Evaluación de la invasión celular y el proceso de migración: una comparación de Video cero basado en el microscopio de la herida el análisis y el análisis de la cámara de Boyden

El objetivo general de este experimento es informar y comparar los dos ensayos utilizados para estudiar la invasión y migración celular, el ensayo de cámara de Boyden y un ensayo optimizado de herida por arañazo basado en microscopio de video in vitro. Estos experimentos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de estudio de la invasión y la migración, como la elección del método más relevante. La principal ventaja de este ensayo optimizado de heridas por arañazo basado en microscopía de vídeo in vitro es que proporciona una comparación reproducible y precisa entre las condiciones de tratamiento.

Aunque este método puede evaluar la migración e invasión celular, también se puede aplicar a otros campos de estudio, como la cicatrización o la regeneración de tejidos. Prepare las células SQ20B 72 horas antes del primer día del ensayo sembrando dos veces 10 por 1/6 de las células en 25 mililitros de medio de cultivo en un matraz de 175 centímetros cuadrados. Permita que las células crezcan hasta el 80% de confluencia celular a 37 grados centígrados.

El primer día después de la tripsinización y el recuento de células, siembre las células en un matraz de 25 centímetros cuadrados a una densidad celular de seis veces 10 por 1/5 de células en tres mililitros de medio de cultivo para cada condición a evaluar. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, mata de hambre a las células reemplazando el medio en cada matraz con tres mililitros de medio de suero bovino fetal bajo.

Prive a las células en la incubadora a 37 grados centígrados durante 24 horas. Para el ensayo de invasión, prepare las cámaras de Boyden recubiertas 12 horas después de comenzar la inanición celular. Coloque cada cámara Boyden en la placa complementaria.

Agregue 500 microlitros de medio celular de inanición a cada cámara recubierta. Al día siguiente, al tercer día, use la placa complementaria para preparar el quimioatrayente. Llene cada pocillo de la placa complementaria de 24 pocillos con 750 microlitros de medio completo con FBS al 10%, hidrocortisona, penicilina y estreptomicina.

Transfiera la cámara superior a la placa complementaria precargada con cuidado de evitar burbujas. Para el ensayo de invasión, retire con cuidado 450 microlitros de medio de cultivo de cada cámara Boyden. Después de la tripsinización y el recuento de las células SQ20B hambrientas, se sembró tres veces 10 a 1/4 de células en 500 microlitros de medio BSA al 0,1%, dando una dilución final de seis veces 10 a 1/4 de células por mililitro.

Coloque la cámara Boyden en la incubadora a 37 grados centígrados durante 24 horas. En el cuarto día, retire cada inserto de la placa complementaria y retire con cuidado las células de la cámara superior con un hisopo de algodón. A continuación, fije y tiña cada inserto individualmente para obtener la coloración de May-Grunwald Giemsa utilizando un kit de tinción según las instrucciones del fabricante.

Realiza análisis microscópicos el quinto día. Inserte la placa complementaria con los insertos en un microscopio de contraste de fase 20X y cuente cada célula migrada en la parte inferior de la membrana. 72 horas antes del primer día del ensayo, siembre dos veces 10 a las células SQ20B de 1/6 en 25 mililitros de medio de cultivo en un matraz de 175 centímetros cuadrados y permita que las células crezcan hasta el 80% de confluencia celular.

El primer día, después de la tripsinización y el recuento de células, genere una muestra prediluida de las células SQ20B a una densidad de cuatro veces 10 por 1/5 de células por mililitro. Dispense 100 microlitros de la solución celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos para obtener una densidad final de cuatro veces 10 a 1/4 de celdas por cada 100 microlitros en cada pocillo. Coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados y permita que las células se adhieran a la placa durante 12 a 16 horas.

Al día siguiente, lleve la placa a la capucha para herir con un dispositivo comercial para herir. Retire la parte superior del fabricante de heridas y colóquelo en la solución del bote de lavado. Inserte la placa en el soporte de la placa base y retire la cubierta de la placa.

Reemplace el bloque de clavijas guiando las clavijas traseras del bloque de clavijas hacia los orificios traseros de la placa base. Empuje y mantenga presionada la palanca negra y levante el bloque de clavijas mientras continúa manteniendo presionada la palanca negra. Con ayuda de una pipeta con una punta cónica adaptada, retire inmediatamente el medio de cada pocillo, teniendo cuidado de no tocar la herida.

Lave las células agregando a cada pocillo 100 microlitros de medio celular calentado a 37 grados centígrados. Después del segundo lavado, utilice una pipeta con una punta cónica adaptada para aspirar el medio celular. A continuación, agregue 100 microlitros de medio específico para cada condición de tratamiento a cada pocillo, asegurándose de evitar la creación de burbujas en los pocillos.

Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte adaptado del microscopio de vídeo. Utilizando el software de microscopio de video, programe el programa de escaneos a una imagen por pocillo. Para un experimento de invasión migratoria se requiere un intervalo máximo de dos horas.

Si el objetivo del experimento es producir un video, se prefiere un intervalo máximo de 30 minutos. Monitorizar y comprobar la migración celular durante un mínimo de 24 horas y hasta cinco días utilizando una mascarilla celular adecuada y adaptada a cada tipo de célula para analizar la migración celular. Para obtener una máscara de celda adaptada a cada línea celular, genere una definición de procesamiento de celdas a partir del software utilizando una colección de imágenes de celdas específica.

Traza las curvas y exporta los datos a una hoja de cálculo que se puede utilizar para analizar y comparar los resultados. Para prepararse para el ensayo de invasión celular, siembre células SQ20B de la misma manera que se demostró para el ensayo de migración celular e incube la placa de 96 pocillos en la incubadora. En el segundo día del ensayo se prepara la matriz extracelular.

Descongele la matriz a cuatro grados centígrados durante al menos 12 horas antes de usarla y asegúrese de que no haya agregados visibles. Enfríe los tubos de microcentrífuga en hielo durante cinco minutos. Diluir la matriz con puntas cónicas preenfriadas a cuatro grados centígrados en los tubos de microcentrífuga preenfriados con medio celular enfriado a cuatro grados centígrados para obtener una concentración final de 300 microgramos por mililitro.

Mantenga los tubos de microcentrífuga con matriz prediluida en el refrigerador a cuatro grados centígrados. Recupere la placa de 96 pocillos de la incubadora. Debajo del capó, haga la herida con el dispositivo de herida comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante, como se demostró anteriormente.

Utilice una pipeta con una punta cónica adaptada para eliminar inmediatamente el medio de cada pocillo y tenga cuidado de no tocar la herida. Lave las células dos veces con 100 microlitros de medio celular calentado a 37 grados centígrados. Después del segundo lavado, coloque la placa en hielo durante cinco minutos para equilibrar su temperatura.

Retire el medio frío de cada pocillo, teniendo cuidado de pipetear cuidadosamente desde el borde y evitar tocar la herida. Usando puntas cónicas preenfriadas a cuatro grados centígrados, agregue 50 microlitros de matriz prediluida a cada pocillo. Coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, agregue 100 microlitros del medio celular adaptado a cada pocillo según lo indicado para cada condición de tratamiento. Coloque la placa en la gradilla adaptada del microscopio de vídeo. Posteriormente, programe las exploraciones y realice el análisis de microscopía de video como se muestra para el ensayo de migración celular.

Se muestran resultados representativos de una membrana de Boyden después de la fijación celular. La membrana subóptima tiene grupos de células en la parte superior de la membrana y resultados ininterpretables. Por el contrario, la membrana óptima tiene células contables en la parte inferior de la membrana teñidas de azul.

Un resultado óptimo del ensayo de raspado de la herida se ilustra con estas imágenes de la cicatrización de la herida a la hora cero, 15 horas y 30 horas. Los criterios para un experimento de calidad son una herida lineal, que no se observen fragmentos celulares en la herida y una confluencia celular óptima. La confluencia del 90% es la densidad celular óptima para el ensayo de cicatrización de heridas, como se muestra en el panel A. El panel C muestra un ejemplo de baja densidad celular y el panel B muestra grupos de células causados por un lavado insuficiente de la pelletización celular.

Esta representación gráfica de la cicatrización de heridas obtenida mediante el software de microscopio de vídeo muestra la cuantificación de los parámetros de confluencia celular de la herida según el tiempo para cuatro condiciones de tratamiento. Se observó que el tratamiento combinado disminuye significativamente la migración celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar el proceso de migración e invasión celular.