Summary
Cette étude rend compte de deux méthodes différentes pour l’analyse de l’invasion cellulaire et migration : le test de chambre de Boyden et l’essai in vitro vidéo axée sur le microscope cicatrisation avec. Les protocoles de ces deux expériences sont décrites, et leurs avantages et leurs inconvénients sont comparés.
Abstract
Les capacités d’invasion et de la migration des cellules tumorales sont les principaux contributeurs à la progression du cancer et de la récurrence. De nombreuses études ont exploré les capacités de migration et invasion de comprendre comment les cellules cancéreuses diffusent, dans le but de développer de nouvelles stratégies de traitement. Analyse des fondements cellulaires et moléculaires de ces capacités a conduit à la caractérisation de la mobilité de la cellule et les propriétés physico-chimiques du cytosquelette et microenvironnement cellulaire. Pendant de nombreuses années, le test de chambre de Boyden et le dosage zéro blessure ont été les techniques standards d’étudier la migration et l’invasion des cellules. Toutefois, ces deux techniques ont des limites. L’essai de chambre de Boyden est longue et difficile, et le dosage zéro blessure a faible reproductibilité. Développement des technologies modernes, notamment en microscopie, a augmenté la reproductibilité du dosage zéro blessure. À l’aide de systèmes d’analyse puissants, un microscope video de « en-incubateur » peut être utilisé pour fournir une analyse automatique et en temps réel de la migration cellulaire et l’invasion. L’objectif de cette communication est de déclarer et de comparer les deux essais utilisés pour étudier l’invasion cellulaire et migration : le dosage de chambre de Boyden et une optimisée en vitro vidéo axée sur le microscope scratch enroulés dosage.
Introduction
Migration et invasion des cellules sont impliqués dans la dissémination des cellules cancéreuses, qui est la principale cause de la résistance au traitement1 et peuvent conduire à locorégional ou récidive métastatique après traitement de cancer2. La transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) est le processus initial de la migration-invasion cellulaire dans lequel le cancer cellules passer d’un épithélium à un phénotype mésenchymateux. E-cadhérine est un marqueur extracellulaire du phénotype épithéliales3, et une expression accrue de la N-cadhérine et la vimentine est caractéristique du phénotype mésenchymateuses4. Migration dépend aussi de la capacité intrinsèque des cellules cancéreuses à envahir la matrice extracellulaire (ECM) sous l’action des métalloprotéases de matrice5.
Ce mécanisme d’invasion – migration a été décrite pour le cancer dans de nombreux endroits, notamment dans la tête et du cou, du cancer6. De nombreux chercheurs ont mis l’accent sur les processus de migration et invasion de mieux comprendre comment les cellules cancéreuses diffusent dans l’espoir que cette connaissance conduira à nouvelles stratégies de traitement. Il est crucial que ces études sont réalisées à l’aide de tests fiables et reproductibles.
L’analyse in vitro de la motilité cellulaire peut être difficile. Mis au point il y a de nombreuses années, le test de chambre de Boyden est considéré comme la norme pour l’invasion – migration analyse7. Cependant, il prend beaucoup de temps et est souvent inexacte. Un deuxième essai est la cicatrisation test8, qui consiste à faire une égratignure sur la culture cellulaire monocouche et capturer des images de l’invasion cellulaire et migration à intervalles de temps fixes. Cette technique a été largement critiquée en raison des grandes variations entre les résultats de deux tests successifs. Cependant, l’application des technologies modernes, notamment en microscopie, a amélioré la reproductibilité du dosage zéro blessure. Microscopes vidéo peuvent être facilement introduits en couveuse et peuvent générer des images en temps réel de la migration cellulaire. Ces appareils enregistrent des données microscopiques et fournissent une analyse automatique de confluence cellulaire plaie au fil du temps. Cet article vise à décrire le test de chambre de Boyden et le dosage optimisé plaie de grattage et de discuter les avantages et les faiblesses de chaque approche.
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Protocol
Remarque : Les dosages de chambre et d’éraflure de Boyden sans inclusion de l’ECM sont appelés le test de migration, et les mêmes dosages avec l’ECM est dénommé le dosage de l’invasion.
1. Boyden chambre Assay
Remarque : Ce protocole est adapté pour la cellule SQ20B, qui est dérivé d’un cancer laryngé récurrent, tête et cou Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) et a été obtenue de John Little (Boston, MA, USA).
Jour 1
-
Cellule de semis
- Graine 2 106 SQ20B cellules dans 12 mL de milieu de culture (CM) dans une fiole de2 175 cm 72 h avant le premier jour et laisser les cellules à confluence de cellule de 80 %.
- Pour préparer les cellules SQ20B CM, Supplément le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de sérum de veau foetal (FCS), hydrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL de pénicilline et la streptomycine 0,1 g/L.
- Sous une hotte à flux laminaire, trypsinize les cellules. Enlever le milieu, laver les cellules avec stérile solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ajouter 2,5 mL de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (0,5 g/L) de la trypsine. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C et puis arrêter la réaction en ajoutant 12,5 mL de CM chauffé à 37 ° C. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
- Les semences des cellules dans une fiole de2 25 cm à une densité cellulaire des cellules5 6 10 pour chaque condition à évaluer. Incuber les cellules pendant 24 h dans 3 mL de CM.
- Graine 2 106 SQ20B cellules dans 12 mL de milieu de culture (CM) dans une fiole de2 175 cm 72 h avant le premier jour et laisser les cellules à confluence de cellule de 80 %.
Jour 2
-
Famine de cellules et préparation des chambres à couché
- Affamer les cellules en remplaçant le milieu dans chaque fiole avec 3 mL de milieu de sérum basse-fœtal (SVF) à l’aide de 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) au lieu de FBS. Affamer les cellules pendant 24 h dans l’incubateur.
- Pour préparer la famine CM (s-CM), Supplément DMEM avec 0,1 % de BSA, hydrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 0,1 g/L.
- Pour le test de migration, passez à l’étape 1.3.
- Pour le dosage de l’invasion, 12 h avant le jour 3, préparer les chambres Boyden couchés en ajoutant 500 μL de s-CM à chaque chambre couché. Utilisation préparés commercialement enduit Boyden chambers et les conserver à 4 ° C avant utilisation. Placer chaque chambre de Boyden dans la plaque de compagnon et mettez-le dans l’incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
- Affamer les cellules en remplaçant le milieu dans chaque fiole avec 3 mL de milieu de sérum basse-fœtal (SVF) à l’aide de 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) au lieu de FBS. Affamer les cellules pendant 24 h dans l’incubateur.
Jour 3
-
Cellule de semis dans la chambre de Boyden
- La plaque de compagnon permet de préparer le facteur chimiotactique. Remplir chaque puits de la plaque 24 puits compagnon avec 750 μl de milieu complet avec 10 % FBS, hydrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 0,1 g/L.
- Adapter le facteur chimiotactique pour chaque ligne de la cellule et chaque condition de traitement. Pour préparer le facteur chimiotactique CM (ca-CM), Supplément DMEM avec 10 % FCS, hydrocortisone de 0,4 mg/mL, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 0,1 g/L.
- Transvaser la chambre supérieure dans la plaque de compagnon préremplie, en prenant soin d’éviter les bulles.
- Pour le dosage de l’invasion, retirez soigneusement 450 μL de CM dans chaque chambre de Boyden.
- Sous une hotte à flux laminaire, trypsinize les cellules. Enlever le milieu, laver les cellules avec du PBS stérile, ajouter 0,5 mL de trypsine EDTA (0,5 g/L) et puis incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C. Arrêter la réaction en ajoutant CM chauffé à 37 ° C. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
- Les semences 3 104 SQ20B cellules de 500 μl de milieu de 0,1 % de BSA, donnant une dilution finale de 6 104 cellules/mL.
NOTE : Il convient d’adapter la concentration cellulaire de chaque lignée cellulaire. - Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C pendant 24 h.
- La plaque de compagnon permet de préparer le facteur chimiotactique. Remplir chaque puits de la plaque 24 puits compagnon avec 750 μl de milieu complet avec 10 % FBS, hydrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 0,1 g/L.
Jour 4
-
Fixation de la cellule et coloration
- Fixer les cellules avant le temps de doublement spécifique à cette lignée de cellules. Difficulté SQ20B cellules avant 24h.
- Retirer chaque insert de la plaque de compagnon et retirer délicatement les cellules de la chambre haute à l’aide d’un coton-tige. Il est particulièrement important d’éliminer toutes les cellules situées dans la chambre haute.
- Difficulté et colorer chaque insert individuellement pour obtenir mai-Grunwald Giemsa coloration9 à l’aide de la trousse de coloration fournie. Alternativement, utilisez paraformaldéhyde à 4 % dans une autre plaque de compagnon pour une fixation de 30 min.
- Garder les insertions dans une assiette vide 24 puits compagnon sous une hotte de laboratoire à sécher chaque chambre.
Jour 5
-
Analyse au microscope
- Insérer la plaque de compagnon avec les inserts sur un microscope à contraste de phase 20 et compter chaque cellule migré sur la partie inférieure de la membrane. Optimiser la position de foyer droite en déplaçant l’objectif du bas vers le haut et la position de cuisson sur la partie inférieure de la membrane.
- Calculer le ratio entre le nombre de cellules migrés et cellules ensemencées. Répétez chaque chef d’accusation pour chaque condition de traitement en trois exemplaires.
2. zéro blessure Assay : La Migration cellulaire
Remarque : Les Instructions doivent être adaptées pour chaque type de cellule.
Jour 1
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Cellule de semis
- Graine 2 x 106 SQ20B cellules dans 12 mL de CM dans une fiole de2 175 cm 72 h avant le premier jour et laisser les cellules à confluence de cellule de 80 %.
- Sous une hotte à flux laminaire, trypsinize les cellules. Enlever le milieu, laver les cellules avec du PBS stérile, ajouter 2,5 mL de trypsine EDTA (0,5 g/L) et incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C. Arrêter la réaction en ajoutant 12,5 mL de CM chauffé à 37 ° C. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
- Générer un échantillon dilué à une densité de 4 x 105/ml, ce qui donne une densité finale de 4 104 cellules par 100 μl à chaque puits. Cette concentration doit être adaptée pour chaque lignée cellulaire et devrait être de l’ordre de 1 x 104 6 104 cellules.
- Cellules de semences dans chaque puits d’une plaque 96 puits de dépôt 100 μL de la solution préparée à l’étape 2.1.2.
- Laisser la plaque à température ambiante pendant 5 min disperser les cellules uniformément sur le fond des puits.
- Placer la plaque dans l’incubateur et de permettre aux cellules d’adhérer à la plaque pour 12 à 16 h (maximum) à 37 ° C.
Jour 2
-
Gratter la plaie dosage
- Enlever les plaques préparées à l’étape 2.1 de l’incubateur.
- Sous le capot, faire une blessure en utilisant le dispositif commercial blessant selon le protocole du fabricant.
- Retirez immédiatement le milieu de chaque bien en utilisant une pipette avec une pointe conique adaptée, en prenant soin de ne pas pour toucher la plaie.
- Laver les cellules deux fois en répétant l’aspiration en utilisant 100 μL de CM chauffé à 37 ° C pour chaque puits.
- Enlevez le CM à l’aide d’une pipette avec une pointe conique adaptée après les étapes de lavage.
- Ajouter 100 μl de milieu spécifique pour chaque condition de traitement dans chaque puits.
- Essayez d’éviter de créer des bulles dans les puits. Une technique de pipetage inverse peut être utile ici. Vous pouvez également enlever les bulles avec une aiguille de seringue.
- Placer la plaque dans le rack adapté du microscope vidéo.
- Afin d’améliorer la qualité de l’image, laissez la plaque au chaud pendant au moins 15 minutes avant que le premier balayage pour éviter la condensation sur la face inférieure de la plaque.
- Programme de la planification des analyses, en utilisant le logiciel de vidéo microscope à une seule image par puits. Il faut un intervalle de 2 h maximum pour une expérience de l’immigration-invasion. Si l’objectif de l’expérience est de produire une vidéo, un intervalle de 30 min maximum est préféré.
- À la fin de l’expérience, laver l’appareil blessant soigneusement et suivre chacune des quatre étapes de lavage indiquées par le fabricant.
Jours 3, 4 et 5
-
Analyse de la migration à l’aide du microscope vidéo
- Pour un minimum de 24 h et jusqu'à 5 jours, surveiller et vérifier la migration cellulaire.
- Un masque de cellule approprié adapté pour chaque type de cellule permet d’analyser la migration cellulaire. Pour obtenir un masque cellulaire adapté pour chaque lignée cellulaire, générer une cellule traitement définition tirée du logiciel à l’aide d’une collection d’images de cellules spécifiques.
- Tracer les courbes et exporter les données dans une feuille de calcul, qui peut être utilisé pour analyser et comparer les résultats.
3. zéro blessure Assay : Invasion des cellules
Remarque : Les Instructions doivent être adaptées pour chaque type de cellule.
Jour 1
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Cellule de semis
- Utiliser le même protocole pour cellule semis comme indiqué au point 2.1.
Jour 2
-
Préparation de l’ECM
- Décongeler la matrice pendant au moins 12 h avant de l’utiliser à 4 ° C. S’assurer qu’aucun agrégat n’est visibles. Si les agrégats sont visibles, garder la matrice à 4 ° C pendant une période prolongée jusqu'à disparaissent des agrégats. Garder la matrice sur la glace. Utiliser des pointes de pipette jetable.
Remarque : La matrice consolidera sinon conservés à 4 ° C. - Faites refroidir les tubes de microcentrifuge sur glace pendant 5 min.
- Prenez CM refroidi à 4 ° C du réfrigérateur et diluer la matrice dans les tubes de microcentrifuge rafraîchies pour obtenir une concentration finale de 300 μg/mL.
- Retourner les tubes de microcentrifuge avec matrice calibrant au réfrigérateur à 4 ° C.
Remarque : Une grille adaptée pour les tubes de microcentrifuge est utile pour maintenir les tubes à 4° C tout au long de l’expérience.
- Décongeler la matrice pendant au moins 12 h avant de l’utiliser à 4 ° C. S’assurer qu’aucun agrégat n’est visibles. Si les agrégats sont visibles, garder la matrice à 4 ° C pendant une période prolongée jusqu'à disparaissent des agrégats. Garder la matrice sur la glace. Utiliser des pointes de pipette jetable.
Jour 2
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Dosage zéro blessure et le traitement de l’ECM
- Retirez la plaque préparée à l’étape 3.1 de l’incubateur.
- Sous le capot, faites la plaie en utilisant le dispositif commercial blessant selon le protocole du fabricant.
- Retirez immédiatement le milieu de chaque bien en utilisant une pipette avec une pointe conique adaptée prenant soin de ne pas pour toucher la plaie.
- Laver les cellules deux fois en répétant la procédure d’aspiration en utilisant 100 μL de CM chauffé à 37 ° C.
- Après le deuxième lavage, placer la plaque sur l’incubateur de 4 ° C à équilibrer sa température pendant 5 min.
- Enlever le milieu froid de chaque puits avec la pipette d’aspiration avec une pointe conique, en prenant soin de Pipetter soigneusement le bord et pour éviter de toucher la plaie.
- Ajouter 50 μL de matrice pré-dilué dans chaque puits à l’aide de pointes coniques rafraîchies à 4 ° C.
- Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C pendant 30 min.
Remarque : Une grille de soutien préchauffée à 37 ° C est utile pour accélérer le réchauffement de la plaque à 96 puits. - Retirez la plaque de l’incubateur et ajouter 100 μL de la CM adaptée à chaque puits comme il est indiqué pour chaque condition de traitement.
- Essayez d’éviter de créer des bulles dans les puits. Une technique de pipetage inverse peut être utile ici. Vous pouvez également enlever les bulles avec une aiguille de seringue.
- Placer la plaque dans le rack adapté dans le microscope vidéo.
- Afin d’améliorer la qualité de l’image, laissez la plaque au chaud pendant au moins 15 minutes avant que le premier balayage pour éviter la condensation sur la face inférieure de la plaque.
- Programmer l’horaire de numérisations, utilisant le logiciel de vidéo microscope à une seule image par puits, dans le mode de balayage Scratch enroulés. Un intervalle de 2 h maximum dans requis pour une expérience de l’immigration-invasion. Si l’objectif de l’expérience est de produire une vidéo, un intervalle de 30 min maximum est préféré.
- À la fin de l’expérience, laver l’appareil blessant soigneusement et suivre chacune des quatre étapes de lavage indiquées par le fabricant.
Jours 3, 4 et 5
-
Analyse d’invasion des cellules à l’aide d’un microscope vidéo.
- Répétez l’étape 2.3.
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Representative Results
Nous présentons ici deux méthodes différentes pour analyser les migrations et l’invasion des cellules. La figure 1 montre la Boyden expérience en chambre. Les inserts sont placées dans une assiette de compagnon avec chemoattractant moyen, et les cellules sont ensemencées en CM. La membrane peut être non couchée (test de migration) ou couché (dosage de l’invasion). Les cellules sont ensemencées dans la chambre haute en s-CM. La chambre basse est remplie de CM comme un facteur chimiotactique. Les cellules sont fixées avant le temps de doublement.
La figure 2 illustre la membrane Boyden après fixation de la cellule. Figure 2 a montre un résultat sous-optimal, avec des grappes de cellules sur la face supérieure de la membrane. Figure 2 b montre un résultat optimal avec les cellules fixées et colorées en bleu sur la membrane.
La figure 3 montre un résultat optimal du dosage zéro blessure. La plaie linéaire peut être vu dans la Figure 3 a. Aucune des cellules ne sont observées dans la plaie, et la cicatrisation s’est produite dans les 30 h. Le temps de guérir la plaie est dépendant de la lignée cellulaire et varie de 24 à 50 h.
Figure 3 b est une représentation graphique de la cicatrisation sous quatre conditions de traitement : contrôle, ABT-199 (anti-Bcl-2), le cetuximab (anti-EGFR) et ABT-199 + cetuximab. L’ABT-199 + cetuximab combinaison diminue significativement la migration cellulaire. Les courbes sont obtenues en utilisant le logiciel vidéo microscope, qui fournit une analyse des données fiables de la migration cellulaire avec le temps. Barres d’erreur représentent l’écart-type (SD) pour chaque puits.
Quatre-vingt-dix pour cent de confluence est la densité cellulaire optimal pour le dosage de la cicatrisation. L’ensemencement de la cellule optimale dépend de la lignée cellulaire et varie de 3 x 104 à 6 x 104 cellules. Figure 4 a montre la densité cellulaire optimal, et Figure 4 montre la densité cellulaire faible. Puits doivent être lavés deux fois pour éviter les amas de cellules, comme le montre la Figure 4 b.
Figure 1 : représentation schématique de l’expérience de chambre de Boyden. Insertions sont placées dans une assiette de compagnon avec chemoattractant moyen, et les cellules sont ensemencées en CM. La membrane peut être non couché (A) ou couché (B).
Figure 2 : résultats microscopiques sous-optimal et optimales obtient dans l’expérience de chambre de Boyden. (A) sous-optimale membrane avec des agrégats cellulaires sur la face supérieure de la membrane et résultats ininterprétables. Echelle = 300 µm. (B) membrane Optimal avec cellules dénombrables dans la partie inférieure de la membrane colorée en bleu. Echelle = 300 µm.
Figure 3 : résultats optimaux obtient dans l’expérience de la cicatrisation. (A) image représentative de l’essai de zéro blessure montré la cicatrisation observée à 0 et 15 h 30. Les critères pour une expérience de qualité sont une plaie linéaire, aucun fragment de cellule n’observée dans la plaie et le confluent de la cellule optimale. Echelle = 300 µm. (B) représentation graphique de la cicatrisation des plaies montrant la quantification des paramètres de confluence de cellule de plaie (pourcentage) fonction de l’heure (h). Quatre conditions de traitement sont analysées ici, et les données sont indiquées avec la SD
Figure 4 : résultats sous-optimaux obtient dans l’expérience cicatrisation. Densité cellulaire idéal (A). (B) problèmes de laver le culot cellulaire. Densité cellulaire faible (C). Barreaux de l’échelle = 300 µm
| Avantages | Inconvénients | |
| Expérience en chambre Boyden | -3D-cellule chimiotactisme | -Beaucoup de temps |
| -Invasion et migration avec matrice de calque couché et non couché | -Faible reproductibilité | |
| -Inserts chers | ||
| -Aucune exploration Time-lapse | ||
| -Nécessité de cellules adhérentes | ||
| La cicatrisation de dosage | -Automatique hautement reproductible enroulé | -Motilité cellulaire-2D |
| -Invasion et migration avec matrice de calque couché et non couché | -Nécessité de cellules adhérentes | |
| -Incluse dans l’analyse de la prolifération de cellules | ||
| -Analyse visuelle microscopique Time-lapse | ||
| -Exportation de données des mesures curatives plaie avec analyse précise | ||
| -Post-traitement logiciel robuste pour les courbes de migration et invasion cellulaire |
Tableau 1 : avantages et inconvénients de la Boyden chambre experiment et dosage de cicatrisation microscope video. Les avantages et les inconvénients de la chambre de Boyden experiment et zéro blessure dosage.
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Discussion
Nous rapportons deux modalités différentes d’étudier le processus d’invasion et de la migration des cellules. L’analyse de ce processus est importante pour comprendre les facteurs de récidive métastatique, qui pourrait s’expliquer par la motilité accrue d’une sous-population de cellules cancéreuses appelé cancer cellules souches10,11.
L’expérience de chambre de Boyden est celle utilisée le plus souvent invasion et migration des cellules techniques à explorer. Un des avantages de cette approche sont sa reproductibilité, bien que cette technique dépend fortement de l’expertise de l’expérimentateur. Cellule de comptage est manuelle et peut varier entre expérimentateurs. Beaucoup d’étapes critiques doit être standardisés et suivie avec soin, tels que l’utilisation du milieu approprié facteur chimiotactique et famine spécifique à chaque lignée cellulaire. Enlever les cellules de la membrane supérieure avec un coton-tige est également essentiel pour assurer des résultats optimaux et évitant les résultats sous-optimaux illustrés à la Figure 2 a. Si ce test est utilisé pour évaluer la motilité cellulaire, l’invasion et les capacités de migration à travers une membrane poreuse de trois dimensions (3D), il n’est pas possible de suivre les cellules grâce à une expérience de Time-lapse. En outre, plaquettes commerciales avec une membrane poreuse sont souvent coûteux.
Le test vidéo axée sur le microscope zéro blessure présenté ici est une technique robuste pour évaluer l’invasion et la migration cellulaire. Le dosage est effectué auprès d’un fabricant de plaie mécanique et fournit une comparaison reproductible entre les conditions de traitement. L’analyse microscopique vidéo peut être utilisée pour générer des données quantitatives précises pour plaie confluence de guérison et de la cellule à travers une expérience en Time-lapse. Analyse de temps en temps des conditions de traitement différent peut être corroboré par les observations microscopiques. Cette analyse s’intègre à la prolifération des cellules pendant le test et prend en compte le temps de doublement cellulaire. Vidéo ou le contenu de données brutes peut être exportée pour obtenir une représentation très visuelle des résultats, comme le montre les courbes de migration cellulaire dans la Figure 3 b.
Beaucoup d’étapes critiques est tenus d’obtenir des résultats interprétables. Les conditions optimales pour la cellule semis dépendent de la lignée cellulaire et doivent être testées avec différentes dilutions pour obtenir confluence cellulaire 90 % dans les puits. Pour obtenir une plaie linéaire, électrodéposition de cellule ne doit pas dépasser 16 h. L’étape de lavage doit être faite deux fois et rapidement pour éviter d’introduire des débris cellulaires dans la plaie qui puisse modifier les résultats. Pour la plaie de grattage invasion, correctement soin l’ECM est également une étape essentielle. Le taux de refroidissement doit être constante, et l’ECM doit être manipulée avec pointes de pipette réfrigérés et maintenue à 4 ° C.
Ces techniques présentent de nombreux avantages, qui sont résumées dans le tableau 1. Les cellules adhérentes sont nécessaires pour cette technique. Gratter une lésion mécanique causes aux cellules, qui provoque la libération du contenu cellulaire dans le milieu environnant et peut influer sur le processus de migration. Le dosage zéro blessure fournit une estimation de la motilité cellulaire 2D mais pas de chimiotactisme des cellules, qui ne peut être étudié à l’aide de cette technique. Nous avons récemment développé une analyse de chimiotactisme microscopique vidéo en utilisant un système commercial de placage. Ce test a besoin de cellules avec une capacité de migration élevés, comme les cellules souches cancéreuses, comme décrit plus haut12. Cette nouvelle technique peut devenir l’étalon-or pour les essais de migration invasion dans le futur.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces techniques ont été développées avec l’appui du LabEx nombres premiers (ANR-11-LABX-0063), le Contrat de Plan Etat-région (CPER) dans le cadre scientifique de l’ETOILE (CPER 2009-2013) et lyrique Grant INCa-DGCD-4664.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
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