Summary
Sinaptik akımları, Drosophila Üçüncü INSTAR larva nöromüsküler kavşak görüntülenmeyecektir sinaptik boutons üzerinden focally kaydedilebilir. Bu teknik, tek bir sinaptik bouton etkinliğini izleme sağlar.
Abstract
Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ) glutamatergic sinaptik iletimi çalışmaya bir mükemmel model sistemidir. Biz odak macropatch kayıtları görüntülenmeyecektir boutons Drosophila larva NMJ, sinaptik akımlardan tekniğini tanımlamak. Bu teknik MİKROPİPETLER yanı sıra bileşik yüksek büyütme, uzun mesafe su daldırma amacı, farklı girişim kontrast (DIC) optik ve bir floresan mikroskop kayıt özelleştirilmiş imalat gerektirir Eki. Kayıt elektrot DIC optik, epi-floresan veya her ikisi ile görüntülenir seçilen bir sinaptik bouton üst kısmında konumlandırılmış. Bu teknik avantajı bu sınırlı sayıda site açıklaması sinaptik etkinliğini izlemeye olanak sağlamasıdır. Kayıt elektrot birkaç mikron çapında ve elektrot RIM dışında konumlandırılmış yayın siteleri kayıtlı akımları önemli ölçüde etkilemez. Kaydedilen sinaptik akımlar hızlı Kinetik var ve kolayca çözülebilir. Bu avantajlar özellikle mutasyona uğramış sinek hatları ile gelişmiş kendiliğinden ya da zaman uyumsuz sinirsel aktivite çalışmaları için önemlidir.
Introduction
Drosophila sinaptik iletimi denetleme moleküler mekanizmaları incelemek için mükemmel model bir sistemdir. Drosophila nöromüsküler sistemde glutamatergic ve bu nedenle Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ) glutamatergic yayın korunmuş özelliklerini incelemek için kullanılabilir. Jan Jan'ın çalışma ve1beri üçüncü INSTAR larva geniş eksitatör kavşak potansiyeller (EJPs) veya akımları (EJC'ler) izleyerek uyarılmış ve spontan sinaptik iletimi çalışma için kullanılmıştır. EJPs yaygın olarak intracellularly bir keskin cam mikro elektrot ile kaydedilir ve onlar sinapslarda belirli kas lif yapım tüm boutons de dahil olmak üzere tüm NMJ etkinliğini yansıtır.
Buna ek olarak, sınırlı sayıda sürüm site etkinliğini focally nöronal terminalleri veya sinaptik varicosities yakınındaki bir micropipette ipucu konumlandırma tarafından kaydedilir. Bu teknik aslında Katz ve Miledi2tarafından istihdam edildi ve başarıyla kurbağa3,4,5, fare6 dahil olmak üzere birkaç NMJ hazırlıklar istihdam Fokal hücre dışı kayıtları , 7 , 8, kabuklu9,10,11,12,13,14,15,16ve Drosophila17,18,19,20,21,22,23. Bu yaklaşım daha fazla elektrotlar24,25recoding macropatch en iyi duruma getirilmiş Dudel tarafından geliştirilmiştir. Dudel'ın uygulamasında bu teknik yakından gevşek-yama-kelepçe yöntemi26eşleştirdi.
Drosophila larva NMJ sinaptik boutons açıkça tanımladığı ve genetik olarak kodlanmış nöronal floresan Etiketler ( Tablo malzemelerigörmek) transgenik çizgilerle kolayca kullanılabilir. Bu avantajları bize EJC'ler ve seçili sinaptik bouton20,21,22mEJCs kaydetmek etkin. Burada, bu teknik ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. imalat kayıt elektrotlar
- kullanımı aşağıdaki cam elektrotlar çekerek protokolü için elektrot çektirme (Tablo malzemeleri görmek):
- Line 1: ısı 510 çek - hız 30 zaman 250; Line 2: 490 çekme - hız 30 ısı zaman 250.
Not: Zaman birimi birim başına 0.5 ms karşılık gelir; diğer birimleri görecelidir. Rampa test gerçekleştirildikten sonra ısı değerini her filaman için ayarlanmalıdır.
- Line 1: ısı 510 çek - hız 30 zaman 250; Line 2: 490 çekme - hız 30 ısı zaman 250.
- Çekti elektrot iç çapı 7-10 µm ( şekil 1A) aralığında olması için mikroskop (35 x büyütme) kullanın. Kılcal damarlar toz birikimi önlemek için sıkıca kapalı kaplarda saklayın.
- kullanımı aşağıdaki cam elektrotlar çekerek protokolü için elektrot çektirme (Tablo malzemeleri görmek):
- Yangın parlatma
- yangın Lehçe kılcal damarlar (1-2 s için maksimum ısı değeri % 80-90) mikro-demirhane kullanarak (Tablo malzemeleri görmek). Cilalı elektrot son iç çapı 5 µm ( şekil 1A) 27 olduğundan emin olun.
- Bükme
Not: iki virajlı elektrot yüksek büyütme objektif altında kas üstüne konumlandırmak için yapılır.- Kullanımı şekil 1B adımında gösterilen aparatı. Elektrot manipülatör içinde düzeltmek ve ucu onu değil müessir filament üzerinde konumlandırmak
- Set ısı değeri en fazla 60-70 oranında ve mikro-forge pedal için 1-2 s tuşuna basın (filaman ısı Malzemeleri tablo bkz:). L şeklindeki bir iğne yavaşça (büyütülmüş şekil 1B) elektrot uç çekmek için kullanın. Viraj yaklaşık 90 o ( şekil 1 c) olun.
- Elektrot meşale ateşte forseps kullanarak el ile sık ve ikinci bend bir mesafe üzerinden ilk bend 7-10 mm ve bir açıyla yaklaşık 120 o ( şekil 1 c).
şekil 1. Micropipette imalat son adımlar. (A) elektrot ipuçları çekerek ve yangın parlatma sonra. (B.1) ipucu bükme Kur. (B.2) kutulu alanının sağ tarafta genişlemiş gösterilir. Böylece elektrot ucunu biraz tel üzerinde konumlandırılmış ve değil dokunaklı elektrot ve filament sabittir. (C.1) kayıt elektrot. (C.2) kutulu alanının sağ tarafta genişlemiş gösterilir. İlk bend yaklaşık 90 ° vardır ve ilk bend elektrot ucu arasındaki mesafe yaklaşık 1 mm. ölçek kadar çubuk = 3 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
2. ek hazırlık adımları
- hazırla heamolymph gibi (HL3) çözüm (mM): 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trehalose, 115 Sükroz, 5 HEPES ve 1 mM CaCl 2 7.3 için-pH ayarlama; 7.4. çözüm buzdolabında saklayın ve her hafta taze olun.
- Dışında onları bükmeye gerek yok pipets, aynı şekilde kayıt olarak cam stimülasyon pipets olun.
Not: Stimülasyon elektrotlar hazırlanması ayrıntılı 28 ve 27 olarak tanımlanır. Yangın parlatma 5-7 µm aralığında olmalıdır sonra son çapı. - Bir elektrot tutucu bir stimülasyon pipet bağlı bir şırıngaya ekle.
- Üretim diseksiyon plakalar üzerinden küçük petri yemekler (35 x 10 mm) silikon kauçuk epoksi ile kaplı ( 28 içinde açıklandığı gibi Malzemeleri tablo görmek).
Not: Silikon kauçuk kullanmadan önce tamamen sertleşmiş olmalıdır. - Gezgin bir üçüncü-biçim larva almak ve 27 , 28 , 29 , 30 ' açıklandığı gibi incelemek.
Not: boutons görselleştirmek için sinek zorlanma CD8-GFP kullanın (bkz. Tablo reçetesi)- kullanma forseps, (bkz: Malzemeler tablo) almak 3 rd INSTAR larvaları bir şişe.
- İlk iğneyi posterior yerleştirerek larvalar, pin ve başka bir pin ağız kanca için anterior (Kapat).
- Ekleyin HL3 çözüm.
- (Bkz. Tablo reçetesi) bahar makas ta üst iğnesinden yukarıdan aşağıya doğru bir larva dorsal tarafta kullanarak bir kesim yapmak.
- Üstünde belgili tanımlık sol ve sağ taraflarındaki, larvalar 2 ek pimleri yerleştirerek larva fileto pin.
- Çıkarmak cesaret ve forseps kullanarak tracheas.
- Sadece bahar makas kullanarak ventral sinir kordonu dışında sinirler kesti.
3. Elektrik kayıtları EJC'ler
Şekil 2. Kayıt kurulum. Örnek NMJ silikon kaplı petri kabına (ok) dik bileşik mikroskop epifluorescence yetenekleri, yüksek büyütme objektif ve iki micromanipulators ile donatılmış hareketli sahne üzerinde konumlandırılmış sabitlenmiş. Mikroskop bir anti-titreşim tablo üzerinde konuşlu olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Kayıt
- yer petri kabına hazırlık mikroskop sahnede ( Şekil 2). Referans elektrot banyoda takın.
- Kayıt elektrot HL3 çözüm ile doldurun. 10 x amaç altında (bkz. Tablo reçetesi) elektrot banyo içine sokmak ve 6 ve 7 2, 3 veya 4 micromanipulator kullanarak karın segmentlerinin kaslar yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) () şekil 3 A.1 ve A.2).
- Geçiş yapma amacı için 60 x (Tablo malzemeleri görmek). Epi-floresan veya DIC optik kullanarak ilgi alan üzerinde odaklanın. Sinaptik bouton ( şekil 3 B.1-3) üstüne elektrot ucu yerleştirin.
- Elektrot kas üzerine hafifçe basın. Aşırı basınç NMJ zarar veya spontan sinirsel aktivite artışı teşvik. Elektrot ucu tıkanmış - Eğer o, bunu yerine dikkat edin
- Amplifikatör, A/D yönetim kurulu ve bilgisayar geçiş.
- Amplifikatör gerilim kelepçe konumunda seçin.
- Başlangıç Alım yazılım ve ' boşluk içermeyen ' modu.
- MEJCs bilgisayar ekranında görünümünü gözlemlemek.
- MEJCs genliği 0,2 - aralıkta olduğunu emin olun 0,7 na
Not: Daha küçük EJC'ler kayıt elektrot kusurları vardır veya bu doğru yerleştirilmiyor gösteriyor.
şekil 3. Görsel olarak sinaptik boutons. (A) A aydınlık alan görüntü, bir hemi-kesim 10 x büyütme (A.1) ve kas 6 ve 7 gösterilen genişlemiş kutulu alanının altında (A.2, ok işaretleri kayıt elektrot). Ölçek çubuğu = 50 µm. (B) sinaptik boutons genetik olarak kodlanmış nöronal marker (CD8-GFP) ile bir Drosophila satırda görüntülenir epi-floresan görüntüleme (B.1) veya DIC optik (B.2) kullanarak. Görüntüleri ile hedef ve filtre küp GFP görüntüleme için x 60 alınır (Tablo malzemeleri görmek). Synaptic boutons oklarla işaretlenmiş ve floresan ve DIC görüntülerin bir bindirme B.3 içinde gösterilir. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- stimülasyon
- görsel bir denetim altında bir micromanipulator kullanarak yer stimülasyon elektrot karın kesimleri 2-4 innerve axon yakınındaki.
- Şırınga piston çekerek negatif basınç uygula bağlı elektrot sahibine böylece akson elektrot ( Şekil 2) içinde çekti.
- Uyarıcı açın. Vana yalıtım Üniteyi açar (bir sıfır akım ayarlamak ve sonra yavaşça, EJC'ler görününceye kadar (veya eşik değerine ulaşılana kadar) artırmak için Malzemeler tablo bkz:).
- Bir suprathreshold rejim stimülasyon geçerli stimülasyon ile artmış yaklaşık iki kez, EJC'ler gözlenmesi için eşik göre gerçekleştir.
Not: deneyim, böyle stimülasyon yoğunluğu aksiyon potansiyeli başarısızlıklar ve aksiyon potansiyeli ateş önlemek için en iyi yöntemdir. Örneğin, EJC'ler 0.2 stimülasyon mevcut görünür anne, 0,4 mevcut kullanmak deneme boyunca anne.
- Direnç mühür
- amplifikatör için elektrot direnç anahtarı çevirerek kayıt macropatch elektrot mühür dayanıklılığını ölçmek " test mühür " pozisyon. GΩ mühür direnç değeri içinde görüntülenir gözlemlemek " geçerli " penceresi.
- 0.5 - 2 M aralığında dirençtir mühür emin olun Ω. Bu sınırların dışında değerler gösterir elektrot düzgün cilalı veya uygun şekilde konumlandırılmış.
- Mühür direnç kaydı boyunca izlemek, deney boyunca sabit kalır emin olmak istedim.
4. Analiz
- analiz kayıtları istihdam özelleştirilmiş yazılım analiz için (bkz. Tablo reçetesi).
Not: Bizim laboratuvar içi yazılım Quantan 31 EJC'ler ve focally kayıt mEJCs ( şekil 4) tespiti için özelleştirilmiş, kullanır. Bu yazılım bir Gauss dijital filtre içerir ve çok quantal olaylar ( şekil 4A) üst üste içinde quantal doruklarına algılama sağlar. Diğer yaklaşımlar 17 ' açıklanan.
şekil 4. Quantal analizi. , MEJCs (a) ve EJC'ler (B) Quantan yazılım tarafından. Olay alan yeşil işaretlenir ve tepeler tarafından kırmızı ok uçları işaretlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Odak macropatch kayıtları seçili sinaptik boutons (şekil 5) üzerinden izleme sinirsel aktivite etkinleştirin. Elektrot bir sinaptik bouton üst kısmında (şekil 5A, 1 sitesi) getirildiğinde kaydedilen mEJCs (şekil 5C, 1 sitesi) gürültü seviyesini önemli ölçüde aşan bir genlikleri var ve aşamaları (alt milisaniyelik mesafeden) yükselen keskin. Ne zaman kayıt elektrot uzak sinaptik bouton tarafından birkaç mikron (şekil 5A, site 2), kayıtlı mEJCs düşüş genlikleri neredeyse gürültü seviyesi (şekil 5B, site 2) taşınır. Kaydedilen EJC'ler zar zor gelen gürültü ayırt edilebilir ve aşamaları (şekil 5C, site 1 ve site 2) yükselen uzun.
Sınırlı sayıda yayın site hızlı Kinetik sinaptik akımlarının yanı sıra kaydedilen EJC'ler ve mEJCs katkıda focally kayıt, mutantlar yayın olayları doğru tespiti ile yükseltilmiş sinirsel aktivite sağlar. Bu açıkça mEJCs complexin null mutant (şekil 6A) gelen kayıtları tarafından gösterilmiştir. Spontan aktivite bu mutant32yılında büyük ölçüde yükselmiş ve bu nedenle mEJPs intracellularly kaydedilen örtüşme ve odak kayıtları22 etkinleştirmek iken doğru birbirinden (şekil 6B), açıkça ayırt edici olamaz spontan yayın olaylar (şekil 4A) olarak algılanması.
Şekil 5. EJC'ler ve mEJCs seçili bouton gelen kayıtları. (A)elektrot bir seçili bouton (sayfa 1) yerleştirerek ve bouton (site 2) uzak hareket. Elektrot (A.2), kas fiber üzerinden kayıt (A.1), epi-floresan ile Etiketlenmiş NMJ görselleştirildiği CD8-GFP resimleri göster ve yer paylaşımları (A.3, A.4), elektrot ile sitesi üzerinden 1 (A.3) veya site 2 () konumlandırılmış A.4). ölçek çubuğu = 10 bouton (sayfa 1) kaydedilen µm. (B) mEJCs kayıt gürültü açıkça ayırt edici olup hızlı yükselen aşamaları vardır. Buna ek olarak, mEJCs sitesinden 2 kaydedilen güvenilir bir şekilde kayıt gürültü ayırt edemez, onların genlikleri several-fold azaltılır ve onlar-si olmak daha yavaş bir zaman ders. (C) genlikleri in bouton (sayfa 1) kaydedilen EJC'ler çok katlı 2 siteden EJC'ler genlikleri kaydedildi tarafından ve onlar da daha hızlı Kinetik var. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6. Hücre içi kayıtları karşı odak macropatch. Hücre içi kayıtları (B) bu mutant sergi örtüşme ve güvenilir bir şekilde algılanamaz olayları sürümünde çalışırken odak kayıtları complexin null mutant(a)mEJCs doğru algılanmasını etkinleştirin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila sinaptik iletimi çalışmaya bir avantajlı model organizma temsil eder. Sinaptik potansiyelleri, kayıtları iki elektrot gerilimi kelepçe33,34ve Fokal macropatch ile sinaptik akıntılarının hücre içi kayıtları da dahil olmak üzere larva NMJ, birkaç kayıt yapılandırma kullanılmıştır Burada açıklanan sinaptik akıntılarının kayıtları. İkinci tekniği görüntülenmeyecektir boutons kesin miktar sinaptik iletimi sağlar.
Açıklanan protokol başarısı eleştirel açıkça ilgi alanı görselleştirmek ve elektrotlar kayıt hazırlık özelleştirmek için yeteneği üzerinde bağlıdır. Böylece, kalite DIC optik, bir yüksek büyütme su daldırma amacı bir parlatma ve elektrotlar kayıt bükme yangın için özelleştirilmiş donatım ve uzun çalışma mesafesi ile eleştirel önemlidir.
Bu yaklaşımın avantajı bu kayıt elektrot altında konumlandırılmış bir kaç sinapslarda etkinliğini izlemeye olanak sağlamasıdır. Bu unutulmamalıdır, ancak, elektrot RIM konumlandırılmış boutons da kayıtlı etkinlik için katkıda bulunabilir. Bu nedenle, elektrot yanı sıra mühür direnç konumunu sırasında deney değişmez, çok önemlidir.
Bir tek bouton etkinliğini izlemek için yeteneği potansiyel olarak son görüntüleme teknolojileri ile kombine edilebilir. Örneğin, bireysel etkin bölgeler35 aktivitesinin optik algılama EJC'ler ve mEJC Fokal kayıtları ile kombine edilebilir ve optik algılama Uzaysal çözünürlük elektrik kayıtlar zamansal çözünürlük ile bir çift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
NIH grant R01 MH 099557 tarafından desteklenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
| Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
| WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
| Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
| Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
| Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
| Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
| Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
| Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
| Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
| Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
| Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
| npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
| A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
| A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
| TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
| TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
| Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
| Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
| Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
| Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
| pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
| Quantan | In-house software | - | Software for signal processing |
| Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
| cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | - | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
| CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).
- Katz, B., Miledi, R. The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction. J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).
- Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals. J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).
- Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus). J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).
- Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R.
- Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens. J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).
- Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals. J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).
- Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse. Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).
- Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals. J Physiol. 383, 587-599 (1987).
- Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium. Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).
- Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction. J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).
- Zucker, R. S. Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses. J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).
- Zucker, R. S. Changes in the statistics of transmitter release during facilitation. J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).
- Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model. J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).
- Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction. J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).
- Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse. Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).
- Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus. J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
- Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. Postfusional control of quantal current shape. Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).
- Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons. Brain Res. 1178, 52-64 (2007).
- Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size. Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).
- Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion. Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).
- Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction. J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).
- Dudel, J. The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction. Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).
- Dudel, J. Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle. Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).
- Marrero, H. G., Lemos, J. R. Loose-Patch-Clamp method. , 2 ed, Humana Press. (2007).
- Wu, W. H., Cooper, R. L. Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle. J Vis Exp. (45), (2010).
- Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Imlach, W., McCabe, B. D. Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae. J Vis Exp. (24), (2009).
- Bykhovskaia, M. Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN. J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).
- Huntwork, S., Littleton, J. T. A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth. Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).
- Zhong, Y., Wu, C. F. Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade. Science. 251 (4990), 198-201 (1991).
- Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire. Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).
- Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones. J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).
