Summary
Questo studio segnala due diversi metodi per l'analisi di migrazione e l'invasione delle cellule: l'analisi della camera di Boyden e l'in vitro dei video microscopio analisi basata a guarigione. Vengono descritti i protocolli per questi due esperimenti, e vengono confrontati i loro vantaggi e svantaggi.
Abstract
Le capacità di migrazione e invasione delle cellule del tumore sono contributori principali a ricorrenza e progressione del cancro. Molti studi hanno esplorato le capacità di migrazione e invasione di capire come diffondere le cellule tumorali, con l'obiettivo di sviluppare nuove strategie di trattamento. Analisi delle basi cellulari e molecolari di queste abilità ha portato per la caratterizzazione della mobilità delle cellule e le proprietà fisico-chimiche del citoscheletro e microambiente cellulare. Per molti anni, l'analisi della camera di Boyden e il dosaggio di ferita gratta e Vinci sono stati le tecniche standard per studiare la migrazione e l'invasione delle cellule. Tuttavia, queste due tecniche hanno limitazioni. L'analisi della camera di Boyden è difficile e richiede tempo, e il saggio di gratta e Vinci della ferita ha scarsa riproducibilità. Lo sviluppo delle moderne tecnologie, soprattutto in microscopia, ha aumentato la riproducibilità del dosaggio zero ferita. Utilizzando sistemi di analisi potente, un microscopio video "in incubatrice" utilizzabile per fornire analisi automatica e in tempo reale di invasione e migrazione cellulare. Lo scopo di questa carta è di segnalare e confrontare i due dosaggi usati per studiare la migrazione e l'invasione delle cellule: l'analisi della camera di Boyden e un ottimizzato in vitro dei video basati su microscopio zero ferita dosaggio.
Introduction
Migrazione e l'invasione delle cellule sono coinvolti nella diffusione delle cellule tumorali, che è la causa principale di resistenza al trattamento1 e può portare a locoregionale o ricorrenza metastatica dopo cancro trattamento2. La transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) è il processo iniziale di invasione-migrazione delle cellule in cui il cancro cellule passare da un epiteliali ad un fenotipo mesenchimale. E-caderina è un marcatore extracellulare del fenotipo epiteliale3, e l'espressione aumentata di N-caderina e il vimentin è caratteristico del fenotipo mesenchimale4. Migrazione dipende anche la capacità intrinseca delle cellule tumorali ad invadere la matrice extracellulare (ECM) attraverso l'azione di metalloproteasi di matrice5.
Questo meccanismo di invasione – migrazione è stata descritta per il cancro in molti luoghi, particolarmente in testa e del collo cancro6. Molti ricercatori si sono concentrati sui processi di migrazione e invasione di capire meglio come le cellule tumorali diffondere nella speranza che questa conoscenza porterà a nuove strategie di trattamento. È fondamentale che questi studi sono effettuati usando le analisi affidabili e riproducibili.
Analisi in vitro della motilità cellulare può essere impegnativo. Sviluppato molti anni fa, l'analisi della camera di Boyden è considerato lo standard per l'invasione – migrazione analisi7. Tuttavia, è che richiede tempo e spesso è impreciso. Un secondo test è la guarigione dosaggio8, che consiste nel fare un graffio su una coltura monostrato cellulare e acquisizione di immagini di invasione delle cellule e la migrazione ad intervalli di tempo. Questa tecnica è stata ampiamente criticata a causa delle grandi variazioni tra i risultati di due prove consecutive. Tuttavia, l'applicazione delle moderne tecnologie, soprattutto in microscopia, ha migliorato la riproducibilità del dosaggio zero ferita. I microscopi video possono essere facilmente introdotto nelle incubatrici e in grado di generare immagini in tempo reale della migrazione cellulare. Questi dispositivi registrano dati microscopici e forniscono analisi automatica della confluenza delle cellule della ferita nel tempo. Lo scopo di questa carta è di descrivere le analisi della camera di Boyden e il dosaggio ottimizzato ferita gratta e Vinci e per discutere i vantaggi e le debolezze di ogni approccio.
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Protocol
Nota: I saggi di camera e zero di Boyden senza inclusione di ECM sono indicati come il test di migrazione, e la stesse analisi con l'ECM è indicato come l'analisi di invasione.
1. analisi della camera di Boyden
Nota: Questo protocollo è adattato per la linea cellulare SQ20B, che è derivata da un cancro laringeo ricorrente, testa e collo Carcinoma di cellule Squamous (HNSCC) ed è stata ottenuta da John Little (Boston, MA, USA).
1 ° giorno
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Semina cellulare
- Semi 2 106 SQ20B cellule in 12 mL di terreno di coltura (CM) in un matraccio da2 di 175 cm 72 ore prima del primo giorno e permettono alle cellule di crescere alla confluenza di 80% delle cellule.
- Per preparare CM SQ20B cellule, supplemento medium di Eagle per di Dulbecco modificato (DMEM) con 10% siero fetale di vitello (FCS), idrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 0,1 g/L.
- Sotto cappa a flusso laminare, tripsinizzano le cellule. Rimuovere il mezzo, lavare le cellule con soluzione salina sterile tampone fosfato (PBS) e aggiungere 2,5 mL di acido etilendiamminotetracetico tripsina (ed) (0,5 g/L). Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C e quindi interrompere la reazione con l'aggiunta di 12,5 mL di CM riscaldato a 37 ° C. Contare il numero di celle utilizzando un contatore di cellule.
- Seme le cellule in un pallone da2 di 25 cm a una densità delle cellule delle cellule5 6 10 per ogni condizione da valutare. Incubare le cellule per 24 h in 3 mL di CM.
- Semi 2 106 SQ20B cellule in 12 mL di terreno di coltura (CM) in un matraccio da2 di 175 cm 72 ore prima del primo giorno e permettono alle cellule di crescere alla confluenza di 80% delle cellule.
2 ° giorno
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Inedia delle cellule e preparazione delle camere rivestite di
- Morire di fame le cellule sostituendo il mezzo in ciascuna beuta con 3 mL di terreno di siero bovino fetale-basso (FBS) utilizzando 0,1% albumina di siero bovino (BSA) invece di FBS. Morire di fame le cellule per 24 h in incubatrice.
- Per preparare la fame CM (s-CM), supplemento DMEM con 0.1% BSA, idrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 0,1 g/L.
- Per il dosaggio di migrazione, passare al punto 1.3.
- Per il dosaggio di invasione, 12 h prima del giorno 3, preparare gli alloggiamenti rivestiti di Boyden aggiungendo 500 μL di s-CM per ogni alloggiamento rivestito. Utilizzare preparato commercialmente rivestito Boyden chambers e conservare a 4 ° C prima dell'uso. Posizionare ogni camera di Boyden nella piastra di compagno e impostarlo in incubatore a 37 ° C durante la notte.
- Morire di fame le cellule sostituendo il mezzo in ciascuna beuta con 3 mL di terreno di siero bovino fetale-basso (FBS) utilizzando 0,1% albumina di siero bovino (BSA) invece di FBS. Morire di fame le cellule per 24 h in incubatrice.
3 ° giorno
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Semina nella camera di Boyden cellulare
- Utilizzare la piastra di compagno per preparare il chemoattractant. Riempire ogni bene della piastra 24 pozzetti compagno con 750 μL di terreno completo con 10% FBS, idrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 0,1 g/L.
- Adattare il fattore chemiotattico per ogni linea cellulare e ciascuna condizione di trattamento. Per preparare il chemoattractant CM (ca-CM), supplemento DMEM con 10% FCS, idrocortisone 0,4 mg/mL, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 0,1 g/L.
- Trasferire la camera superiore nella piastra del compagno preriempita, avendo cura di evitare bolle.
- Per il dosaggio di invasione, rimuovere con cautela μL 450 di CM da ogni camera di Boyden.
- Sotto cappa a flusso laminare, tripsinizzano le cellule. Rimuovere il mezzo, lavare le cellule con PBS sterile, aggiungere 0,5 mL di tripsina EDTA (0,5 g/L) e poi incubare le cellule per 5 min a 37 ° C. Fermare la reazione aggiungendo CM riscaldato a 37 ° C. Contare il numero di celle utilizzando un contatore di cellule.
- Cellule di 10 34 SQ20B di seme in 500 μL di 0,1% medio di BSA, dando una diluizione finale di 10 64 cellule/mL.
Nota: La concentrazione delle cellule dovrebbe essere adattata per ogni linea cellulare. - Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C per 24 h.
- Utilizzare la piastra di compagno per preparare il chemoattractant. Riempire ogni bene della piastra 24 pozzetti compagno con 750 μL di terreno completo con 10% FBS, idrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 0,1 g/L.
4 ° giorno
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Fissazione delle cellule e la macchiatura
- Fissare le cellule prima il tempo di raddoppiamento specifico per quella linea cellulare. Difficoltà SQ20B cellule prima di 24 ore.
- Rimuovere ogni inserto dalla piastra compagno e rimuovere delicatamente le cellule dalla camera superiore utilizzando un tampone di cotone. È particolarmente importante rimuovere tutte le celle posizionate nella camera superiore.
- Difficoltà e macchia ogni inserto singolarmente per ottenere di colorazione May-Grunwald Giemsa9 utilizzando il kit di colorazione fornito. In alternativa, utilizzare paraformaldeide al 4% in un altro piatto di compagno per una fissazione di 30 min.
- Mantenere gli inserti in un piatto vuoto 24 pozzetti compagno sotto una cappa di laboratorio per asciugare ogni camera.
Giorno 5
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Analisi al microscopio
- Inserire la piastra compagno con gli inserti su un microscopio a contrasto di fase 20 e contare ogni cella migrato nella parte inferiore della membrana. Ottimizzare la posizione giusta messa a fuoco spostando l'obiettivo dalla parte inferiore alla parte superiore e la posizione di arresto sulla parte inferiore della membrana.
- Calcolare il rapporto tra i numeri delle cellule migrate e cellule seminate. Ogni numero di ripetizioni per ciascuna condizione di trattamento in triplice copia.
2. zero ferita Assay: Migrazione cellulare
Nota: Le istruzioni devono essere adattate per ogni tipo di cellula.
1 ° giorno
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Semina cellulare
- Semi 2 x 106 SQ20B cellule in 12 mL di CM in un pallone da2 di 175 cm 72 ore prima del primo giorno e permettono alle cellule di crescere alla confluenza di 80% delle cellule.
- Sotto cappa a flusso laminare, tripsinizzano le cellule. Rimuovere il mezzo, lavare le cellule con PBS sterile, aggiungere 2,5 mL di tripsina EDTA (0,5 g/L) e incubare le cellule per 5 min a 37 ° C. Fermare la reazione con l'aggiunta di 12,5 mL di CM riscaldato a 37 ° C. Contare il numero di celle utilizzando un contatore di cellule.
- Generare un campione prediluito ad una densità di cella di 4 x 105/ml, pari ad una densità finale di 10 44 cellule per 100 μL in ogni pozzetto. Questa concentrazione deve essere adattata per ogni linea cellulare e dovrebbe essere nella gamma di 1 x 104 10 64 celle.
- Celle di seme in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti da depositare 100 μL della soluzione preparata al punto 2.1.2.
- Lasciare la piastra a temperatura ambiente per 5 min disperdere le cellule in modo uniforme sul fondo dei pozzetti.
- Posizionare la piastra in incubatrice e permettono alle cellule di aderire alla piastra per 12-16 h (massima) a 37 ° C.
2 ° giorno
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Scratch test ferita
- Rimuovere le piastre preparate al punto 2.1 dall'incubatrice.
- Sotto il cofano, fare una ferita utilizzando il dispositivo ferentesi commerciale secondo il protocollo del produttore.
- Rimuovere immediatamente il mezzo da ogni pozzetto usando una pipetta con una punta conica adattata, avendo cura di non per toccare la ferita.
- Lavare le cellule due volte da ripetere l'aspirazione e l'utilizzo di 100 μL di CM riscaldato a 37 ° C per ciascun pozzetto.
- Rimuovere il CM utilizzando una pipetta con una punta conica adattata dopo i passaggi di lavaggio.
- Aggiungere 100 μL di mezzo specifico per ciascuna condizione di trattamento in ciascun pozzetto.
- Se si tenta di evitare la creazione di eventuali bolle nei pozzetti. Una tecnica di pipettaggio inverso può essere utile qui. In alternativa, è possibile rimuovere le bolle con un ago di siringa.
- Collocare la piastra nel rack adattato del microscopio video.
- Per migliorare la qualità dell'immagine, fate la piastra calda per almeno 15 minuti prima della prima scansione per evitare formazione di condensa sul lato inferiore della piastra.
- Programma per la pianificazione delle scansioni, utilizzando il software di video microscopio in una sola immagine per pozzetto. Un intervallo di 2-h massimo è richiesto per un esperimento di invasione-migrazione. Se l'obiettivo dell'esperimento è quello di produrre un video, un intervallo di 30 min massimo è preferito.
- Alla fine dell'esperimento, lavare accuratamente la ferita periferica e seguire ognuno dei quattro passaggi di lavaggio indicati dal produttore.
Giorni 3, 4 e 5
-
Analisi di migrazione utilizzando il microscopio video
- Per un minimo di 24 h e fino a 5 giorni, monitorare e controllare la migrazione delle cellule.
- Utilizzare una maschera di cella appropriata adattata per ogni tipo di cellula per analizzare la migrazione cellulare. Per ottenere una maschera di cella adattata per ogni linea cellulare, generare una cella definizione dal software utilizzando una collezione di immagini di celle specifico di elaborazione.
- Tracciare le curve ed esportare i dati in un foglio di calcolo, che può essere utilizzato per analizzare e confrontare i risultati.
3. scratch ferita Assay: L'invasione delle cellule
Nota: Le istruzioni devono essere adattate per ogni tipo di cellula.
1 ° giorno
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Semina cellulare
- Utilizzare lo stesso protocollo per la semina delle cellule come descritto al punto 2.1.
2 ° giorno
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Preparando l'ECM
- Sbrinamento la matrice di per almeno 12 ore prima dell'uso a 4 ° C. Assicurarsi che non aggregati sono visibili. Se gli aggregati sono visibili, è possibile mantenere la matrice a 4 ° C per un periodo più lungo, fino a far scompaiono gli aggregati. Tenere la matrice sul ghiaccio. Utilizzare puntali preraffreddato.
Nota: La matrice solidificherà se non conservato a 4 ° C. - Raffreddare la microcentrifuga sul ghiaccio per 5 min.
- Prendere CM raffreddato a 4 ° C dal frigorifero e diluire la matrice nelle provette microcentrifuga preraffreddato per ottenere una concentrazione finale di 300 μg/mL.
- Restituire le provette microcentrifuga con matrice prediluito in frigorifero a 4 ° C.
Nota: Una cremagliera di raffreddamento adattata per microcentrifuga è utile per mantenere i tubi a 4° C in tutto l'esperimento.
- Sbrinamento la matrice di per almeno 12 ore prima dell'uso a 4 ° C. Assicurarsi che non aggregati sono visibili. Se gli aggregati sono visibili, è possibile mantenere la matrice a 4 ° C per un periodo più lungo, fino a far scompaiono gli aggregati. Tenere la matrice sul ghiaccio. Utilizzare puntali preraffreddato.
2 ° giorno
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Gratta e Vinci ferita analisi e trattamento del ECM
- Rimuovere la piastra preparata al punto 3.1 dall'incubatrice.
- Sotto il cofano, rendere la ferita usando il dispositivo ferentesi commerciale secondo il protocollo del produttore.
- Rimuovere immediatamente il mezzo da ogni pozzetto usando una pipetta con una punta conica adattata facendo attenzione a non per toccare la ferita.
- Lavare le cellule due volte, ripetere la procedura di aspirazione e utilizzando 100 μL di CM riscaldato a 37 ° C.
- Dopo il secondo lavaggio, collocare la piastra sull'incubatore di 4 ° C a equilibrare la temperatura per 5 min.
- Rimuovere il fluido freddo da ogni pozzetto con la pipetta di aspirazione con una punta conica, avendo cura di Pipettare attentamente dal bordo e di evitare di toccare la ferita.
- Aggiungere 50 μL di matrice prediluito ad ogni pozzetto utilizzando punte coniche preraffreddati a 4 ° C.
- Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C per 30 min.
Nota: Un rack di supporto preriscaldato a 37 ° C è utile per accelerare il riscaldamento della piastra 96 pozzetti. - Rimuovere la piastra dall'incubatrice e aggiungere 100 μL della CM adattato ad ogni pozzetto come indicato per ciascuna condizione di trattamento.
- Se si tenta di evitare la creazione di eventuali bolle nei pozzetti. Una tecnica di pipettaggio inverso può essere utile qui. In alternativa, è possibile rimuovere le bolle con un ago di siringa.
- Collocare la piastra nel rack adattato al microscopio dei video.
- Per migliorare la qualità dell'immagine, fate la piastra calda per almeno 15 minuti prima della prima scansione per evitare formazione di condensa sul lato inferiore della piastra.
- Programmare la pianificazione delle scansioni, utilizzando il software di video microscopio in una sola immagine per pozzetto, nella modalità di scansione Scratch ferita. Un intervallo massimo di 2 h in necessaria per un esperimento di invasione-migrazione. Se l'obiettivo dell'esperimento è quello di produrre un video, un intervallo di 30 min massimo è preferito.
- Alla fine dell'esperimento, lavare accuratamente la ferita periferica e seguire ognuno dei quattro passaggi di lavaggio indicati dal produttore.
Giorni 3, 4 e 5
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Analisi di invasione delle cellule usando un microscopio video.
- Ripetere il punto 2.3.
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Representative Results
Segnaliamo qui due metodi diversi per analizzare la migrazione e l'invasione delle cellule. La figura 1 Mostra la Boyden esperimento di camera. Gli inserti vengono inseriti in una piastra di compagno con chemoattractant medio, e le cellule sono seminate in CM. La membrana può essere non patinata (test di migrazione) o verniciato (analisi di invasione). Cellule sono seminate nella camera superiore in s-CM. La camera bassa è riempita di CM come un fattore chemiotattico. Le cellule sono fissate prima il tempo di raddoppiamento.
La figura 2 Mostra la membrana di Boyden dopo fissazione delle cellule. La Figura 2A Mostra un risultato non ottimale, con aggregati di cellule sul lato superiore della membrana. Figura 2B Mostra un risultato ottimale con celle fisse e tinto in blu sulla membrana.
La figura 3 Mostra un risultato ottimale del dosaggio zero ferita. La ferita lineare può essere visto in Figura 3A. Le celle non sono osservate nella ferita e la guarigione della ferita si è verificato entro 30 h. Il tempo a guarire la ferita è dipendente sulla linea cellulare e varia da 24 a 50 h.
Figura 3B è una rappresentazione grafica di cicatrizzazione in quattro condizioni di trattamento: ABT, ABT-199 (anti-Bcl-2), cetuximab (anti-EGFR) e controllo-199 + cetuximab. L'ABT-199 + combinazione di cetuximab diminuito significativamente la migrazione cellulare. Le curve sono ottenute utilizzando il software di video microscopio, che fornisce dati affidabile analisi di migrazione delle cellule con il tempo. Barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD) per ciascun pozzetto.
Confluenza del novanta per cento è la densità cellulare ottimale per il dosaggio di guarigione della ferita. La semina cellulare ottimale dipende la linea cellulare e varia da 3 x 104 a 6 x 104 celle. Figura 4A Mostra la densità cellulare ottimale, e Figura 4 Mostra cella bassa densità. Pozzi dovrebbero essere lavati due volte per evitare aggregati di cellule, come mostrato in Figura 4B.
Figura 1: rappresentazione schematica dell'esperimento di camera di Boyden. Inserti sono posizionati in una piastra di compagno con chemoattractant medio, e le cellule sono seminate in CM. La membrana può essere non patinata (A) o rivestiti (B).
Figura 2: non ottimali e ottimale microscopici risultati ottenuti nell'esperimento di camera di Boyden. (A) membrana non ottimali con aggregati di cellule sul lato superiore della membrana e risultati non interpretabili. Barra della scala = 300 µm. (B) membrana ottimale con numerabile cellule nella parte inferiore della membrana tinto in blu. Barra della scala = 300 µm.
Figura 3: risultati ottimali ottengono nell'esperimento cicatrizzanti. (A) immagine rappresentativa del dosaggio di gratta e Vinci ferita mostrato cicatrizzazione osservati a 0, 15 e 30 h. I criteri per un esperimento di qualità sono una ferita lineare, frammenti di cellule non osservate nella ferita e confluenza di cellulare ottimale. Barra della scala = 300 µm. (B) rappresentazione grafica dei risultati di quantificazione dei parametri della confluenza di cella di ferita (percentuale) secondo tempo (h) la guarigione della ferita. Quattro condizioni di trattamento sono analizzate qui, e i dati sono mostrati con SD.
Figura 4: risultati non ottimali ottengono nell'esperimento cicatrizzanti. (A) densità cellulare ideale. (B) problemi lavare il pellet cellulare. (C) densità bassa delle cellule. Scala bar = 300 µm
| Vantaggi | Svantaggi | |
| Esperimento di camera di Boyden | -3D-Cell chemiotassi | -Richiede molto tempo |
| -Sia l'invasione e la migrazione con matrice strato rivestito e non rivestito | -Scarsa riproducibilità | |
| -Inserti costosi | ||
| -Nessuna esplorazione time-lapse | ||
| -Necessità di cellule aderenti | ||
| Analisi delle ferite | -Automatico altamente riproducibile ferita | -Motilità 2D-cellulare |
| -Sia l'invasione e la migrazione con matrice strato rivestito e non rivestito | -Necessità di cellule aderenti | |
| -Proliferazione inclusi nell'analisi | ||
| -Analisi visiva al microscopio time-lapse | ||
| -Esportazione dati delle metriche di guarigione della ferita con analisi precisa | ||
| -Il software robusto post-trattamento per le curve di migrazione e l'invasione delle cellule |
Tabella 1: vantaggi e svantaggi della Boyden dell'alloggiamento esperimento e analisi di cicatrizzazione microscopio video. Sperimentano i vantaggi e gli svantaggi della camera di Boyden e zero ferita dosaggio.
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Discussion
Segnaliamo qui due diverse modalità per studiare il processo di invasione e migrazione cellulare. L'analisi di questo processo è importante per comprendere i fattori coinvolti nella ricorrenza metastatica, che potrebbe essere spiegato con aumentata motilità di una sottopopolazione delle cellule di cancro chiamato cancro cellule staminali10,11.
L'esperimento di camera di Boyden è uno il più delle volte usato invasione e migrazione delle cellule tecniche per esplorare. Uno dei vantaggi di questo approccio è la sua riproducibilità, anche se questa tecnica è altamente dipendente dall'esperienza dello sperimentatore. Conta cellulare è manuale e può variare tra gli sperimentatori. Molti passaggi critici devono essere standardizzate e seguite con scrupolo, quale ad esempio garantire l'utilizzo del mezzo chemioattrattante e inedia appropriato specifico per ogni linea cellulare. Rimozione delle cellule dalla membrana superiore con un batuffolo di cotone è anche fondamentale per assicurare risultati ottimali ed evitare i risultati non ottimali, mostrati nella Figura 2A. Se questa analisi è usata per valutare la motilità cellulare, invasione e capacità di migrazione attraverso una membrana porosa di tridimensionale (3D), non è possibile tenere traccia di cellule attraverso un esperimento di time-lapse. Inoltre, inserti commerciali con una membrana porosa sono spesso costosi.
L'analisi di video basati su microscopio scratch ferita qui presentata è una tecnica robusta per valutare l'invasione e la migrazione cellulare. L'analisi viene eseguita con un creatore di ferita meccanica e fornisce un confronto riproducibile tra condizioni di trattamento. L'analisi microscopica dei video può essere utilizzato per generare i dati quantitativi precisi per ferita confluenza delle cellule e di guarigione attraverso un esperimento di time-lapse. Analisi di tempo--tempo di diverse condizioni di trattamento possono essere corroborata da osservazioni al microscopio. Questa analisi integra la proliferazione delle cellule durante il dosaggio e prende in considerazione il tempo di raddoppiamento delle cellule. Video o contenuti dati grezzi possono essere esportati per ottenere una rappresentazione altamente visiva dei risultati, come illustrato nelle curve di migrazione delle cellule nella Figura 3B.
Molti passaggi critici sono tenuti ad ottenere risultati interpretabili. Le condizioni ottimali per semina cellulare dipendono la linea cellulare e devono essere testate con diluizioni diverse per ottenere 90% confluenza di cella nei pozzetti. Per ottenere una ferita lineare, placcatura di cella non deve superare 16 h. La fase di lavaggio deve essere fatto due volte e rapidamente per evitare l'introduzione di detriti cellulari nella ferita che potrebbe alterare i risultati. Per la ferita di gratta e Vinci di invasione, anche abbastanza cura di ECM è un passo fondamentale. La velocità di raffreddamento deve essere costante, e l'ECM deve essere manipolato con puntali refrigerati e mantenuto a 4 ° C.
Queste tecniche hanno molti vantaggi, che sono riassunti nella tabella 1. Le cellule aderenti sono necessari per questa tecnica. Graffiare cause danno meccanico alle cellule, che provoca il rilascio del contenuto cellulare nel media circostante e possono influenzare il processo di migrazione. Il dosaggio di gratta e Vinci ferita fornisce una stima della motilità cellulare 2D ma non di chemiotassi cellulare, che non possono essere studiati utilizzando questa tecnica. Recentemente abbiamo sviluppato un'analisi di chemiotassi microscopica dei video utilizzando un sistema commerciale placcatura. Questo test ha bisogno di cellule con una migrazione ad alta capacità, come le cellule staminali tumorali, come descritto in precedenza12. Questa nuova tecnica potrebbe diventare il gold standard per le analisi di invasione-migrazione in futuro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Queste tecniche sono state sviluppate con il supporto di LabEx primi (ANR-11-LABX-0063), il piano di Contrat-Etat-regione (CPER) nel quadro scientifico di ETOILE (CPER 2009-2013) e Lyric Grant INCa-DGOS-4664.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
