي في الشكل 3 ألف. ولوحظت أي من الخلايا في الجرح، والتئام الجروح قد حدث ضمن ح 30. الوقت لالتئام الجرح اعتماداً على خط الخلية وتتراوح من 24 إلى ح 50.
الشكل 3B تمثيل رسومي للجرح شفاء تحت أربعة شروط المعاملة: التحكم وابت-199 (مكافحة-Bcl-2)، سيتوكسيماب (مكافحة-EGFR) وابت-199 + سيتوكسيماب. أبت-199 + تركيبة سيتوكسيماب تناقص الهجرة الخلية. المنحنيات يتم الحصول عليها باستخدام مجهر الفيديو البرمجيات، التي تنص على تحليل بيانات قوية للهجرة الخلية مع مرور الوقت. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (SD) لكل بئر.
التقاء تسعين في المئة من كثافة الخلية المثلى للانزيم التئام الجروح. بذر خلية الأمثل يعتمد على خط الخلية ويتراوح من 3 × 104 إلى 6 × 104 خلايا. الشكل 4A يبين كثافة الخلية المثلى، و ويبين الشكل 4 خلية منخفضة الكثافة. الآبار يجب غسلها مرتين لتجنب مجموعات الخلايا، كما هو موضح في الشكل 4 باء.
رقم 1: التمثيل التخطيطي لتجربة الدائرة Boyden. إدراج توضع في لوحة رفيق مع المتوسطة تشيمواتراكتانت، والخلايا التي تبذر في سم. يمكن أن يكون الغشاء غير المصقول (A) أو المغلفة (ب).
رقم 2: الحصول على نتائج مجهرية دون المستوى الأمثل والأمثل في تجربة الدائرة Boyden. (أ) غشاء الأمثل مع كتل الخلايا على الجانب العلوي من الغشاء والنتائج أونينتيربريتابل. شريط المقياس = غشاء الأمثل 300 ميكرون. (ب) مع عد الخلايا الموجودة في الجزء السفلي من الغشاء الملون باللون الأزرق. شريط المقياس = 300 ميكرون.
الشكل 3: الحصول على نتائج مثلى في التجربة التئام. (أ) صورة تمثيلية من مقايسة الجرح الصفر سيظهر التئام لاحظ في 0, 15 و 30 ح. المعايير لتجربة نوعية جرح خطي، لا أجزاء الخلية ولاحظ في الجرح، والتقاء الخلية أمثل. شريط المقياس = 300 ميكرون. (ب) تمثيل رسومي التئام عرض التحديد الكمي للمعلمات من الجرح خلية التقاء (النسبة المئوية) طبقاً للوقت (ح). ويتم تحليل أربعة شروط المعاملة هنا، وتظهر البيانات بالتنمية المستدامة.
الشكل 4: الحصول على نتائج دون المستوى الأمثل في التجربة التئام. (أ) كثافة الخلية مثالية. (ب) مشاكل الغسيل بيليه الخلية. (ج) خلية منخفضة الكثافة. تغيير حجم أشرطة = 300 ميكرون
| مزايا | العيوب | |
| تجربة الدائرة Boyden | --3D-خلية إنزيمية | -تستغرق وقتاً طويلاً |
| -كل من الغزو والهجرة مع مصفوفة الطبقة المغلفة وغير المغلفة | -تدني إمكانية تكرار نتائج | |
| -إدراج غالية | ||
| --أي استكشاف الوقت الفاصل بين | ||
| -الحاجة إلى الخلايا ملتصقة | ||
| التئام الجروح بالانزيم | --التلقائية استنساخه بشدة الجرح | -حركية 2D-الخلية |
| -كل من الغزو والهجرة مع مصفوفة الطبقة المغلفة وغير المغلفة | -الحاجة إلى الخلايا ملتصقة | |
| -انتشار الخلايا المدرجة في التحليل | ||
| -الوقت الفاصل بين التحليل المرئي مجهرية | ||
| -بيانات تصدير مقاييس الجرح الشفاء مع تحليل دقيق | ||
| -المعالجة اللاحقة البرامج القوية للمنحنيات الهجرة وغزو الخلية |
الجدول 1: مزايا وعيوب Boyden الدائرة التجربة ومجهر الفيديو التئام المقايسة. مزايا وعيوب الدائرة Boyden التجربة والصفر الجرح المقايسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن تقرير هنا هما طرائق مختلفة لدراسة عملية الغزو والهجرة الخلية. تحليل هذه العملية مهم لفهم العوامل التي تنطوي عليها في تكرار المنتشر، الذي قد يفسر بزيادة حركية من يتدنى الخلايا السرطانية يسمى سرطان الخلايا الجذعية البالغة10،11.
تجربة الدائرة Boyden أحد الأكثر استخداماً تقنيات استكشاف الخلية الغزو والهجرة. ميزة واحدة لهذا النهج هو في إمكانية تكرار نتائج، على الرغم من أن هذا الأسلوب يعتمد اعتماداً كبيرا على خبرة المجرب. خلية العد اليدوي ويمكن أن تختلف بين المجربون. ويجب توحيد العديد من الخطوات الحاسمة واتباعها بعناية، مثل ضمان استخدام المتوسط تشيمواتراكتانت والتجويع مناسبة محددة لكل خط الخلية. إزالة خلايا من الغشاء العلوي مع مسحه القطن ضروري أيضا لضمان تحقيق أفضل النتائج وتجنب نتائج دون المستوى الأمثل هو مبين في الشكل 2 ألف. إذا تم استخدام هذا الفحص لتقييم حركية الخلية، والغزو، وقدرات الهجرة عن طريق غشاء مسامية (3D) ثلاثي الأبعاد، من غير الممكن لتعقب الخلايا من خلال تجربة مرور الزمن. وعلاوة على ذلك، إدراج التجارية مع غشاء مسامية غالباً ما تكون باهظة الثمن.
مقايسة الفيديو المستندة إلى مجهر الجرح الصفر المعروضة هنا تقنية قوية لتقييم الهجرة الخلية والغزو. يتم تنفيذها مع صانع جرح ميكانيكية المقايسة ويوفر استنساخه بمقارنة بين ظروف المعاملة. يمكن استخدام التحليل المجهري الفيديو لتوليد بيانات كمية دقيقة لالتقاء الجرح الشفاء والخلية من خلال تجربة مرور الزمن. وقت لتحليل ظروف معاملة مختلفة يمكن أن تؤكده الملاحظات المجهرية. يدمج تكاثر الخلايا أثناء الفحص هذا التحليل ويأخذ في الاعتبار الوقت مضاعفة الخلية. يمكن تصدير الفيديو أو محتوى البيانات الخام للحصول على تمثيل مرئي جداً للنتائج، كما هو موضح في المنحنيات الهجرة الخلية في الشكل 3B.
العديد من الخطوات الأساسية المطلوبة للحصول على نتائج التفسير. الظروف المثلى لخلية البذر اعتماداً على خط الخلية ويجب اختبار مع تخفيف مختلفة للحصول على التقاء الخلية 90% في الآبار. للحصول على جرح خطية، يجب إلا تتجاوز طلاء الخلية ح 16. يجب أن يتم خطوة الغسيل مرتين وبسرعة لتجنب إدخال خلية الحطام في الجرح الذي يمكن أن يغير النتائج. للجرح الصفر الغزو، المناسب من الرعاية إدارة المحتوى في المؤسسة أيضا خطوة حاسمة. معدلات التبريد يجب أن تكون ثابتة، وينبغي معالجته مع نصائح ماصة مثلجة إدارة المحتوى في المؤسسة والحفاظ على 4 درجة مئوية.
هذه التقنيات لها العديد من المزايا، التي يرد موجز لها في الجدول 1. خلايا ملتصقة مطلوبة لهذا الأسلوب. الخدش أسباب الضرر الميكانيكي للخلايا، مما يسبب الإفراج عن المحتويات الخلوية في المتوسط المحيطة وقد تؤثر على عملية الهجرة. فحص الجرح الصفر يوفر تقدير حركية الخلية 2D لكن ليس به الخلية، التي لا يمكن دراستها باستخدام هذا الأسلوب. وقد وضعنا مؤخرا مقايسة إنزيمية المجهري فيديو استخدام نظام طلاء تجاري. يحتاج هذا الفحص الخلايا مع قدرة عالية من هجرة، مثل الخلايا الجذعية السرطانية، كما هو موضح سابقا12. هذا الأسلوب الجديد قد أصبح معيار الذهب لفحوصات الغزو والهجرة في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ووضعت هذه التقنيات بالدعم من "يعبي لابيكس" (ANR-11-لابكس-0063)، خطة الافتتاح-إيتا-منطقة (كبير) في إطار علمي ايتوال (كبير 2009-2013)، وغنائي الإنكا المنح-دجوس-4664.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
