Name: Evaluación de la invasión celular y el proceso de migración: una comparación de Video cero basado en el microscopio de la herida el análisis y el análisis de la cámara de Boyden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprende a evaluar la invasión y migración celular comparando el ensayo de cámara de Boyden con el método de herida por microscopía de video. Estas técnicas permiten obtener resultados reproducibles en estudios de biología celular.

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Estas técnicas fueron desarrolladas con el apoyo de la empresa LabEx PRIMES (ANR-11-LABX-0063), el Contrat Plan-estado-región (CPER) en el marco científico de ETOILE (CPER 2009-2013) y lírica Grant INCa-DGOS-4664.

Nota: Los ensayos de cámara y cero de Boyden sin la inclusión del ECM se denominan el ensayo de migración, y el mismo análisis con el ECM se conoce como el ensayo de invasión.
1. ensayo de cámara de Boyden
Nota: Este protocolo está adaptado para la línea celular de SQ20B, que se deriva de un cáncer laríngeo recurrente de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) y se obtuvo de John Little (Boston, MA, USA).
Día 1
<ol><li>
Siembra de células
	<ol>
<li>Semilla 2 106 SQ20B células en 12 mL de medio de cultivo (CM) en un matraz de2 175 cm 72 h antes de primer día y permitir a las células a crecer hasta 80% confluencia de células.<ol>
<li>Para preparar las células de SQ20B CM, suplemento medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero fetal de ternero (FCS), hidrocortisona de 0.04 mg/mL, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina de 0.1 g/L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bajo una campana de flujo laminar, trypsinize las células. Quitarlo del medio, lavan las células con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y añadir 2,5 mL de ácido de tripsina etilendiaminotetracético (EDTA) (0,5 g/L). Incube las células durante 5 min a 37 ° C y luego se para la reacción mediante la adición de 12,5 mL de CM calentado a 37 ° C. Contar el número de células usando un contador de células.</li>
		<li>Las células en un matraz de2 de 25 cm a una densidad celular de 6 105 células para cada condición que se evaluará de la semilla. Incube las células durante 24 h en 3 mL de CM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Día 2
<ol start="2"><li>
Hambre y preparación de cámaras revestidas de células
	<ol>
<li>Matar de hambre las células cambiar el medio en cada frasco con 3 mL de medio de suero baja fetal bovino (FBS) con 0.1% de albúmina sérica bovina (BSA) en lugar de FBS. Matar de hambre las células durante 24 horas en la incubadora.<ol>
<li>Para preparar el hambre CM (s-CM), suplemento de DMEM con 0.1% de BSA, hidrocortisona de 0.04 mg/mL, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina de 0.1 g/L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para el análisis de la migración, vaya al paso 1.3.</li>
		<li>Para el análisis de la invasión, 12 h antes del día 3, preparar las cámaras Boyden revestidas por agregar 500 μL de s CM para cada compartimiento revestido. Usar preparados comercialmente cámaras revestidas de Boyden y mantenerlos a 4 ° C antes de usar. Coloque cada compartimiento de Boyden en la placa de compañero y colóquelo en la incubadora a 37 ° C durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Día 3
<ol start="3"><li>
Célula de siembra en la cámara de Boyden
	<ol>
<li>Utilizar la placa de compañero para preparar la chemoattractant. Llene cada uno bien de la placa de 24 pocillos compañero con 750 μL de medio completo con 10% FBS, hidrocortisona de 0.04 mg/mL, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina de 0.1 g/L.<ol>
<li>Adaptar la chemoattractant para cada línea celular y cada condición de tratamiento. Para preparar la chemoattractant CM (ca-CM), suplemento de DMEM con 10% FCS, hidrocortisona de 0,4 mg/mL, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina de 0.1 g/L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Transferencia de la cámara alta en la placa del compañero prellenada, teniendo cuidado para evitar burbujas.</li>
		<li>Para el análisis de la invasión, retire con cuidado 450 μL de CM de cada compartimiento de Boyden.</li>
		<li>Bajo una campana de flujo laminar, trypsinize las células. Quitarlo del medio, lavan las células con PBS estéril, Añadir 0,5 mL de tripsina EDTA (0.5 g/L) y luego incubar las células durante 5 min a 37 ° C. Detener la reacción añadiendo CM calentado a 37 ° C. Contar el número de células usando un contador de células.</li>
		<li>3 104 SQ20B células de semillas en 500 μL de medio de BSA 0.1%, dando una dilución final de 10 64 células/mL. Nota: La concentración de células debe ser adaptada para cada línea celular.</li>
		<li>Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C durante 24 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Día 4
<ol start="4"><li>
Fijación de la célula y la coloración
	<ol>
<li>Fijar las células antes del tiempo de duplicación específico a esa línea celular. Fijar las células SQ20B antes de 24 h.</li>
		<li>Extraer cada parte movible de la placa de compañero y retire con cuidado las células de la cámara superior utilizando un hisopo de algodón. Es particularmente importante eliminar todas las células en la cámara alta.</li>
		<li>Fix y la mancha Inserte individualmente para obtener coloración de May-Grunwald Giemsa9 utilizando el kit de tinción proporcionado. Como alternativa, utilizar paraformaldehído al 4% en otra placa de compañero para una fijación de 30 min.</li>
		<li>Mantenga los rellenos en una placa de vacío 24-bien compañero bajo una campana de laboratorio para secar cada cámara.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Día 5
<ol start="5"><li>
Análisis microscópico
	<ol>
<li>Inserte la placa del compañero con los insertos en un microscopio de contraste de fase 20 y contar cada célula migrado en la parte inferior de la membrana. Optimizar la posición de foco derecho moviendo el objetivo de la parte inferior a la parte superior y la posición de parada en la parte inferior de la membrana.</li>
		<li>Calcular el cociente entre el número de células migradas y células sembradas. Repita cada cuenta para cada condición de tratamiento por triplicado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cero herida ensayo: Migración de la célula
Nota: Las instrucciones deben ser adaptadas para cada tipo de célula.
Día 1
<ol><li>
Siembra de células
	<ol>
<li>Semilla 2 x 106 SQ20B células en 12 mL de CM en un matraz de2 175 cm 72 h antes de primer día y permitir a las células a crecer hasta 80% confluencia de células.</li>
		<li>Bajo una campana de flujo laminar, trypsinize las células. Quitarlo del medio, lavan las células con PBS estéril, añadir 2,5 mL de tripsina EDTA (0.5 g/L) e Incube las células durante 5 min a 37 ° C. Detener la reacción, añadir 12,5 mL de CM calentado a 37 ° C. Contar el número de células usando un contador de células.</li>
		<li>Generar una muestra prediluida con una densidad celular de 4 x 105/ml, lo que da una densidad final de 4 104 células por 100 μL en cada pocillo. Esta concentración debe ser adaptada para cada línea celular y debe estar en el rango de 1 x 104 6 104 células.</li>
		<li>Células de semilla en cada pocillo de una placa de 96 pocillos por depositar 100 μL de la solución preparada en el paso 2.1.2.</li>
		<li>Dejar la placa a temperatura ambiente durante 5 minutos dispersar las células uniformemente en el fondo de los pozos.</li>
		<li>Coloque la placa en la incubadora y permitir que las células se adhieran a la placa de 12 a 16 h (máxima) a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Día 2
<ol start="2"><li>
Rayar la herida ensayo
	<ol>
<li>Saque el preparado en el paso 2.1 de la incubadora.</li>
		<li>Bajo el capó, hacer una herida usando el dispositivo herido comercial según protocolo del fabricante.</li>
		<li>Retire inmediatamente el medio de cada pocillo con una pipeta con una punta cónica adaptada, teniendo cuidado de no para tocar la herida.</li>
		<li>Lavan las células dos veces por repetir la aspiración y el uso de 100 μL de CM calentado a 37 ° C por cada pozo.</li>
		<li>Eliminar los centímetros usando una pipeta con una punta cónica adaptada tras los pasos de lavado.</li>
		<li>Añada 100 μL de medio específico para cada condición de tratamiento a cada pocillo.</li>
		<li>Trate de evitar la creación de burbujas en los pocillos. Una técnica de pipeteo de reversa puede ser útil aquí. O bien, elimine las burbujas con una aguja de jeringa.</li>
		<li>Coloque la placa en el bastidor adaptado del video microscopio.</li>
		<li>Para mejorar la calidad de la imagen, deje que la plancha se caliente durante al menos 15 min antes de la primera exploración para evitar la condensación en la parte inferior de la placa.</li>
		<li>Programa el programa de análisis, utilizando el software del microscopio video en una sola imagen por pozo. Un intervalo máximo de 2 h se requiere para un experimento de invasión-migración. Si el objetivo del experimento es producir un video, un intervalo de 30 minutos máximo es preferido.</li>
		<li>Al final del experimento, lavar cuidadosamente el dispositivo hiriente y seguir cada uno de los cuatro pasos de lavado indicados por el fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Días 3, 4 y 5
<ol start="3"><li>
Análisis de la migración usando el microscopio video
	<ol>
<li>Para un mínimo de 24 hs y un máximo de 5 días, vigilar y controlar la migración de la célula.</li>
		<li>Use una máscara de células apropiadas adaptada para cada tipo de célula para analizar la migración de la célula. Para obtener una mascarilla de células adaptada para cada línea celular, generan una célula proceso definición del software usando una colección de imágenes de células específicas.</li>
		<li>Trazar las curvas y exportar los datos a una hoja de cálculo, que puede utilizarse para analizar y comparar los resultados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cero herida ensayo: Invasión de células
Nota: Las instrucciones deben ser adaptadas para cada tipo de célula.
Día 1
<ol><li>
Siembra de células
	<ol>
<li>Utilizar el mismo protocolo para la siembra de células como se describe en el paso 2.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Día 2
<ol start="2"><li>
Preparación del ECM
	<ol>
<li>Descongelar la matriz durante al menos 12 h antes de su uso a 4 ° C. Asegúrese de que no hay agregados son visibles. Si los agregados están visibles, mantener la matriz a 4 ° C durante un largo periodo hasta que desaparezcan los agregados. Mantener la matriz en el hielo. Usar puntas de pipeta preenfriada. Nota: La matriz solidificará si no mantener a 4 ° C.</li>
		<li>Enfriar los tubos de microcentrífuga en hielo durante 5 minutos.</li>
		<li>CM refrigerado a 4 ° C en el refrigerador y diluir la matriz en los tubos de microcentrífuga preenfriada para obtener una concentración final de 300 μg/mL.</li>
		<li>Devolver los tubos de microcentrífuga con matriz prediluido al refrigerador a 4 ° C. Nota: Un estante de enfriamiento adaptado para tubos de microcentrífuga es útil para mantener los tubos a 4 º C durante todo el experimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Día 2
<ol start="3"><li>
Ensayo de rayado de la herida y tratamiento de lo ECM
	<ol>
<li>Retire la placa preparada en el paso 3.1 de la incubadora.</li>
		<li>Bajo el capó, hacer la herida usando el dispositivo herido comercial según protocolo del fabricante.</li>
		<li>Retire inmediatamente el medio de cada pocillo con una pipeta con una punta cónica adaptada teniendo cuidado de no para tocar la herida.</li>
		<li>Lavan las células dos veces por repetir la aspiración y el uso de 100 μL de CM calentado a 37 ° C.</li>
		<li>Después del segundo lavado, coloque la placa en la incubadora de 4 º C para equilibrar su temperatura durante 5 minutos.</li>
		<li>Retire el medio frío de cada pocillo con la pipeta de aspiración con un extremo cónico, teniendo cuidado al Pipetear cuidadosamente desde el borde y evitar tocar la herida.</li>
		<li>Añadir 50 μL de matriz prediluido a cada pocillo utilizando puntas cónicas preenfriadas a 4 ° C.</li>
		<li>Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C durante 30 minutos. Nota: Un bastidor de soporte precalentadas a 37 ° C es útil para acelerar el calentamiento de la placa de 96 pocillos.</li>
		<li>Retire la placa de la incubadora y añadir 100 μL de la CM adaptada a cada pocillo como se indica para cada condición de tratamiento.</li>
		<li>Trate de evitar la creación de burbujas en los pocillos. Una técnica de pipeteo de reversa puede ser útil aquí. O bien, elimine las burbujas con una aguja de jeringa.</li>
		<li>Coloque la placa en el bastidor adaptado al microscopio video.</li>
		<li>Para mejorar la calidad de la imagen, deje que la plancha se caliente durante al menos 15 min antes de la primera exploración para evitar la condensación en la parte inferior de la placa.</li>
		<li>Programa el programa de análisis, utilizando el software del microscopio video en una sola imagen por pozo, en el modo de exploración de Scratch de la herida. Un intervalo de 2 horas máximo en necesaria para un experimento de invasión-migración. Si el objetivo del experimento es producir un video, un intervalo de 30 minutos máximo es preferido.</li>
		<li>Al final del experimento, lavar cuidadosamente el dispositivo hiriente y seguir cada uno de los cuatro pasos de lavado indicados por el fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Días 3, 4 y 5
<ol start="4"><li>
Análisis de la invasión de células utilizando un microscopio video.
	<ol>
<li>Repita el paso 2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-enhanced+cell+migration%2Finvasion+process%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review.</a> Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).</li>
<li>Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+E-cadherin+and+integrins+in+mesoderm+differentiation+and+migration+at+the+mammalian+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak.</a> Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).</li>
<li>Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+cancer+stem%28-like%29+cells+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).</li>
<li>Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+biologic+activity+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications.</a> J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).</li>
<li>Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+to+mesenchymal+transition+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).</li>
<li>Chen, H. -C. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/922b/e08c04a3ad311a32ca0fc52644681f1bf8b7.pdf">Boyden chamber assay.</a> Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).</li>
<li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576902">Wound-healing assay.</a> Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).</li>
<li>Piaton, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+recommendations+and+best+practice+guidelines+for+May-Gr%C3%BCnwald-Giemsa+staining%3A+literature+review+and+insights+from+the+quality+assurance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Path%22%5BJournal%5D)">Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance.</a> Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance%3A+cancer+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+lett%22%5BJournal%5D)">Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell.</a> Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+ion+irradiation+withstands+cancer+stem+cells%E2%80%99+migration%2Finvasion+process+in+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+%28HNSCC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC).</a> Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).</li>
<li>Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+a+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Subpopulation+Having+Stem+Cell+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics.</a> J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí divulgamos dos modalidades diferentes para estudiar el proceso de invasión y migración celular. El análisis de este proceso es importante para comprender los factores que intervienen en la recurrencia metastásica, que podría explicarse por aumento de la movilidad de una subpoblación de células de cáncer llamado cáncer células madre10,11.
El experimento de la cámara de Boyden es uno lo más frecuentemente usado técnicas para explora...

Migración y la invasión de células participan en la diseminación de células cancerosas, que es la principal causa de resistencia a los tratamiento1 y pueden llevar a locorregional o metastásica recurrencia después de tratamiento del cáncer2. La transición epitelial-mesenquimal (EMT) es el proceso inicial de invasión-migración de la célula en que el cáncer de las células cambia de un epitelio a un fenotipo mesenquimal. E-cadherina es un marcador extracelular del fenotipo epitelial3y aumento de la expresión de N-cadherina y vimentina es característica del fenotipo mesenquimal4. La migración también depende de la capacidad intrínseca de las células cancerosas invaden la matriz extracelular (ECM) a través de la acción de metaloproteasas de matriz5.
Este mecanismo de invasión, la migración se ha descrito para el cáncer en muchos lugares, particularmente en cáncer de cabeza y cuello6. Muchos investigadores se han centrado en los procesos de migración y la invasión para entender mejor cómo las células cancerosas se difusión en la esperanza de que este conocimiento conducirá a nuevas estrategias de tratamiento. Es crucial que estos estudios se realizan utilizando ensayos fiables y reproducibles.
Análisis in vitro de motilidad de la célula pueden ser difícil. Desarrollada hace muchos años, el análisis de la cámara de Boyden se considera para ser el estándar para la invasión – migración análisis7. Sin embargo, es lento y a menudo es inexacta. Una segunda prueba es la cicatrización ensayo8, que implica hacer un rasguño en un cultivo celular de monocapa y captura de imágenes de invasión celular y la migración a intervalos de tiempo fijo. Esta técnica ha sido ampliamente criticada debido a las grandes variaciones entre los resultados de dos pruebas sucesivas. Sin embargo, la aplicación de tecnologías modernas, especialmente en microscopia, ha mejorado la reproducibilidad de la prueba de scratch de la herida. Videos microscopios pueden introducirse fácilmente en incubadoras y pueden generar imágenes en tiempo real de la migración de la célula. Estos dispositivos registran datos microscópicos y proporcionan un análisis automático de confluencia celular de herida con el tiempo. El objetivo de este trabajo es describir el ensayo de cámara de Boyden y el herida rasguño optimizado el análisis y discutir las ventajas y debilidades de cada enfoque.

<table><tbody><tr><td>Suero de becerro fetal Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona soluble en agua</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 100 X</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Mezcla de nueces (1X) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>La solución debe prepararse justo antes de usarla porque es muy inestable</td></tr><tr><td>Partícula de reja Z1</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>Línea celular CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B</td><td>Regalo de John Little' s Fabricante</td> <td>de heridas de</td><td></td> laboratorio</tr> <tr><td></td><td>Essen Bioscience</td><td>4494</td><td>Almacene en un lugar seguro y seco</td></tr><tr><td>Placa ImageLock de 96 pocillos Sistema CoolBox</td> 96F de <td>Essen Bioscience</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>con CoolSink 96F</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>Nevera con sistema M30</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>Inserto</td> <td>BoydenDominique Dutcher</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Inserto recubierto Boyden Dominique</td><td>Dutcher</td><td>354483</td><td>tienda en -20 &deg; </td></tr><tr><td>C Companion Placa de 24 pocillos</td><td>Dominique Dutcher</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel estándar</td><td>BD BioScience</td><td>BD 354234</td><td>Tienda en -20&nb;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de tinción RAL 555 Diagnóstico</td><td>RAL</td><td>&nbsp; 361550</td><td>Almacenar en un lugar seguro y seco</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>33511</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la invasión celular y el proceso de migración: una comparación de video cero basado en el microscopio de la herida el análisis y el análisis de la cámara de boyden

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

La capacidad de invasión y migración de las células tumorales es principales contribuyentes a la recidiva y progresión del cáncer. Muchos estudios han explorado las migración y la invasión habilidades para comprender cómo difusión las células cancerosas, con el objetivo de desarrollar nuevas estrategias de tratamiento. Análisis de las bases celulares y moleculares de estas habilidades ha conducido a la caracterización de la movilidad celular y las propiedades fisicoquímicas del citoesqueleto y del microambiente celular. Durante muchos años, el análisis de la cámara de Boyden y el ensayo de rayado de la herida han sido las técnicas estándar para el estudio de la migración e invasión celular. Sin embargo, estas dos técnicas tienen limitaciones. El ensayo de cámara de Boyden es difícil y desperdiciador de tiempo, y el ensayo de rayado herida tiene baja reproducibilidad. Desarrollo de tecnologías modernas, especialmente en la microscopia, ha incrementado la reproducibilidad de la prueba de scratch de la herida. Uso de sistemas de análisis de gran alcance, un microscopio de vídeo "en la incubadora" puede utilizarse para proporcionar análisis automático y en tiempo real de la migración celular y la invasión. El objetivo de este trabajo es informar y comparar los dos análisis utilizados para el estudio de invasión celular y la migración: el análisis de la cámara de Boyden y un optimizado en vitro video microscopio base cero herida ensayo.

Aquí divulgamos dos métodos diferentes para analizar la migración y la invasión celular. La figura 1 muestra al Boyden experimento de cámara. Los rellenos se colocan en un plato acompañante con chemoattractant medio y las células se siembran en CM. La membrana puede ser sin recubrimiento (ensayo de migración) o cubierta (ensayo de invasión). Se siembran las células en la cámara alta en s-CM. La cámara baja está llena de CM como un chemoattractant. Las células...

Este estudio divulga a dos diferentes métodos para el análisis de invasión celular y la migración: el análisis de la cámara de Boyden y en vitro video microscopio basado cicatrización ensayo. Los protocolos de estos dos experimentos se describen y se comparan con sus beneficios y desventajas.

Evaluación de la invasión celular y el proceso de migración: una comparación de Video cero basado en el microscopio de la herida el análisis y el análisis de la cámara de Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

El objetivo general de este experimento es informar y comparar los dos ensayos utilizados para estudiar la invasión y migración celular, el ensayo de cámara de Boyden y un ensayo optimizado de herida por arañazo basado en microscopio de video in vitro. Estos experimentos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de estudio de la invasión y la migración, como la elección del método más relevante. La principal ventaja de este ensayo optimizado de heridas por arañazo basado en microscopía de vídeo in vitro es que proporciona una comparación reproducible y precisa entre las condiciones de tratamiento.Aunque este método puede evaluar la migración e invasión celular, también se puede aplicar a otros campos de estudio, como la cicatrización o la regeneración de tejidos. Prepare las células SQ20B 72 horas antes del primer día del ensayo sembrando dos veces 10 por 1/6 de las células en 25 mililitros de medio de cultivo en un matraz de 175 centímetros cuadrados. Permita que las células crezcan hasta el 80% de confluencia celular a 37 grados centígrados.El primer día después de la tripsinización y el recuento de células, siembre las células en un matraz de 25 centímetros cuadrados a una densidad celular de seis veces 10 por 1/5 de células en tres mililitros de medio de cultivo para cada condición a evaluar. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, mata de hambre a las células reemplazando el medio en cada matraz con tres mililitros de medio de suero bovino fetal bajo.Prive a las células en la incubadora a 37 grados centígrados durante 24 horas. Para el ensayo de invasión, prepare las cámaras de Boyden recubiertas 12 horas después de comenzar la inanición celular. Coloque cada cámara Boyden en la placa complementaria.Agregue 500 microlitros de medio celular de inanición a cada cámara recubierta. Al día siguiente, al tercer día, use la placa complementaria para preparar el quimioatrayente. Llene cada pocillo de la placa complementaria de 24 pocillos con 750 microlitros de medio completo con FBS al 10%, hidrocortisona, penicilina y estreptomicina.Transfiera la cámara superior a la placa complementaria precargada con cuidado de evitar burbujas. Para el ensayo de invasión, retire con cuidado 450 microlitros de medio de cultivo de cada cámara Boyden. Después de la tripsinización y el recuento de las células SQ20B hambrientas, se sembró tres veces 10 a 1/4 de células en 500 microlitros de medio BSA al 0,1%, dando una dilución final de seis veces 10 a 1/4 de células por mililitro.Coloque la cámara Boyden en la incubadora a 37 grados centígrados durante 24 horas. En el cuarto día, retire cada inserto de la placa complementaria y retire con cuidado las células de la cámara superior con un hisopo de algodón. A continuación, fije y tiña cada inserto individualmente para obtener la coloración de May-Grunwald Giemsa utilizando un kit de tinción según las instrucciones del fabricante.Realiza análisis microscópicos el quinto día. Inserte la placa complementaria con los insertos en un microscopio de contraste de fase 20X y cuente cada célula migrada en la parte inferior de la membrana. 72 horas antes del primer día del ensayo, siembre dos veces 10 a las células SQ20B de 1/6 en 25 mililitros de medio de cultivo en un matraz de 175 centímetros cuadrados y permita que las células crezcan hasta el 80% de confluencia celular.El primer día, después de la tripsinización y el recuento de células, genere una muestra prediluida de las células SQ20B a una densidad de cuatro veces 10 por 1/5 de células por mililitro. Dispense 100 microlitros de la solución celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos para obtener una densidad final de cuatro veces 10 a 1/4 de celdas por cada 100 microlitros en cada pocillo. Coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados y permita que las células se adhieran a la placa durante 12 a 16 horas.Al día siguiente, lleve la placa a la capucha para herir con un dispositivo comercial para herir. Retire la parte superior del fabricante de heridas y colóquelo en la solución del bote de lavado. Inserte la placa en el soporte de la placa base y retire la cubierta de la placa.Reemplace el bloque de clavijas guiando las clavijas traseras del bloque de clavijas hacia los orificios traseros de la placa base. Empuje y mantenga presionada la palanca negra y levante el bloque de clavijas mientras continúa manteniendo presionada la palanca negra. Con ayuda de una pipeta con una punta cónica adaptada, retire inmediatamente el medio de cada pocillo, teniendo cuidado de no tocar la herida.Lave las células agregando a cada pocillo 100 microlitros de medio celular calentado a 37 grados centígrados. Después del segundo lavado, utilice una pipeta con una punta cónica adaptada para aspirar el medio celular. A continuación, agregue 100 microlitros de medio específico para cada condición de tratamiento a cada pocillo, asegurándose de evitar la creación de burbujas en los pocillos.Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte adaptado del microscopio de vídeo. Utilizando el software de microscopio de video, programe el programa de escaneos a una imagen por pocillo. Para un experimento de invasión migratoria se requiere un intervalo máximo de dos horas.Si el objetivo del experimento es producir un video, se prefiere un intervalo máximo de 30 minutos. Monitorizar y comprobar la migración celular durante un mínimo de 24 horas y hasta cinco días utilizando una mascarilla celular adecuada y adaptada a cada tipo de célula para analizar la migración celular. Para obtener una máscara de celda adaptada a cada línea celular, genere una definición de procesamiento de celdas a partir del software utilizando una colección de imágenes de celdas específica.Traza las curvas y exporta los datos a una hoja de cálculo que se puede utilizar para analizar y comparar los resultados. Para prepararse para el ensayo de invasión celular, siembre células SQ20B de la misma manera que se demostró para el ensayo de migración celular e incube la placa de 96 pocillos en la incubadora. En el segundo día del ensayo se prepara la matriz extracelular.Descongele la matriz a cuatro grados centígrados durante al menos 12 horas antes de usarla y asegúrese de que no haya agregados visibles. Enfríe los tubos de microcentrífuga en hielo durante cinco minutos. Diluir la matriz con puntas cónicas preenfriadas a cuatro grados centígrados en los tubos de microcentrífuga preenfriados con medio celular enfriado a cuatro grados centígrados para obtener una concentración final de 300 microgramos por mililitro.Mantenga los tubos de microcentrífuga con matriz prediluida en el refrigerador a cuatro grados centígrados. Recupere la placa de 96 pocillos de la incubadora. Debajo del capó, haga la herida con el dispositivo de herida comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante, como se demostró anteriormente.Utilice una pipeta con una punta cónica adaptada para eliminar inmediatamente el medio de cada pocillo y tenga cuidado de no tocar la herida. Lave las células dos veces con 100 microlitros de medio celular calentado a 37 grados centígrados. Después del segundo lavado, coloque la placa en hielo durante cinco minutos para equilibrar su temperatura.Retire el medio frío de cada pocillo, teniendo cuidado de pipetear cuidadosamente desde el borde y evitar tocar la herida. Usando puntas cónicas preenfriadas a cuatro grados centígrados, agregue 50 microlitros de matriz prediluida a cada pocillo. Coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos.Después de 30 minutos, agregue 100 microlitros del medio celular adaptado a cada pocillo según lo indicado para cada condición de tratamiento. Coloque la placa en la gradilla adaptada del microscopio de vídeo. Posteriormente, programe las exploraciones y realice el análisis de microscopía de video como se muestra para el ensayo de migración celular.Se muestran resultados representativos de una membrana de Boyden después de la fijación celular. La membrana subóptima tiene grupos de células en la parte superior de la membrana y resultados ininterpretables. Por el contrario, la membrana óptima tiene células contables en la parte inferior de la membrana teñidas de azul.Un resultado óptimo del ensayo de raspado de la herida se ilustra con estas imágenes de la cicatrización de la herida a la hora cero, 15 horas y 30 horas. Los criterios para un experimento de calidad son una herida lineal, que no se observen fragmentos celulares en la herida y una confluencia celular óptima. La confluencia del 90% es la densidad celular óptima para el ensayo de cicatrización de heridas, como se muestra en el panel A. El panel C muestra un ejemplo de baja densidad celular y el panel B muestra grupos de células causados por un lavado insuficiente de la pelletización celular.Esta representación gráfica de la cicatrización de heridas obtenida mediante el software de microscopio de vídeo muestra la cuantificación de los parámetros de confluencia celular de la herida según el tiempo para cuatro condiciones de tratamiento. Se observó que el tratamiento combinado disminuye significativamente la migración celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar el proceso de migración e invasión celular.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

De uso general, se describen métodos muy accesibles para el examen de la migración celular y la invasión in vitro. El primer método es el ensayo de cierre de la herida de células que mide la motilidad celular. El segundo método es la migración y la invasión de ensayo Transwell que evalúa la quimiotaxis y la capacidad invasiva de las células.

En la migración celular y la invasión ensayos in vitro

La investigación de la migración temprana de células endoteliales (EEC) es importante para comprender la fisiopatología de ciertas enfermedades y para identificar potencialmente nuevas estrategias para la intervención terapéutica. El siguiente protocolo describe las técnicas para evaluar la migración celular que han sido adaptadas para la investigación de la EEC.

Evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas

Este protocolo detalla un método adaptable para medir la migración de células en respuesta a quimioatrayentes, que también pueden ser utilizados para determinar la velocidad de difusión de un fármaco fuera de una matriz de polímero.

Una Cámara personalizable para medir la migración celular

Este protocolo describe un ensayo de invasión vertical invertido que podría ser utilizado para cuantificar la capacidad de migración y la invasión de las células en un entorno tridimensional conservando el microambiente celular. Este ensayo es adecuado para las células raras o sensibles.

Mover hacia arriba: Un Simple y Flexible In Vitro invasión tridimensional protocolo

Este manuscrito describe cómo incisión-como lesiones sobre monocapas de células epiteliales cultivadas convenientemente modelo herida curativo en vitro, permitiendo la proyección de imagen de confocal o microscopia de la exploración del laser, y que puede proporcionar alta calidad datos cuantitativos y cualitativos para el estudio de comportamiento de la célula y los mecanismos implicados en la migración.

Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro

Aquí describimos un procedimiento para probar la migración la célula en vitro con un microscopio de cámara óptica automatizada. El ensayo de rayado ha sido ampliamente utilizado donde el cierre de la raya es seguido por un período determinado. El microscopio óptico permite la detección confiable y barata de migración de la célula.

Optimizado el ensayo de rayado para In Vitro pruebas de migración de la célula con una cámara óptica automatizada

Aquí, describimos la técnicas de imagen de células vivas para medir cuantitativamente la migración y la invasión de células de glioblastoma cerebral tumor con el tiempo y las condiciones de tratamiento múltiples.

Análisis de imágenes de células vivas para estudio Glioblastoma cerebral Tumor células madre migración y la invasión

El actual protocolo describe un método integrado de investigación migración de la célula de cáncer y la invasión en una única plataforma en tiempo real, proporcionando una opción fácilmente reproducible y eficiente para estudiar la morfología y movilidad de la célula.

Un flujo de trabajo Simple migración/invasión usando a un sensor automatizado de células vivas

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de arañazos in vitro utilizando fibroblastos primarios y para un ensayo de cicatrización de heridas de piel in vivo en ratones. Ambos ensayos son métodos sencillos para evaluar la cicatrización in vitro e in vivo de heridas.

Ensayo de migración de arañazos y cámara dorsal Skinfold para análisis In Vitro e In Vivo de sanación de heridas

Presentamos un método rentable para el ensayo de migración de arañazos que proporciona un nuevo enfoque para determinar la migración celular sin el uso de métodos intensivos en equipos. Mientras que los fibroblastos se utilizaron en este protocolo, se pueden adaptar y utilizar para estudiar tipos celulares adicionales e influencias en la migración celular.

Un ensayo de migración de arañazos rentable y adaptable

Este estudio presenta el ensayo bidimensional (2D) de migración de heridas por arañazo y el ensayo tridimensional (3D) de brotes esferoides, junto con sus respectivos métodos de análisis posteriores, incluida la extracción de ARN y la inmunocitoquímica, como ensayos adecuados para estudiar la angiogénesis in vitro.

Investigación de la angiogénesis a nivel funcional y molecular mediante el uso del ensayo de migración de heridas por arañazo y el ensayo de germinación de esferoides.

Aprende a evaluar la invasión y migración celular comparando el ensayo de cámara de Boyden con el método de herida por microscopía de video. Estas técnicas permiten obtener resultados reproducibles en estudios de biología celular.

Evaluación de la invasión celular y el proceso de migración: una comparación de Video cero basado en el microscopio de la herida el análisis y el análisis de la cámara de Boyden (Video) | JoVE Journal

Evaluación de la invasión celular y el proceso de migración: una comparación de Video cero basado en el microscopio de la herida el análisis y el análisis de la cámara de Boyden

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