Summary
Las corrientes sinápticas pueden grabarse focal de visualizadas botones sinápticos en la Drosophila tercer instar larvas Unión neuromuscular. Esta técnica permite la monitorización de la actividad de una sola bouton sináptico.
Abstract
Unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) es un sistema modelo excelente para estudiar la transmisión sináptica glutamatérgica. Describimos la técnica de las grabaciones de macropatch focal de corrientes sinápticas de botones visualizados en la NMJ de Drosophila larvas. Esta técnica requiere fabricación modificada para requisitos particulares de grabación micropipetas, así como un microscopio compuesto equipado con un gran aumento, objetivo de inmersión de agua de larga distancia, óptica de interferencia diferencial (DIC) de contraste y un fluorescente accesorio. El electrodo de registro se coloca en la parte superior de un seleccionado bouton sináptico visualizado con DIC óptica, epi-fluorescencia o ambos. La ventaja de esta técnica es que permite seguimiento de la actividad sináptica de un número limitado de sitios de liberación. El electrodo de la grabación tiene un diámetro de varias micras, y los sitios de liberación colocados fuera del borde del electrodo no afectar significativamente las corrientes registradas. Las corrientes sinápticas grabadas tienen cinética rápida y pueden ser fácilmente resuelto. Estas ventajas son especialmente importantes para los estudios de líneas de mosca mutantes con mayor actividad sináptica espontánea o asincrónica.
Introduction
Drosophila es un sistema modelo excelente para estudiar los mecanismos moleculares de control de la transmisión sináptica. El sistema neuromuscular de Drosophila es glutamatérgica, y por lo tanto, la Unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) puede utilizarse para estudiar las características conservadas de liberación glutamatérgica. Desde Jan y de Jan estudio1, las larvas de tercer estadio se ha utilizado ampliamente para estudiar la transmisión sináptica espontánea y evocada mediante el control de los potenciales excitatorios cruce (EJPs) o corrientes (EJCs). EJPs comúnmente se registran intracelular con un micro-electrodo de vidrio afilado, y reflejan la actividad de la NMJ entera, incluyendo todos los botones haciendo sinapsis en la fibra muscular determinada.
Por el contrario, puede registrar la actividad de un número limitado de los sitios de liberación focal colocando una punta de micropipeta cerca terminales neuronales o varicosidades sinápticas. Esta técnica fue empleada originalmente por Katz y Miledi2y grabaciones extracelulares focal han sido empleadas con éxito en varias preparaciones de NMJ, incluyendo rana3,4,5, ratón6 , 7 , 8, crustáceos9,10,11,12,13,14,15,16y Drosophila17,18,19,20,21,22,23. Este enfoque fue desarrollado por Dudel, que había optimizado macropatch recodificación electrodos24,25. En la implementación de Dudel, esta técnica muy igualados con el método de la abrazadera del remiendo flojo26.
La NMJ de Drosophila larvas ha definido claramente los botones sinápticos, y líneas transgénicas con las etiquetas fluorescentes neuronales genéticamente codificados (véase Tabla de materiales) están disponibles. Estas ventajas nos permitieron grabar EJCs y mEJCs de un bouton sináptico seleccionado20,21,22. Aquí, describimos esta técnica en detalle.
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Protocol
1. fabricación de electrodos de grabación
- tira de los electrodos de vidrio
- uso el siguiente protocolo para el tirador de microelectrodo (véase Tabla de materiales):
- línea 1: calor Tire de 510 - velocidad 30 tiempo 250; Línea 2: Calor tire 490 - velocidad 30 tiempo 250.
Nota: Unidades de tiempo corresponden a 0,5 m por unidad; las otras unidades son relativas. El valor del calor debe ajustarse para cada filamento, después de realiza la prueba de rampa.
- línea 1: calor Tire de 510 - velocidad 30 tiempo 250; Línea 2: Calor tire 490 - velocidad 30 tiempo 250.
- Uso de un microscopio (35 aumentos) para que el diámetro interior del electrodo tirado está en la gama de 7-10 μm ( figura 1A). Almacenar los tubos capilares en recipientes herméticamente cerrados para evitar la acumulación de polvo.
- uso el siguiente protocolo para el tirador de microelectrodo (véase Tabla de materiales):
- Fuego pulido
- tubos capilares fuego polaco (80-90% del valor máximo de calor para 1-2 s) usando una micro-forja (véase Tabla de materiales). El diámetro interior final del electrodo pulido esté 5 μm ( figura 1A) 27.
- Flexión
Nota: se hacen dos curvas para colocar el electrodo en la parte superior del músculo bajo un objetivo de gran aumento.- Uso el aparato mostrado en la figura 1B. Fijar el electrodo en el manipulador y coloque la punta sobre el filamento, no tocar lo
- Conjunto valor a 60-70% del máximo del calor y apriete el pedal de la fragua de micro de 1-2 s (véase Tabla de materiales) para calentar el filamento. Utilice una aguja en forma de L para suavemente tire hacia abajo la punta del electrodo ( figura 1B ampliada). Realizar la curva en aproximadamente 90 o ( figura 1).
- Sostener el electrodo sobre la llama de la antorcha a mano usando pinzas y hacer la segunda curva a una distancia de 7-10 mm de la primera curva y en un ángulo de aproximadamente 120 o ( figura 1).
figura 1. Pasos finales de la fabricación de una micropipeta. (A) electrodo consejos después de tirar y fuego pulido. (B.1) la configuración para el doblez de la punta. (B.2) el área de caja se muestra ampliada a la derecha. El electrodo y el filamento se fijan para que la punta del electrodo está situado un poco por encima el cable y no tocar. (C.1) el electrodo de la grabación. (C.2) el área de caja se muestra ampliada a la derecha. La primera curva tiene un ángulo de aproximadamente 90° y la distancia entre la primera curva y la punta del electrodo es de aproximadamente 1 mm. escala de la barra = 3 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. pasos preparatorios adicionales
- Prepare la solución de heamolymph-like (HL3) (en mM): NaCl 70, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trehalosa, sacarosa 115, 5 HEPES y 1 mM CaCl 2; ajustar el pH a 7.3 - 7.4. mantener la solución en la nevera y hacer fresco cada semana.
- Hacer pipetas de estimulación la misma manera como grabación de vidrio pipetas, excepto que no es necesario doblarlas.
Nota: La preparación de los electrodos de estímulo se describe detalladamente en 28 y 27. El diámetro final después de pulir de fuego debe estar en el rango de 5-7 μm. - Insertar una pipeta de estimulación en un soporte de microelectrodo conectada a una jeringa de.
- Placas de disección fabricación de pequeños platos de petri (35 x 10 mm) recubiertos con epoxi de caucho de silicona (véase Tabla de materiales) como se describe en 28.
Nota: El caucho de silicón debe ser completamente endurecido antes de uso. - Elegir un errante larvas de tercer estadio y diseccionar como se describe en 27 , 28 , 29 , 30.
Nota: Para visualizar los botones, usar la cepa mosca CD8-GFP (véase Tabla de materiales)- usar fórceps (véase Tabla de materiales), recoger las larvas de estadio 3 rd de un frasco de.
- Clavija las larvas, colocando el primer pasador posterior y la otra clavija anterior (cierre a ganchos de la boca).
- HL3 Agregar solución.
- Hacer un corte con tijeras de primavera (véase Tabla de materiales) desde el pasador superior a la inferior en el lado dorsal de las larvas de.
- Pin el filete de larvas, colocando 2 clavijas adicionales en los lados izquierdo y derecho de las larvas de.
- Quitar las tripas y traquear usando fórceps.
- Cortar los nervios a las afueras de la cuerda ventral del nervio con unas tijeras de muelle.
3. Grabaciones eléctricas de EJCs
figura 2. La configuración de grabación. La muestra cubrió para el silicio recubierto de Petri (flecha) se coloca sobre el escenario móvil del microscopio compuesto vertical equipado con epifluorescencia, un objetivo de gran aumento y dos micromanipuladores NMJ. Se coloca el microscopio en una mesa antivibración. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Grabación
- lugar el plato petri con la preparación sobre la platina del microscopio ( figura 2). Colocar el electrodo de referencia en el baño.
- Rellenar el electrodo de la grabación con solución de HL3. Bajo el objetivo de 10 x (véase Tabla de materiales), sumergir el electrodo en el baño y coloque sobre los músculos 6 y 7 de los segmentos abdominales 2, 3 o 4 con el micromanipulador () (véase Tabla de materiales) figura 3 A.1 y A.2).
- Cambiar el objetivo a x 60 (véase Tabla de materiales). Se centran en el área de interés usando epi-fluorescencia u óptica CID. Coloque la punta del electrodo en la parte superior bouton sináptico ( figura 3 B.1-3).
- Presionar el electrodo muy suavemente en el músculo. La presión excesiva puede dañar el NMJ o inducir un aumento en la actividad sináptica espontánea. Asegúrese de que la punta del electrodo no es obstruido - si es, reemplazar it
- Encender el amplificador, Junta de A/D y el equipo.
- Elegir el modo de pinza de voltaje del amplificador de.
- Iniciar el software de adquisición y elegir la ' boquete-libre ' modo de.
- Observar la aparición de mEJCs en la pantalla del ordenador.
- Asegurarse de que la amplitud de la mEJCs está en el rango de 0.2 - 0.7 na
Nota: EJCs más pequeño indican que el electrodo de la grabación tiene defectos o que no esté posicionado correctamente.
figura 3. Visualización de los botones sinápticos. (A) A brightfield imagen de un hemi-segmento bajo 10 aumentos (A.1) y el área ampliada en caja mostrando los músculos 6 y 7 (A.2, la flecha marca el electrodo de la grabación). Barra de escala = 50 μm. (B) botones sinápticos se visualizan en una línea de Drosophila con un marcador neuronal genéticamente codificado (CD8-GFP) usando proyección de imagen de epi-fluorescencia (B.1) o DIC óptica (B.2). Imágenes son tomadas con el 60 x objetivo y el cubo de filtro para la proyección de imagen de GFP (véase Tabla de materiales). Synaptic botones están marcados con flechas, y B.3 muestra una superposición de imágenes DIC y fluorescentes. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- estimulación
- utilizando un micromanipulador, bajo un control visual, coloque el electrodo de estimulación cerca el axón inervan segmentos abdominales 2-4.
- Aplicar presión negativa tirando el émbolo de la jeringa conectada al cable porta electrodo, por lo que el axón se tira dentro del electrodo ( figura 2).
- Activar el estimulador. Gire el mando de la unidad de aislamiento (véase Tabla de materiales) para establecer una corriente de cero y luego irá aumentando progresivamente, hasta que aparezcan EJCs (o hasta que se alcanza el umbral).
- Realizar la estimulación en un régimen del suprathreshold, con la estimulación actual aumenta aproximadamente dos veces, en comparación con el umbral para la observación de los EJCs.
Nota: En nuestra experiencia, tal intensidad de estímulo es óptimo para evitar fallos de potencial de acción y potencial de acción de la leña. Por ejemplo, si EJCs aparecen en la corriente de estimulación de 0,2 mA, utilice una corriente de 0,4 mA durante todo el experimento.
- Resistencia
- Mida la resistencia del sello del electrodo de macropatch grabación girando el interruptor de la resistencia de electrodo del amplificador a " prueba del sello " posición. Observar que se mostrará el valor de la resistencia del sello en GΩ en el " actual " ventana.
- Asegúrese de que la resistencia del sello está en el rango de 0.5 - 2 M Ω. Valores fuera de este rango indican que el electrodo es no bien pulido o no debidamente colocado.
- Controlar la resistencia del sello a lo largo de la grabación, asegurándose de que permanece constante durante todo el experimento.
4. Análisis
- analizar grabaciones empleando personalizado software para el análisis (véase Tabla de materiales).
Nota: Nuestro laboratorio utiliza software interno turísticos 31, que está modificado para requisitos particulares para la detección de los EJCs y mEJCs grabados focal ( figura 4). Este software incluye un filtro digital gaussiano y permite la detección de picos cuántico de superposición cuántico múltiples eventos ( Figura 4A). Otros enfoques se describen en 17.
figura 4. Análisis cuántico. Detección de mEJCs (A) y (B) EJCs por software turísticos. La zona de eventos está marcada en verde y picos están marcados por las puntas de flecha rojos. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Grabaciones de macropatch focal permiten monitoreo actividad sináptica de las botones sinápticos (figura 5). Cuando el electrodo se coloca en la parte superior un bouton sináptico (figura 5A, sitio 1), el grabado mEJCs (figura 5, Página 1) tienen una amplitud significativamente superior al nivel de ruido y sostenido aumento de las fases (en un rango de los milisegundos). Cuando el electrodo de la grabación es alejado el bouton sináptico de varias micras (figura 5A, sitio 2), las amplitudes de la decadencia de mEJCs grabada casi al nivel de ruido (figura 5B, sitio 2). Los EJCs grabados apenas pueden distinguirse del ruido y han prolongado aumento de fases (figura 5, sitio 2 versus sitio 1).
El número limitado de sitios de liberación contribuyendo a grabado EJCs y mEJCs, así como rápida cinética de las corrientes sinápticas grabado focal, permite la detección exacta de los eventos de lanzamiento en mutantes con elevada actividad sináptica. Esto puede ilustrarse claramente por las grabaciones de mEJCs de complexin mutante nulo (figura 6A). La actividad espontánea se eleva drásticamente en este mutante32, y por lo tanto mEJPs registrados intracelularmente se superponen y no puede ser claramente distinguidos de uno a (Figura 6B), mientras que grabaciones focal22 permiten precisa detección de eventos de lanzamiento espontáneo (Figura 4A).
Figura 5. Grabaciones de los EJCs y mEJCs de un bouton seleccionado. (A) colocando el electrodo sobre un seleccionado bouton (sitio 1) y alejándose de bouton (sitio 2). Las imágenes muestran el CD8-GFP NMJ etiquetado visualizado con epi-fluorescencia (A.1), electrodo de la grabación sobre la fibra muscular (A.2), y recubrimientos (A.3, A.4), con el electrodo colocado sobre el sitio 1 (A.3) o () sitio 2 A.4). barra de escala = 10 μm. (B) mEJCs grabados de bouton (sitio 1) son claramente distinguidas del ruido de la grabación y tienen fases de ascenso rápidas. En cambio, mEJCs registrado de sitio 2 no se pueden distinguir confiablemente desde el ruido de la grabación, sus amplitudes se reducen varias veces, y tienen un curso más lento del tiempo. (C) las Amplitudes de EJCs de bouton (sitio 1) exceden por muchas veces que las amplitudes de los EJCs registradas del sitio 2, y también tienen cinética más rápida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Macropatch focal versus grabaciones intracelulares. Grabaciones focal permiten una detección precisa de mEJCs en el mutante nulo complexin (A), al tiempo que grabaciones intracelulares (B) de esta mutante muestra liberan eventos que se superponen y no pueden detectarse confiablemente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Drosophila representa un organismo modelo ventajoso para el estudio de la transmisión sináptica. Varias configuraciones de grabación se han utilizado en el NMJ larvas, incluyendo grabaciones intracelulares de potenciales sinápticos, grabaciones de corrientes sinápticas y voltaje de dos electrodos abrazadera33,34, macropatch focal grabaciones de corrientes sinápticas que se describe aquí. La última técnica permite la cuantificación precisa de la transmisión sináptica en botones visualizados.
El éxito del protocolo descrito depende críticamente de la habilidad de visualizar claramente el área de interés y para personalizar la preparación de los electrodos de la grabación. Así, la calidad óptica DIC, un objetivo de inmersión de agua de alta magnificación con una distancia de funcionamiento larga y equipos personalizados para fuego pulido y curvado de electrodos de grabación son críticamente importantes.
La ventaja de este enfoque es que permite supervisar la actividad de algunas sinapsis que se colocan bajo el electrodo de la grabación. Cabe señalar, sin embargo, botones colocados cerca del borde del electrodo pueden también contribuir a la actividad registrada. Por lo tanto, es fundamental, que la posición de los electrodos, así como la resistencia del sello, no cambia en el curso del experimento.
La capacidad para monitorear la actividad de un bouton solo puede combinarse potencialmente con las últimas tecnologías de imagen. Por ejemplo, la detección óptica de la actividad en zonas activas individuales35 puede combinarse con grabaciones focal de EJCs y mEJC, y esto podría acoplar la resolución espacial de detección óptica con resolución temporal de grabaciones eléctricas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El apoyo de la beca del NIH R01 MH 099557
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
| Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
| WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
| Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
| Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
| Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
| Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
| Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
| Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
| Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
| Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
| Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
| npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
| A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
| A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
| TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
| TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
| Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
| Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
| Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
| Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
| pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
| Quantan | In-house software | - | Software for signal processing |
| Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
| cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | - | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
| CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |
References
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