Summary
प्रत्यक्ष कैंसर के इंजेक्शन-व्युत्पन्न extracellular बुलबुले (ईवीएस) अस्थि मज्जा के reprogramming ट्यूमर प्रगति का समर्थन करने के लिए सुराग; हालांकि, जो कोशिकाएं इस आशय का मध्यस्थता करती हैं, वह अस्पष्ट है । साथ ही, हम vivo मेंev-मध्यस्थता ट्यूमर-mesenchymal स्टेम सेल (MSC) इंटरैक्शन की जांच करने के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, मेटास्टेसिस में ev-शिक्षित MSCs के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का खुलासा करते हैं ।
Abstract
ट्यूमर microenvironment के भीतर, निवासी या भर्ती mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) एकाधिक कैंसर के प्रकार में घातक प्रगति में योगदान । विशिष्ट पर्यावरणीय संकेतों के प्रभाव के तहत, ये वयस्क स्टेम सेल paracrine मध्यस्थों को त्वरित ट्यूमर विकास और मेटास्टेसिस के लिए जारी कर सकते हैं । ट्यूमर और MSCs के बीच crosstalk परिभाषित प्राथमिक महत्व का है करने के लिए अंतर्निहित कैंसर प्रगति तंत्र को समझने और उपचारात्मक हस्तक्षेप के लिए उपंयास लक्ष्यों की पहचान ।
कैंसर की कोशिकाओं extracellular बुलबुले की उच्च मात्रा (ईवीएस) का उत्पादन है, जो कि ट्यूमर microenvironment में या दूर के स्थलों पर लक्ष्य कोशिकाओं के व्यवहार को निराधार रूप से प्रभावित कर सकते हैं । ट्यूमर ईवीएस कार्यात्मक, भड़काऊ RNAs और (onco) प्रोटीन सहित अणुओं, कि stromal कोशिकाओं को शिक्षित करने के लिए कैंसर की कोशिकाओं के मेटास्टेटिक व्यवहार को बढ़ाने या पूर्व मेटास्टेटिक आला गठन में भाग लेने के लिए कर सकते है संलग्न । इस अनुच्छेद में, हम एक नैदानिक कैंसर माउस मॉडल है कि ट्यूमर और mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के बीच EV-मध्यस्थता crosstalk के विशिष्ट मूल्यांकन में सक्षम बनाता है के विकास का वर्णन । सबसे पहले, हम ट्यूमर स्रावित ईवीएस और MSCs द्वारा EV internalization के आकलन के शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन । हम तो एक मल्टीप्लेक्स मनका आधारित immunoassay का उपयोग करने के लिए एमएससी cytokine अभिव्यक्ति कैंसर ईवीएस द्वारा प्रेरित प्रोफ़ाइल के परिवर्तन का मूल्यांकन । अंत में, हम ऑस्टियो के एक bioluminescent orthotopic xenograft माउस मॉडल है कि ट्यूमर-एमएससी संपर्क recapitulates की पीढ़ी को वर्णन, और EV के योगदान दिखाने के लिए ट्यूमर विकास और MSCs गठन के लिए मेटास्टेसिस शिक्षित ।
हमारे मॉडल को परिभाषित करने का अवसर प्रदान करता है कैसे कैंसर ईवीएस आकार एक ट्यूमर का समर्थन वातावरण, और मूल्यांकन करने के लिए कि क्या ट्यूमर और MSCs के बीच EV मध्यस्थता संचार की नाकाबंदी कैंसर की प्रगति को रोकता है ।
Introduction
ट्यूमर microenvironment सक्रिय रूप से सबसे अधिक में भाग लेता है, नहीं तो सब, tumorigenesis और कैंसर प्रगति के पहलुओं, मेटास्टेसिस गठन और चिकित्सकीय के लिए प्रतिरोध के विकास सहित1. यह नैदानिक orthotopic कैंसर माउस मॉडल है कि जटिल ट्यूमर के विच्छेदन-स्ट्रोमा ट्यूमर आला में होने वाली बातचीत की अनुमति की जरूरत पर जोर देता है ।
ट्यूमर microenvironment के कई सेलुलर घटकों के अलावा, mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) दृढ़ता से स्तन कैंसर, प्रोस्टेट कैंसर, ब्रेन ट्यूमर, एकाधिक मायलोमा, और ऑस्टियो 2 जैसे कई कैंसर के प्रकार में कैंसर की प्रगति के लिए योगदान ,3,4,5,6,7. MSCs multipotent स्टेम कोशिकाओं है कि अस्थि मज्जा, वसा ऊतक, अपरा, गर्भनाल रक्त, और दूसरों के8,9सहित विभिंन वयस्क और भ्रूण ऊतकों में रहते हैं । कैंसर जनित भड़काऊ संकेतों के जवाब में, MSCs ट्यूमर साइटों की ओर पलायन, ट्यूमर microenvironment में शामिल है और अंत में कैंसर का समर्थन कोशिकाओं को10में अंतर । ये कैंसर से जुड़े MSCs आवश्यक कारक प्रदान (यानी, विकास कारकों, chemokines, साइटोकिंस, और immunosuppressive मध्यस्थों) ट्यूमर प्रगति दोनों ट्यूमर कोशिकाओं पर और आसपास के स्ट्रोमा पर अभिनय के लिए2, 3 , 11 , 12 , 13. जबकि ट्यूमर-कैंसर से संबंधित MSCs के प्रभाव को बढ़ावा देने के कई कैंसर के मॉडल में जांच की गई है, जो तंत्र द्वारा ट्यूमर कोशिकाओं reprogram MSCs एक कैंसर को बढ़ावा देने आला आकार खराब समझ रहे हैं । यहां हम एक orthotopic xenograft मॉडल है कि विशेष रूप से हड्डी कैंसर कोशिकाओं और extracellular बुलबुले (ईवीएस) के माध्यम से MSCs के बीच समर्थक tumorigenic बातचीत के अध्ययन की अनुमति देता है की पीढ़ी का वर्णन ।
ईवीएस ट्यूमर और stromal कोशिकाओं के बीच सेलुलर संचार के महत्वपूर्ण मध्यस्थों रहे हैं14. ईवीएस प्रोटीन, लिपिड, और विनियामक RNAs सहित मूल के कोशिका के कार्यात्मक अणुओं कैर्री । एक बार extracellular अंतरिक्ष में जारी, इन बुलबुले आसपास के कोशिकाओं द्वारा लिया जा सकता है या रक्त या लसीका परिसंचरण के माध्यम से दूर साइटों के लिए किया जाता है, और कर सकते है की स्थापना लक्ष्य सेल व्यवहार को प्रभावित करते हैं । 15 , 16 , 17 उदाहरण के लिए, stromal fibroblasts द्वारा कैंसर ईवीएस के तेज myofibroblast angiogenesis समर्थन और vivo18,19 मेंट्यूमर के विकास में तेजी का परिणाम हो सकता है internalization द्वारा endothelial कोशिकाओं ट्यूमर angiogenesis को उत्तेजित और नाड़ी पारगम्यता16,20वृद्धि कर सकते हैं, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत अर्बुदरोधी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया21का दमन करने के लिए नेतृत्व हो सकता है.
हम हाल ही में प्रदर्शन किया, ऑस्टियो के एक bioluminescent orthotopic xenograft माउस मॉडल का उपयोग कर, कि ट्यूमर कोशिकाओं ईवीएस के उच्च मात्रा में जारी है कि शीघ्र MSCs एक समर्थक tumorigenic और समर्थक मेटास्टेटिक phenotype प्राप्त करने के लिए । यह प्रभाव एमएससी cytokine अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में एक नाटकीय परिवर्तन के कारण है ("एमएससी शिक्षा" के रूप में संदर्भित), और एक चिकित्सीय interleukin के प्रशासन द्वारा रोका जा सकता है-6 रिसेप्टर (IL-6R) एंटीबॉडी7. हमारे काम का प्रदर्शन किया है कि कैंसर ईवीएस एमएससी व्यवहार के महत्वपूर्ण संग्राहक हैं, इस प्रकार microenvironment के लिए एक तर्क-लक्षित दृष्टिकोण ऑस्टियो प्रगति को रोकने के लिए प्रदान करते हैं । साथ ही, हम vivo मेंEV-मध्यस्थ ट्यूमर-MSC इंटरैक्शन की जांच करने के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । इस मॉडल के लिए करना है: 1) विशेष रूप से कैंसर EV-ट्यूमर microenvironment में एमएससी व्यवहार के प्रेरित परिवर्तन को परिभाषित, 2) का मूल्यांकन कैसे इस बातचीत हड्डी ट्यूमर विकास और मेटास्टेसिस गठन के लिए योगदान देता है, और 3) अध्ययन है कि हस्तक्षेप के साथ vivo में EV-मध्यस्थता crosstalk कैंसर की प्रगति को रोकता है ।
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Protocol
mesenchymal स्टेम सेल अलगाव के लिए मानव वसा ऊतकों को संस्थागत नैतिक समिति द्वारा अनुमोदन के बाद Tergooi अस्पताल (Hilversum, नीदरलैंड) के प्लास्टिक सर्जरी विभाग से प्राप्त किया गया और लिखित सूचित सहमति । GFP-पॉजिटिव वसा MSCs बच्चों और वयस्कों के लिए चिकित्सा और शल्य विज्ञान विभाग से प्राप्त किए गए (मोडेना विश्वविद्यालय और Reggio एमिलिया).
पशु प्रयोगों के अनुसार पशु प्रयोग पर डच कानून के साथ प्रदर्शन किया, और प्रोटोकॉल नजरों से देख विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र, एंस्टर्डम, नीदरलैंड के पशु प्रयोग पर समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
1. ट्यूमर स्रावित Extracellular बुलबुले के अलगाव ।
- ७०,००० x g पर रातोंरात (16 घंटे), कोई ब्रेक नहीं, 4 ° c में एक अल्ट्रा झूलते बाल्टी रोटर का उपयोग करके EV-घट भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) तैयार (मंदी के लिए 1 h की उंमीद) । सावधानी से गोली परेशान बिना supernatant (EV-घट FBS) इकट्ठा । EV-घट FBS को ०.२२ µm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें ।
- १०० U/ml पेनिसिलिन, १०० µ G/ml streptomycin, 2 mM glutamine (1x P/s/g) और 5% EV-समाप्त FBS के साथ Iscove के संशोधित Dulbecco के मध् यम (IMDM) को सप्लीमेंट करके EV-समाप्त संस् कृत माध् यम तैयार करें ।
- बीज 3 x 106 143B कोशिकाओं में १७५ सेमी2 कुप्पी और संस्कृति उंहें EV में समाप्त संस्कृति माध्यम में एक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2। जब कोशिकाओं रहे हैं ८०-९०% धाराप्रवाह (आमतौर पर ३६ के बाद एच के लिए ४८ एच), supernatant से x १७५ सेमी2 कुप्पी (28 मिलि/) EV-अलगाव के लिए इकट्ठा ।
- सेल supernatant को हटाने के लिए पहले से स्पष्ट करें और अंतर (पिछले स्पिन के supernatant को हर बार) के अनुसार कोशिकाओं और सेल मलबे को दूर करने के लिए निंनलिखित प्रोटोकॉल के मुताबिक:
- supernatant दो बार ५०० एक्स जी में 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
- 15 मिनट के लिए २००० x g पर दो बार supernatant केंद्रापसारक ।
- supernatant दो बार १०,००० एक्स जी में 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
- अधिकतम त्वरण और मंदी गति सेटिंग्स के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी केंद्रापसारक प्रदर्शन । प्रत्येक चरण के बाद, ध्यान से EV-युक्त supernatant एकत्र करें, जिसके पीछे लगभग 1 मिलीलीटर जा रहा है । १.५ कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ें या-८० ° c जब तक EV अलगाव पूर्व-खाली वातानुकूलित मध्यम की दुकान ।
- अलग ईवीएस केंद्रापसारक द्वारा पूर्व खाली वातानुकूलित मध्यम एक बार ७०,००० एक्स जी में 1 घंटे के लिए, धीमी गति से ब्रेक, अल्ट्रा में 4 ° c-केंद्रापसारक ट्यूबों (अंतिम मात्रा ३८.५ मिलीलीटर/एक अल्ट्रा झूलते बाल्टी रोटर का उपयोग कर ।
- ध्यान से supernatant निकालें, के बारे में 1 मिलीलीटर के पीछे जा रहा है, शेष मात्रा में EV-युक्त छर्रों reसस्पेंड, उन सब को एक ultracentrifuge ट्यूब में पूल, और पूरा ट्यूब भरने तक फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) जोड़ने (अंतिम मात्रा ३८.५ एमएल) ।
- एक बार फिर ७०,००० x g पर 1 के लिए एच 4 डिग्री सेल्सियस पर, ब्रेक के बिना (उंमीद 1 मंदी के लिए एच) । सावधानी से गोली परेशान बिना supernatant निकालें और १००-२०० µ एल पीछे छोड़ दें ।
- ev-गोली reसस्पेंड और पंजाब (सभी EV-अलगाव के लिए मानकीकृत) के साथ २०० µ l को अंतिम मात्रा समायोजित करें । EV तैयारी का तुरंत उपयोग करें या22का उपयोग करने तक-८० ° c पर स्टोर कर दें ।
नोट: ईवीएस-८० ° c पर 6 महीने तक संग्रहित किया जा सकता है ।
2. EV लक्षण वर्णन ।
शुद्ध ईवीएस संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि)23द्वारा visualized किया जा सकता है ।
- फॉस्फेट बफर में 4% paraformaldehyde की एक बराबर मात्रा के साथ EV तैयारी मिश्रण ।
- कोट २०० मेष Formvar-कार्बन लेपित निकल उनि ग्रिड 5 µ एल के साथ 20 मिनट के लिए EV निलंबन के कमरे के तापमान पर ।
- ०.१ M फास्फेट बफर (पीएच ७.०), uranyl oxalate (पीएच ७.०) के साथ इसके विपरीत में 1% glutaraldehyde के साथ उनि ग्रिड पर EV नमूनों का निर्धारण, और बर्फ पर 1:9 अनुपात में 4% uranyl एसीटेट और 2% मिथाइल फाइबर का एक मिश्रण में एंबेड ।
- स्टेनलेस स्टील छोरों के साथ ग्रिड निकालें और मिथाइल फाइबर फिल्म की एक उपयुक्त मोटाई सुनिश्चित करने के लिए फिल्टर कागज के साथ अतिरिक्त द्रव दाग ।
- सुखाने के बाद, एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ ग्रिड की जांच और एक डिजिटल इसी छवि सॉफ्टवेयर को युग्मित कैमरा के साथ छवियों पर कब्जा ।
३. ट्यूमर-व्युत्पन्न ईवीएस द्वारा MSCs की शिक्षा.
- अल्फा-न्यूनतम आवश्यक माध्यम (अल्फा-मेम) के साथ 4% EV-घट मानव प्लेटलेट Lysate (एचपीएल)24, हेपरिन (10 U/mL) और 1x P/S/जी के पूरक द्वारा MSC संस्कृति माध्यम तैयार करें ।
नोट: EV-समाप्त एचपीएल खंड १.१ में वर्णित कार्यविधि के बाद प्राप्त किया गया है । - बीज १.४ x 106 वसा-७५ सेमी2 कुप्पी और संस्कृति के प्रति MSCs व्युत्पंन में उंहें EV-घट एमएससी-संस्कृति मध्यम में एक मशीन में ३७ ° c और 5% CO2 ।
- जब कोशिकाएं ७०% तक पहुंचती है संगम, जोड़ 143B ऑस्टियो-या नियंत्रण मानव fibroblasts (hf)-ईवीएस, 10 µ एल EV तैयारी/संस्कृति कुप्पी के cm2 . 24 घंटे के लिए मशीन और अतिरिक्त 6 घंटे के लिए ईवीएस की एक ही राशि जोड़ें । नोट: मानव fibroblasts Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% FBS और ईवीएस खंड 1 में वर्णित के रूप में अलग-थलग हैं में cultureed हैं ।
- एमएससी supernatant लीजिए, 4 डिग्री सेल्सियस (अधिकतम त्वरण और मंदी गति सेटिंग्स के साथ) में 5 मिनट के लिए ५०० x g पर 1x केंद्रापसारक, एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण और-८० डिग्री सेल्सियस पर मंजूरी दे दी supernatant भविष्य cytokine विश्लेषण सक्षम करने के लिए (धारा 5) ।
- vivo में प्रयोग (धारा 6) के लिए, GFP-positive MSCs25 को शिक्षित करने के रूप में ३.१ वर्गों में वर्णित ३.३, कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उन्हें पंजाब में १०० µ प्रति 106 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता पर reसस्पेंड l. इंजेक्शन तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें.
4. EV Internalization परख ।
MSCs द्वारा EV आगे की कल्पना करने के लिए, एक ग्रीन-फ्लोरोसेंट लिंकर डाई (GFLD) के साथ लेबल ईवीएस (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध) निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन:
- संक्षेप में, मंदक के २०० µ एल EV प्रस्तुत करने के लिए १८० µ एल जोड़ें । मंदक के ५० µ एल में GFLD डाई के 1 µ एल पतला, और पतला EV प्रस्तुत करने के लिए पतला डाई के 20 µ एल जोड़ें ।
- धीरे pipetting और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए गर्मी से मिश्रण ।
- पंजाब में ०.१% BSA के 5 मिलीलीटर जोड़ें, अल्ट्रा-केंद्रापसारक ट्यूबों के लिए स्थानांतरण और पंजाब के साथ ट्यूब भरें (अंतिम मात्रा ३८.५ मिलीलीटर/
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ७०,००० x g पर 1x केंद्रापसारक, ब्रेक के बिना (मंदी के लिए 1 घंटे की उंमीद) । ध्यान से supernatant निकालें और २०० µ एल के एक अंतिम मात्रा में लेबल EV-गोली reसस्पेंड (पंजाबियों के साथ मात्रा को समायोजित) ।
- MSC संस्कृति में लेबल ईवीएस जोड़ें या उन्हें-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें । रात भर की गर्मी के बाद, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry7द्वारा पुटिका internalization का आकलन करें ।
5. एमएससी Cytokine एक्सप्रेशन प्रोफाइल का मूल्यांकन ।
- interleukin-8 (IL-8) के मल्टीप्लेक्स ठहराव के लिए, interleukin-1β (il-1β), interleukin-6 (आईएल-6), interleukin-10 (आईएल-10), ट्यूमर परिगलन कारक (TNF), और interleukin-12p70 (il-12p70) प्रोटीन के स्तर में एमएससी वातानुकूलित मध्यम (३.४ कदम देखें), एक का उपयोग करें व्यावसायिक रूप से उपलब्ध cytometric मनका सरणी (CBA) मानव भड़काऊ साइटोकिंस के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन ।
- संक्षेप में, एंटीबॉडी-संयुग्मित कब्जा मोती मिश्रण और सभी परख ट्यूबों के लिए उंहें जोड़ने । cytokine मानक कमजोर पड़ने या ट्यूबों के लिए वातानुकूलित मध्यम नमूनों जोड़ें ।
- खोज एजेंट जोड़ें और आरटी पर 3 घंटे की मशीन ।
- आपूर्ति धोने के समाधान के साथ मोतियों को धो लें । एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर नमूनों को मापने और निर्माता के निर्देशों के अनुसार डेटा का विश्लेषण ।
6. ऑस्टियो के एक Orthotopic Xenograft माउस मॉडल की पीढ़ी ।
- प्रायोगिक प्रक्रियाएं शुरू करने से पहले छह सप्ताह की आयु, महिला, Athymic नग्न-Foxn1nu चूहों को कम से acclimatize करने के लिए अनुमति दें ।
- एक दिन शल्य प्रक्रिया से पहले और के रूप में पेरि को-ऑपरेटिव analgesia पीने के पानी के लिए पेरासिटामोल जोड़ें । पतला "बच्चों के लिए पेरासिटामोल समाधान" ( सामग्री की तालिकादेखें) 2 मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता पाने के लिए पानी के साथ. एक औसत पानी के सेवन के आधार पर १५० मिलीलीटर/kg/दिन, और 20 जी के एक औसत शरीर के वजन, इस खुराक की एक खुराक तक पहुँचने के लिए पर्याप्त है 6 mg/माउस/दिन (३०० मिलीग्राम/किलोग्राम/दिन).
- ऑपरेशन के बाद 24 घंटे तक एनाल्जेसिक उपचार जारी है, या अब अगर जानवरों के दर्द के लक्षण दिखाते हैं ।
- शल्य प्रक्रिया के दिन पर, इकट्ठा luciferase-सकारात्मक (Fluc) 143B कोशिकाओं (पहले lentiviral transduction द्वारा उत्पंन) 10 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा और 2 x 105 कोशिकाओं की एकाग्रता में कोशिकाओं को फिर से स्थगित/µ एल पंजाबियों में । 6 घंटे तक बर्फ पर सेल सस्पेंशन रखें ।
- आटोक्लेव सर्जिकल उपकरण । तैयार करने और काम क्षेत्र को साफ और बाँझ चादरों पर निष्फल कैंची और चिमटी जगह है । शल्य प्रक्रिया से पहले बीस मिनट (चरण ६.८), buprenorphine के साथ चमड़े के नीचे जानवरों सुई (०.०५ मिलीग्राम/किग्रा, ०.९% खारा में पतला) के रूप में ०.५ मिलीलीटर इंसुलिन सीरिंज (29 गेज सुई) का उपयोग एनाल्जेसिक ।
- बस प्रत्येक जानवर anesthetizing से पहले, एक 10 µ l सिरिंज के साथ भरें 1 µ एल केंद्रित (Fluc) 143B सेल निलंबन (६.४ कदम देखें).
- isoflurane सांस लेना संज्ञाहरण के साथ पशु Anesthetize (ऑक्सीजन में 2-3%) । पैर की अंगुली से संज्ञाहरण के स्तर की जांच पशु चुटकी । जब जानवर चुटकी लेने के लिए प्रतिक्रिया नहीं करता है, यानी, यह गहरी anesthetized है, संज्ञाहरण के दौरान सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर मरहम लागू होते हैं ।
- एक संज्ञाहरण मुखौटा में सिर के साथ अपनी पीठ पर जानवर की स्थिति और ऑपरेटर की ओर पैरों के साथ । फ्लेक्स बाएं घुटने । ७०% इथेनॉल के साथ त्वचा पोंछ और lidocaine लागू (2%) एक कपास टिप के साथ 3 बार स्थानीय एनाल्जेसिक के रूप में ।
- टिबिया को बेनकाब करने के लिए सिर्फ घुटने के नीचे त्वचा पर एक छोटा सा चीरा (लगभग 5 मिमी) बनाने के लिए एक बाँझ शल्य चाकू का प्रयोग करें. टिबिया में एक pinhole ड्रिल, लगभग एक ०.८ mm माइक्रो ट्विस्ट ड्रिल का उपयोग कर घुटने से नीचे 2 मिमी । दोनों टिबिया cortices के माध्यम से ड्रिल नहीं सतर्क रहें ।
- 1 µ एल सेल निलंबन (लगभग 2 x 105 कोशिकाओं) धीरे (लगभग 5 सेकंड में) एक 26-गेज सुई का उपयोग कर छेद में सुई । निलंबन के backflow को रोकने के लिए ऊतक गोंद की एक छोटी बूंद के साथ छेद बंद करो ।
- monofilament टांके और ऊतक गोंद की एक बूंद के साथ त्वचा को बंद करें । एक अच्छी तरह से गर्म वातावरण में पशु ठीक होने दें (एक गर्मी लैंप का उपयोग करें) । जब तक वे कठोर recumbency बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना पुनः प्राप्त है पशुओं को उपेक्षित मत छोड़ो । के बाद ही पशुओं को पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद कर रहे हैं, उंहें अपने पिंजरों को वापस ।
- दो दिन के बाद ट्यूमर टीका, सुई EV शिक्षित या भोली GFP-पॉजिटिव MSCs (106 कोशिकाओं में १०० µ l पंजाबियों, देखें चरण ३.५) नसों में एक ०.५ मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज के साथ चूहों की पूंछ नस.
- bioluminescence इमेजिंग द्वारा26 सप्ताह में दो बार ट्यूमर वृद्धि का पालन करें । इस अंत करने के लिए, एक इंसुलिन सिरिंज के साथ चूहों आईएफसआई १५० µ एल डी-luciferin (30 मिलीग्राम/एमएल) के साथ सुई । इंजेक्शन के बाद दस मिनट, bioluminescence इमेजिंग प्रणाली में जानवरों की स्थिति और ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न फोटॉन-फ्लक्स को मापने.
- इसके अलावा, एक कैलिपर के साथ प्राथमिक हड्डी के व्यास-ट्यूमर को मापने । ट्यूमर की मात्रा (मिमी3में) चौड़ाई x लंबाई2 x ०.५ द्वारा अनुमानित है ।
- नोट: मानव अंतिमबिंदु ट्यूमर व्यास के रूप में परिभाषित कर रहे हैं > 15 मिमी या वजन घटाने > 15%.
7. फेफड़ों पिंड संख्या का मूल्यांकन
- जब पशुओं में से एक के लिए कदम ६.१४ (लगभग 3-4 सप्ताह में) में परिभाषित मानव समापन बिंदु तक पहुंचता है, प्रयोग समाप्त और इकट्ठा और सभी प्रासंगिक ऊतकों का विश्लेषण ।
- euthanization से पहले दस मिनट, एक ०.५ मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज के साथ १५० µ एल डी-luciferin (30 मिलीग्राम/एमएल) इंजेक्षन ।
- isoflurane सांस लेना संज्ञाहरण के साथ जानवरों Anesthetize (६.७ कदम देखें) । पैर की अंगुली के लिए माउस की प्रतिक्रियाओं के अभाव से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें-चुटकी । चूहों को ग्रीवा विस्थापन27Euthanize ।
- निष्फल कैंची और चिमटी का उपयोग फेफड़ों, जिगर, तिल्ली और गुर्दे ले लीजिए । खून के निशान निकालने के लिए पंजाब में अंगों को धोएं और एक पेट्री डिश पर रखें ।
- bioluminescence इमेजिंग सिस्टम में अंगों के साथ पेट्री डिश लगाएं । अंगों के दोनों किनारों पर bioluminescence संकेत को मापने । मापने के तुरंत बाद, 4% formalin में अंगों डुबकी उंहें (RT पर 24-72 घंटे,) भविष्य ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए निर्धारण ।
- मैनुअल थ्रेसहोल्ड द्वारा उचित इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ प्राप्त चित्रों की प्रक्रिया । प्रत्येक चित्र पर फेफड़ों पिंड की संख्या की गणना । फेफड़ों के दोनों किनारों पर फेफड़ों पिंड की कुल संख्या की गणना ।
8. ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण
- फेफड़ों के ऊतकों के ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए:
- formalin-फिक्स्ड अंगों को आयल में एंबेड करें और 6 µm ऊतक स्लाइड तैयार कर लें ।
- Deparaffinate फेफड़ों के ऊतकों स्लाइड और उंहें ०.०१ एम साइट्रेट बफर (पीएच 6) में 15 मिनट के लिए उबलते द्वारा प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन ।
- स्लाइड्स को क्षैतिज रूप से एंटी-ह्यूमन vimentin एंटीबॉडी (२०० µ g/ml) के साथ कमरे के तापमान पर एंटीबॉडी-मंदक (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध) और बाद में द्वितीयक, एचआरपी-लेबल एंटीबॉडी (०.५ मिलीग्राम/एमएल, कमजोर पड़ने 1:500) के साथ । 3 ' के साथ ऊतकों दाग-diaminobenzidine (ढाब) और hematoxylin काउंटर धुंधला ।
- इसी कैमरे और छवि सॉफ्टवेयर के लिए मिलकर एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सना हुआ ऊतक स्लाइड का निरीक्षण करें ।
- माउस tibias में GFP-positive MSCs की उपस्थिति का आकलन करने के लिए:
- Decalcify में tibias को ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) ०.२४ मीटर, पीएच ७.२-७.४ । ताजा EDTA बफर हर दूसरे दिन जब तक हड्डियों लचीला हो (लगभग 1 सप्ताह) ।
- निर्जलीकरण tibias और उंहें तेल के साथ घुसपैठ । आयल ब्लॉक्स में tibias (ऑस्टियो टिशू सहित) एंबेड करें ।
- 6 µm आयल सेक्शन तैयार करने के लिए एक microtome का प्रयोग करें । कांच स्लाइड पर आयल वर्गों प्लेस । सुखाने के बाद, कमरे के तापमान पर रात भर स्लाइड की दुकान ।
- गर्मी मध्यस्थता प्रतिजन प्रदर्शन साइट्रेट बफर का उपयोग कर पुनर्प्राप्ति (8.1.2 देखें) और विरोधी GFP एंटीबॉडी (पूरे आनटिसम) के साथ ऊतकों दाग एंटीबॉडी-मंदक में एक 1:900 कमजोर पड़ने में । 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के ऊतकों को Counterstain ।
- एक प्रतिदीप्ति इसी इमेजिंग सॉफ्टवेयर को युग्मित माइक्रोस्कोप के साथ ऊतक स्लाइड का निरीक्षण करें ।
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Representative Results
इस अध्ययन में हमने ऑस्टियो-स्रावित ईवीएस की क्षमता का पता लगाया जो एक समर्थक tumorigenic और प्रो-मेटास्टेटिक phenotype के प्रति MSCs को शिक्षित करने के लिए है । हम बताते है कि ऑस्टियो कोशिकाओं exosome-ईवीएस कि MSCs द्वारा आंतरिक है की तरह जारी है । हम कैंसर ईवीएस द्वारा प्रेरित एमएससी cytokine अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के परिवर्तन मापा, और ट्यूमर विकास और मेटास्टेसिस गठन पर EV-शिक्षित MSCs के प्रभाव का मूल्यांकन किया । अध्ययन डिजाइन के सामांय प्रतिनिधित्व चित्रा 1में सचित्र है ।
ईवीएस 143B ऑस्टियो कोशिकाओं या नियंत्रण मानव fibroblasts द्वारा जारी अंतर केंद्रापसारक द्वारा शुद्ध थे । EV शुद्धता की पुष्टि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा की गई थी, जिससे पता चला कि तैयारियों में मुख्य रूप से ४०-१०० एनएम (चित्रा 2ए) के बीच लेकर व्यास के साथ बुलबुले समाहित हैं । का आकलन करने के लिए कि क्या कैंसर ईवीएस MSCs के साथ बातचीत, हम एक हरे-फ्लोरोसेंट lipophilic लिंकर डाई (GFLD) के साथ बुलबुले लेबल और उंहें लक्ष्य कोशिकाओं के साथ रातोंरात गर्मी । प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी करके हम MSCs (चित्रा 2) द्वारा कुशल EV के ऊपर ले जाया । इसके अलावा, प्रवाह cytometry विश्लेषण से पता चला है कि ऑस्टियो और नियंत्रण ईवीएस तुलनीय दक्षता (चित्रा 2सी) के साथ आंतरिक रहे हैं । जांच करने के लिए कि क्या ऑस्टियो ईवीएस MSCs के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुण बदल, हम एक मल्टीप्लेक्स मनका आधारित cytokine immunoassay, जो कि ट्यूमर ईवीएस पता चलता है एक 2-il-8 और il-6 मानव fibroblast के साथ तुलना में उत्पादन में वृद्धि गुना का उपयोग नियंत्रण ईवीएस (चित्रा 2डी, ई) ।
जांच करने के लिए कि क्या ऑस्टियो ईवीएस MSCs को शिक्षित करने के लिए एक समर्थक tumorigenic और समर्थक मेटास्टेटिक phenotype अपनाने, हम bioluminescent के एक orthotopic, xenograft ऑस्टियो माउस मॉडल कार्यरत हैं । सभी पशु प्रयोग एक संचालक द्वारा किया गया । मेटास्टेटिक 143B-Fluc कोशिकाओं athymic नग्न चूहों के टिबिया में प्रत्यारोपण किया गया था, और, दो दिनों के बाद, ऑस्टियो-xenografted चूहों GFP के एक एकल प्रशासन के अधीन थे-सकारात्मक EV-शिक्षित MSCs । चूहों से प्राप्त भोली (गैर शिक्षित) MSCs या सं MSCs नियंत्रण समूहों के रूप में उपयोग किया गया । वर्णित अंतिमबिंदु से पहले कोई पशु मर गया । हम कैलिपर माप और bioluminescence इमेजिंग (BLI) है कि चूहों EV शिक्षित MSCs के साथ इलाज के नियंत्रण समूहों (चित्रा 3ए) के साथ तुलना में ट्यूमर के विकास में तेजी लाने के द्वारा प्रदर्शन किया । प्रत्येक उपचार बांह के ट्यूमर के आकार के प्रतिनिधि छवियों चित्रा 3सीमें दिखाया गया है । हमारे डेटा से संकेत मिलता है कि शिक्षित MSCs के एक एकल i.v. प्रशासन ट्यूमर प्रगति को प्रभावित करता है के रूप में जल्दी के रूप में 10 दिन के बाद टीका (चित्रा 3बी) । इसके अलावा, शिक्षित/भोली GFP-व्यक्त MSCs (चित्रा 4) के प्रणालीगत इंजेक्शन के बाद चार दिन, हम दोनों अस्थि मज्जा (चित्रा 4बी) में और ट्यूमर ऊतक में GFP-व्यक्त कोशिकाओं कल्पना सकता है (चित्रा 4 ग), ट्यूमर साइट के लिए एमएससी होमिंग का प्रदर्शन ।
पूर्व वीवो फेफड़ों के BLI विश्लेषण, जिगर, गुर्दे और तिल्ली (दिखाया नहीं डेटा) फेफड़ों में विशेष रूप से सभी उपचार हथियारों के चूहों में फेफड़ों में गांठ गठन दिखाया (चित्रा 4डी एफ). स्पष्ट रूप से, चूहों EV शिक्षित MSCs प्राप्त चूहों के साथ तुलना में फेफड़ों मेटास्टेसिस की संख्या अधिक थी गैर शिक्षित MSCs या कोई MSCs (चित्रा 4जी) प्राप्त करने, सुझाव है कि ट्यूमर microenvironment शिक्षित MSCs में वृद्धि मेटास्टेटिक के भीतर vivo7में ऑस्टियो कोशिकाओं की क्षमता ।
चित्र 1 . अध्ययन डिजाइन के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । मानव प्राथमिक MSCs कल्चरल मेटास्टेटिक ऑस्टियो (143B) कोशिकाओं से पृथक ईवीएस के साथ शिक्षित हैं. कैंसर EV शुद्धता इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया है, और MSCs द्वारा internalization प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized है और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया है । MSC cytokine अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में परिवर्तन cytometric मनका सरणी (CBA) द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं । ट्यूमर विकास और मेटास्टेसिस गठन पर ev शिक्षित एमएससी की भूमिका को परिभाषित करने के लिए, ऑस्टियो असर चूहों EV शिक्षित (या भोली) एमएससी के साथ इंजेक्शन हैं । ट्यूमर वृद्धि bioluminescence इमेजिंग (BLI) और कैलिपर माप द्वारा पीछा किया जाता है, जबकि मेटास्टेसिस गठन प्रयोगात्मक अंत बिंदु पर मूल्यांकन किया जाता है द्वारा ex vivo BLI और ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 . ईवीएस का शुद्धिकरण और MSCs के साथ उनकी बातचीत. (क) 143B कोशिकाओं (स्केल बार: १०० एनएम) से पृथक ईवीएस का संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी micrograph. (ख) GFLD के तीनो-त्यसपछि 143B ईवीएस द्वारा MSCs द्वारा मूल्यांकन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (स्केल बार: 10 µm) । (ग) Internalization के GFLD-त्यसपछि 143B ईवीएस (नारंगी) या नियंत्रण (मानव fibroblast, hf) ईवीएस (हरा) द्वारा MSCs के रूप में प्रवाहित cytometry द्वारा विश्लेषित. (घ) MSCs के supernatants में भड़काऊ साइटोकिंस के मल्टीप्लेक्स का पता लगाने के 143B (143B ev-msc) या hf-ईवीएस (hf ev-msc) द्वारा cytometric मनका सरणी से अवगत कराया । 143B-एमएससी एक्सप्रेस आईएल-6 और आईएल-8 के उच्च स्तर पर नियंत्रण (अनुपचारित और hF EV-इलाज) MSCs की तुलना में । डॉटेड रेखाएं cytokine उत्पादन में बदलाव का संकेत देती हैं । (ङ) il-8 और il-6 के वातानुकूलित मीडिया में प्रोटीन एकाग्रता के रूप में EV-इलाज MSCs cytometric मनका सरणी द्वारा विश्लेषित, अनुपचारित नियंत्रण के सापेक्ष गुना प्रेरण के रूप में व्यक्त की है । डेटा मतलब ± एसडी, एन = 2 के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 . Bioluminescent, orthotopic xenograft माउस मॉडल ऑफ ऑस्टियो. (क) ट्यूमर की मात्रा का आकलन कैलिपर माप का उपयोग कर, और (ख) ट्यूमर विकास bioluminescence इमेजिंग द्वारा मापा (BLI). ट्यूमर का आकार फोटॉन फ्लक्स के रूप में व्यक्त किया जाता है (फोटॉनों/ * * p < ०.०१, गैर-शिक्षित एमएससी (n = 6) बनाम शिक्षित एमएससी (n = 6), ख़राब टी-टेस्ट । डाटा अर्थ ± SEM के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । (ग) प्रतिनिधि BLI स्थापित ऑस्टियो ट्यूमर (शीर्ष पैनल) के साथ चूहों के चित्र । रंग पैमाने पर बार पर्वतमाला से ७.७ x 107 (बैंगनी) से २.६ x 108 (लाल) फोटॉनों/ नीचे पैनल में, ट्यूमर क्षेत्र BLI ओवरले के बिना visualized है । तीर ट्यूमर थोक संकेत मिलता है । स्केल बार्स: ०.६ cm. इस आंकड़े का बड़ा वर्शन देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
चित्र 4 . MSCs और पूर्व vivo फेफड़ों के ऊतकों की इमेजिंग । (क) प्रतिदीप्ति GFP की माइक्रोस्कोपिक इमेज-पॉजिटिव वसा-व्युत्पन्न MSCs (हरा). (ख) GFP के इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग-अस्थि मज्जा में सकारात्मक MSCs और (ग) एमएससी के ट्यूमर ऊतक में प्राप्त चूहों (हरा: MSCs, नीला: DAPI सना हुआ नाभिक; स्केल बार 10 µm) । (डी एफ) पूर्व vivo bioluminescence इमेजिंग (BLI) प्राप्त चूहों में मेटास्टेटिक घावों की अधिक संख्या दिखा EV-शिक्षित MSCs (F) के रूप में प्राप्त चूहों की तुलना में भोली एमएससी (ई) या कोई एमएससी (D). रंग पैमाने पर बार पर्वतमाला 1 x 106 (बैंगनी) से १.५ x 106 (लाल) फोटॉनों/ (G) BLI द्वारा विज़ुअलाइज़ की गई फेफड़े मेटास्टेसिस संख्या की ठहराव (पंक्तियाँ माध्य का प्रतिनिधित्व करती हैं; * p < ०.०५, एक पुच्छ t-परीक्षण) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
ट्यूमर स्रावित extracellular बुलबुले (ईवीएस) एक ट्यूमर सहायक वातावरण उत्पन्न करने के लिए स्थानीय और सुदूर mesenchymal कोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान को बदल सकते हैं । यहां हम ऑस्टियो के एक नैदानिक माउस मॉडल की पीढ़ी का वर्णन है कि vivo मेंट्यूमर कोशिकाओं और mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) के बीच EV मध्यस्थता बातचीत के विच्छेदन की अनुमति देता है । हम मानव ट्यूमर के प्रणालीगत इंजेक्शन EV-चूहों असर ऑस्टियो xenografts में शिक्षित MSCs दिखाने दृढ़ता से कैंसर विकास और मेटास्टेसिस गठन को बढ़ावा देने के IL-6/STAT3 संकेत मार्ग7।
हाल के अध्ययनों से पता चला है कि कैंसर ईवीएस पूर्व के गठन में सहायता कर सकते है मेटास्टेटिक आला स्थानीय या अस्थि मज्जा के व्यवहार को बदलकर-व्युत्पंन stromal कोशिकाओं16,28,29। ये अध्ययन किया गया है ज्यादातर सीधे द्वारा आयोजित किए गए कैंसर-प्राप्तकर्ता माउस में बुलबुले व्युत्पंन, जो कोशिका ट्यूमर को बढ़ावा देने के प्रभाव के लिए जिंमेदार प्रकार की पहचान पेचीदा है । हमारे प्रोटोकॉल में, कैंसर ईवीएस के साथ MSCs की शिक्षा के लिए एमएससी इंजेक्शन से पहले इन विट्रो में होता है । इस दृष्टिकोण कैंसर की प्रगति के लिए ट्यूमर-एमएससी crosstalk के विशिष्ट योगदान को संबोधित करने की अनुमति देता है, और स्थानीय या प्रणालीगत वातावरण के अंय घटकों पर कैंसर ईवीएस के अप्रत्यक्ष प्रभाव को कम करने ।
कि क्या शिक्षित MSCs ट्यूमर साइट के लिए घर का मूल्यांकन करने के लिए, हम ट्यूमर असर चूहों की पूंछ नस में GFP-सकारात्मक MSCs इंजेक्शन प्रणालीबद्ध । पूंछ नस इंजेक्शन एक महत्वपूर्ण है, लेकिन कई प्रायोगिक प्रोटोकॉल में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण कदम । इंजेक्शन प्रक्रिया अनुभवी जांचकर्ताओं द्वारा किया जाना चाहिए के बीच ंयूनतम भिंनता सुनिश्चित करने के लिए । सही नसों प्रशासन नेत्रहीन नस के माध्यम से द्रव की आवाजाही देख द्वारा की पुष्टि की जा सकती है । अगर एक सफेद क्षेत्र पूंछ या प्रतिरोध पर प्रकट होता है इंजेक्शन के दौरान सामना करना पड़ा है, संवहनी प्रवेश प्राप्त नहीं किया गया था । इस मामले में प्रक्रिया पहले इंजेक्शन साइट के ऊपर सुई डालने के द्वारा दोहराया जाना चाहिए । क्योंकि MSCs ट्यूमर पर आसानी से घर में, (GFP पॉजिटिव) MSCs के सफल प्रशासन इंजेक्शन के बाद ट्यूमर ऊतक और अस्थि मज्जा के धुंधला इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा पुष्टि की जा सकती चार दिन (चित्रा 4बी, सी) ।
हम बताते है कि कैंसर स्रावित ईवीएस भड़काऊ साइटोकिंस के उत्पादन में फेरबदल करके MSCs में एक ट्यूमर सहायक phenotype प्रेरित । यह खोज विशेष रूप से प्रासंगिक है प्रतिरक्षा मॉडुलन और ट्यूमर प्रतिरक्षा चोरी के बाद से घातक प्रगति में महत्वपूर्ण तंत्र हैं । हमारे डेटा का सुझाव है कि कैंसर ईवीएस सीधे हो सकता है, के रूप में स्वतंत्र अध्ययन द्वारा सूचित21,30,31,३२,३३, या परोक्ष रूप से (MSCs द्वारा) प्रभाव जंमजात या अनुकूली प्रतिरक्षा घटक. हालांकि, एक xenograft (प्रतिरक्षा) मॉडल का उपयोग ईवीएस के इस पहलू की जांच करने की संभावना को सीमित करता है । इस प्रकार, असुरक्षित या मानवतावादी माउस मॉडलों में इसी तरह के दृष्टिकोण को EV-मध्यस्थता ट्यूमर की भूमिका को परिभाषित किया जाना चाहिए-एमएससी-कैंसर में प्रतिरक्षा कोशिका बातचीत ।
अंत में, क्योंकि MSCs अस्थि मज्जा या अंय ऊतक स्रोतों से ट्यूमर के लिए भर्ती किया जा सकता है, हमारे विधि हड्डी के कैंसर के अध्ययन के लिए प्रतिबंधित नहीं है, लेकिन ट्यूमर EV की भूमिका की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है एकाधिक कैंसर प्रकार में शिक्षित MSCs2, 3 , 4 , 5 , 6, मेलेनोमा और लिंफोमा मॉडल में हाल के अध्ययनों के रूप में३४पुष्टि करें ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
सेवाराम Baglio ला Ricerca सुल कांसरो (AIRC) सह यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषित के प्रति Associazione Italiana द्वारा एक फैलोशिप द्वारा समर्थित था, । इसके अलावा इस परियोजना को मैरीन Sklodowska-क्यूरी ग्रांट एग्रीमेंट नं ६६०२०० (सेवाराम Baglio को) के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान एवं नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor |
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM |
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera |
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope |
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |
| Incubator | Nuaire | 4750E | |
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer |
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill |
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill |
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |
| Autoclave | Astell | n.a. | |
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |
| Culture media | |||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |
| heparin | LEO | 012866-08 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |
| Cells | |||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced |
| Disposables | |||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes |
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |
| Petri dish | Sigma - Aldrich | P7612 | |
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |
| Reagents / kits | |||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD |
| BSA | Sigma | A8412 | |
| CBA - human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife |
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 |
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids |
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 |
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |
| Mice experiments | |||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |
| Sutures | Ethicon | V926H | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |
References
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