Summary
Bu yöntem RNA sentezi ölçmek için kullanılabilir. 5-Bromouridine hücrelere eklendi ve sentezlenmiş RNA dahil. RNA sentezi 5 Bromouridine hedeflenmiş immunoprecipitation etiketli RNA ve analiz ters transkripsiyon ve nicel Polimeraz zincir reaksiyonu ardından hemen sonra etiketleme, RNA ayıklama ölçülür.
Abstract
Kararlı duruma RNA düzeyleri arasında iki koşulları karşılaştırıldığında, değişiklikleri değişiklikler üretim veya RNA bozulma nedeniyle olup olmadığını ayırt etmek mümkün değildir. Bu iletişim kuralı RNA üretim, 5-Bromouridine immunoprecipitation, soruşturma bir kısa süre içinde (örneğin, 1 h) sentezlenmiş RNA'ın sağlayan ardından RNA'ın etiketleme kullanarak ölçülmesi için bir yöntemi açıklar. 5-Bromouridine-etiketleme ve immunoprecipitation avantaj α-amanitin ve actinomycin D, gibi toksik transkripsiyon inhibitörleri kullanımı vardır yok veya çok düşük etkileri kısa süreli kullanım sırasında hücre canlılığı. Ancak, 5-Bromouridine-immunoprecipitation sadece kısa etiketleme süre içinde üretilen, yavaş yavaş üretilen gibi hızla bozulmuş RNA yakalar çünkü RNA bu yöntemle ölçmek zor olabilir. 5-Bromouridine-immunoprecipitation tarafından yakalanan 5 Bromouridine etiketli RNA ters transkripsiyon, nicel Polimeraz zincir reaksiyonu ve sonraki nesil sıralama tarafından çözümlenebilir. RNA her türlü incelenmiş ve için yöntem bu örnekte sunulan mRNA ölçme için sınırlı değildir.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) RNA üretim olmayan hücrelerde çalışma izin verir veya çok sınırlı etkisi Fizyoloji dönemi1,2etiketleme kısa sırasında hücre. Bu yöntem etiketli RNA anti-BrU antikorlar (şekil 1) kullanarak IP tarafından BrU yeni sentezlenmiş RNA içine takip sentetik üridin türev birleşme dayanır.
Yıllardır bu protein sentezi transcriptionally düzenlenmiş ve transkripsiyon faktörleri varlığını daha 50 yıl önce olan için bilinmektedir3. Günümüzde, birçok hastalıkları transkripsiyon ve RNA istikrar bozukluk tarafından neden olduğu bilinmektedir (ek şekil S1, başvuru4) ve yeteneği RNA üretim değişiklikleri ölçmek için anlayış hastalığında büyük önem taşıyor geliştirme.
Öte yandan, RNA üretim düzenlenmesi için çözümler çok az ya da çok fazla protein ifade veya Parkinson hastalığı (PD) gibi protein birikimi kaynaklanan hastalıkların tedavisi için yeni olanaklar sağlar. PD olarak çözünmez toplamları biriken baskın α-synuclein proteindir ve α-synuclein gen gen çarpma ailesel PD5nedenleri olarak α-synuclein düzeyini doğrudan hastalığa, bağlı. Ayrıca, α-synuclein bir konsantrasyon bağımlı şekilde toplar. α-synuclein mRNA düzeylerinin downregülasyon bu nedenle başarılı nöronal hücre kaybı PD kemirgen modelleri6,7azaltmak için RNA müdahale kullanarak elde edilmiştir ilginç bir tedavi stratejisi.
Bu hastalık ya da tedavi müdahaleler tarafından neden RNA üretim değişiklikleri ölçmek önemlidir. RNA, ölçüm kararlı duruma düzeyleri gibi nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR), tarafından takip ters transkripsiyon transkripsiyon düzenleme nedeni veya değişiklikleri ayırt yeteneğine sahip değildir için en modern yöntemleri değişmiş RNA istikrar. RNA çürüme oranları incelenmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntem α-amanitin veya actinomycin D çürüyen RNA'ların ölçümleri tarafından takip gibi bileşikler kullanarak transkripsiyon makine engelliyor. Ancak, transkripsiyon hücrelerde apoptoz8,9indüksiyon gibi genel bir tıkanması ile ilgili bazı sorunlar vardır. Sitotoksik etkileri, transkripsiyon inhibitörleri da hücresel alımını yavaş: α-amanitin ve actinomycin (referans10gözden) D özgüllüğü eksikliği gibi çeşitli teknik sorunlar mevcut.
Transkripsiyon genel tıkanması önlemek için nükleotid analogları, 5-ethynyl üridin (5-AB), 4-thiouridine (4-TU) ve kardeş gibi kullanılmaktadır. Bunlar kolayca memeli hücreleri tarafından alınır ve yeni sentezlenmiş RNA, darbe-etiketleme RNA'ın belirli bir zaman çerçevesinde etkinleştirme dahil. BrU seçim11,12tercih edilen analog yapmak 5-AB ve 4-TU, daha az toksik değildir.
BrU-IP RNA sentezi ve istikrar hem oranı araştırmak ve böylece toplam RNA değişimler nedenleri arasında ayırt etmek için kullanılabilir. Bu makalede RNA sentezi ölçüm üzerinde durulacak ve2 soruşturma RNA istikrar hakkında ayrıntılı bilgi için başvuru başvurur. RNA sentezi araştırmak için hücreleri kısa bir süre ile BrU örneğin 1s BrU-IP1 tarafından (şekil 1 c) ardından için etiketli. Bu ölçümler etiketleme kısa sürede sentezlenmiş RNA'ın sağlar ve gözlenen değişiklikleri düzenlemelerin daha iyi bir tahmin RNA sentezi içinde RT-qPCR tarafından toplam RNA değişiklikleri ölçerek verecektir. Bu, ancak, etiketleme zaman, örneğin, sadece 1 h, olsa bile bozulma hala gözlenen RNA düzeyleri üzerinde bir etkisi olabilir belirtilmelidir.
RNA BrU-IP deneyler üzerinden RT-qPCR1 veya sonraki nesil sıralama2,13tarafından aşağı akım analizi için uygundur. Kuzey kurutma veya ribonükleaz koruma yöntemi, gibi diğer standart RNA algılama yöntemleri de bazı RNA'lar için geçerli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Aksi belirtilmediği sürece, oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın ve arabellekleri buz üzerinde veya buzdolabında (arabellek elüsyon SDS içeren hariç) tutun. Protokol 5 bölüme ayrılır: RNA hazırlık örnekleri; IP için boncuk hazırlanması; BrU-etiketli RNA boncuk için bağlama; elüsyon ve ilişkili BrU etiketli RNA 3 adımda fenol-fenol/kloroform-kloroform çıkarma tarafından arıtma; RNA analizi (örnekte RT-qPCR kullanarak)
1. hazırlanması RNA örnekleri
- Kont HEK293T hücreleri otomatik bir hücre kullanarak counter ve toplam elde etmek için 10 cm petri kabına 10 mL büyüme medya (Dulbecco'nın modifiye kartal orta takıma % 10 fetal buzağı serum ve 50 µg/mL penisilin/streptomisin) 3.500.000 hücrelerde tohum > 40 µg RNA ayıklama 48 saat daha sonra. 37 ° C ve % 5 CO2hücreleri korumak.
- tohum sonra 48 h 8 mL büyüme medya Aspire edin ve kurutma önlemek için 2 mL geride. 2 mM BrU eklemek ve herhangi bir tedavi 8 ml büyüme medya emişli ve kalan 2 mL 8 mL BrU içeren büyüme medya yeniden uygulama önce hücrelerden kaldırma. Bu gen ekspresyonu değişiklikler neden beri BrU başvurusu hücreleri, üzerine taze medya kullanmaktan kaçının.
- 1s BrU ve tedavisi için hücreleri kuluçkaya. 5 mL Hank'in arabellek hücrelerde yıkama ve 2 mL % 0.05 tripsin kullanarak hücreleri trypsinize. Reaksiyon durdurmak için bir 15 mL tüp hücreleri aktarıp spin için 2 dk 1000 x g de hücreleri aşağı 8 mL büyüme ortamı ekleyin.
- Süpernatant kaldırmak ve toplam RNA bir RNA yalıtım kullanarak hücre Pelet--dan hulâsa ( Tablo malzemelerigörmek) kiti veya herhangi bir diğer tercih edilen yöntem ve RNase free H2' O. mağaza RNA-80 ° C'de devam etmek için hazır kadar elute.
2. IP için boncuk hazırlanması
- Gruplar halinde boncuklar artı bir pipetting sırasında kaybı için hesap ve karıştırma whirl için ilave araştırılması için örnekleri sayısı için hazırlayın. Anti-fare IgG manyetik boncuklar koşuşturma karıştırma tarafından iyice resuspend ve örnek bir RNase free 1,5 mL tüp başına 20 µL boncuk çıkarmak. Üstünde belgili tanımlık yan toplamak için bir yer manyetik stand ve izin yaklaşık 20 s boncuklar için 1,5 mL tüp.
- Süpernatant kaldırmak, manyetik stand tüpünden dışarı almak ve 400 µL 1 x BrU-IP arabellekte pipetting tarafından resuspend. Çok kısa bir süre için 2 tüp spin bir masa üstü santrifüj s manyetik tribünde yer ve süpernatant kaldırın. Bir kez yıkama adımı yineleyin.
- Blok heparin kullanarak boncuk belirsiz bağlama. 1 mL 1 boncuk resuspend x BrU-IP + 1 mg/mL heparin tampon ve 30 dk. yıkama için boncuk dönen bir kez, adım 2.2 olduğu gibi bırakın.
Not: Heparin RNA'lar ile bağlama için yarışacak olumsuz şarj edilmiş bir polimer var. aşağı akım uygulama değil sıralama tRNA ya da alakasız başka RNA'ların da kullanılabilir. - 1 ml 1 x BrU-IP arabellek boncuk resuspend ve de BrU tanır 1,25 µg/örnek anti-α-Bromodeoxyuridine antikor ekleyin. Döndürme sırasında boncuk 1 h için kuluçkaya, veya bir gece oda sıcaklığında.
- Boncuk üç kez olduğu gibi adım 2.2 yıkayın. Boncuk ile 1 mM BrU ve boncuk ve bu vesile ile bağlı antikor duyarlılığını azaltmak 30 dk belirsiz bağlama sırasında IP riskini dönen bırakın takıma 50 µL/Örnek 1 x BrU-IP tampon resuspend.
- Boncuk üç kez olduğu gibi adım 2.2 yıkama ve 50 µL/örnek 1xBrU-IP arabellekte resuspend.
3. BrU etiketli RNA boncuk için bağlama
- Ölçmek adım 1.3 RNA özler konsantrasyonlarda RNA ultraviyole görünür spectrophotometry kullanarak ve 40 µg RNA her örnekten RNase free H2O 200 µL toplam hacmiyle oranında seyreltin.
- RNA örnekleri için 2 dk 80 ° C'de RNA ve kısa bir süre içinde bir masa üstü santrifüj spin denatüre için ısı. BrU-IP + BSA/RNAse inhibitörü x 200 µL 2 ekleyin.
- 50 µL resuspended ve adım 2.6 boncuk her örnek için hazırlanan ve 1 h. yıkama dört kez olduğu gibi adım 2.2 boncuk dönen bırakın ekleyin.
4. elüsyon ve RNA 3 adımda fenol-fenol/kloroform-kloroform çıkarma tarafından arıtma
-
RNA elute ve fenol ayıklama gerçekleştirmek
- Boncuk RNA elute için 200 µL elüsyon arabellek resuspend ve hızlı bir şekilde bundan sonra 200 µL fenol, pH 6,6 ekleyin (Uyarı: toksik, bkz: adım 4.1.2 aşağıdaki nota) herhangi bir sigara-RNA molekülleri örneğinden kaldırmak için.
- Tempo mix örnek ve spin 25.000 x g masa üstü bir santrifüj içinde de 3 dak.
Not: Fenol toksik ve Cilt koruma giyen bir duman mahallede ele alınmalıdır. Hafif asidik pH sadece RNA ve DNA değil, ayıklanmış sağlar. RNA üst sulu faz ücretleri hidrofilik doğası gereği alanında bulunacaktır. Proteinlerin hidrofobik çekirdek fenol bağlamak ve alt organik fenol-faz için hareket.
-
Fenol kloroform ayıklama gerçekleştirmek
- Çok üst fazlı (200 µL deneyim işleme bağlı olarak yaklaşık 190 µL) olabildiğince Aspire edin ve bir tüp ile 200 µL fenol/kloroform, pH 6,6 için hareket (Uyarı: toksik, nota bakın). Aynı miktarda örnekler üzerindeki Aspire edin emin olun.
- Koşuşturma mix örnek ve spin için 25.000 x g de 3 dak.
Not: Kloroform toksik ve Cilt koruma giyen bir duman mahallede ele alınmalıdır. Kloroform RNA aşağı akım analizi ters transkripsiyon14 ve Polimeraz zincir reaksiyonları15engelleyerek etkileyebilir fenol kaldırmak için eklenir.
- (Şimdi yaklaşık 180 µL) önce sulu üst aşaması olarak aspirating tarafından kloroform ayıklama gerçekleştirmek ve 200 µL kloroform içeren bir tüp aktarın. Koşuşturma örnek mix ve 25.000 x g de 3 dk spin.
- (Şimdi yaklaşık 170 µL) önce sulu üst aşaması olarak Aspire edin ve 17 µL (1/10 cilt) 3 M CH3COONa, pH 6.0 içeren bir tüp transferi. Etkisiz hale getirmek ve RNA sulu çözüm çökelti RNA ile birlikte precipitates ve RNA Pelet daha görünür yapar 2 µL glikojen (20 mg/mL) ekleyin.
- Tuz iyonları ve RNA ile mix arasındaki tüp ters çevirme tarafından birkaç kez artırmak için 500 µL % 96 etanol ekleyin. -20 ° C veya 15dk adlı gecede tüp kuru buz üzerinde bırakın.
- Örneği 25.000 x g, pelet bozmadan 30 dk. atma süpernatant için 4 ° C'spin ve Pelet 185 µL % 75 etanol içinde herhangi bir kalıntı tuzu yıkamak. 25.000 x g, 5 min için 4 ° C de spin.
- Süpernatant atmak tamamen Pelet bozmadan ve Pelet açık bir kapak ile 5-10 dk kurumaya bırakın. 10 µL RNase free H2Pelet rahatsız edici önlemek için O tüp tarafında uygulanan resuspend.
5. RNA analizi
- CDNA cDNA ters transkripsiyon kullanarak hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) kiti veya herhangi bir diğer tercih edilen yöntem 2 µL RNA örnek ve 1 µg Maya toplam RNA RNA (cDNA sonraki nesil sıralama için kullanılırsa kullanılmaz) cDNA sentezi tepki için taşıyıcı olarak. 1 µg RNA Maya RNA olmadan karşılık gelen bir girdi cDNA hazırlanması için kullanın.
- Seyreltik cDNA 1:25 ve 10 µL qPCR ile karışımı 9 µL seyreltilmiş cDNA Master mix ve 1 µL fluorogenic sonda, belirtilen her iki Malzeme tablo.
Not: CDNA seyreltme cDNA hazırlık ve qPCR yöntemi kullanılan üzerinde bağlıdır. - Aşağıdaki qPCR (Örneğin, 7500 hızlı gerçek zamanlı PCR sistemi veya eşdeğeri) çalıştırın: 2 min 50 ° c, 20 s 95 ° c, 3 40 döngüleri 95 ° C ile 30 s s 60 ° C'de
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AsPC-1 hücrelerde BrU-etiketi zaman bizim ilk testler yapıldı. Hücreler için 0, 1, 2 ve 4.5 h, ardından toplam RNA ayıklama ve BrU-IP BrU ile tedavi edildi. GAS5 ve GAPDH 1 h etiketleme için arka plan (0 h) GAPDH ve GAS5, için sırasıyla karşılaştırmalı bir yaklaşık 9 - ve 44 - kat değişiklik ulaşmak için yeterli olduğunu gösterdi BrU-IP RNA ölçüldü.
BrU-IP ve yukarıda açıklanan analiz değişiklikleri fark araştırmak için kullanıldı kararlı duruma seviyelerinde α-synuclein mRNA üzerine Polo gibi kinaz 2 (PLK-2) inhibisyon victimsâ mRNA sentezi1' deki değişiklikler. Çünkü bu yeterli için arka plan (Şekil 2) göre etiketleme sağlar ve aynı zamanda etkisini göstermeye tesir süresi sağlar 1 h etiketleme vakit seçildi. 2 mM BrU tedavi 1 saat veya daha uzun 4 h tedavi (şekil 3A) HEK293T hücrelerdeki morfolojik değişiklikler neden değil.
Α-Synuclein hücreleri BrU huzurunda taze sentezlenmiş RNA etiketlemek için 1S DMSO veya belirli bir PLK-2 inhibitörü (PLK-2i) için tedavi edildi HEK293T transfected. Hücreleri bundan sonra hasat edildi ve toplam RNA ayıklandı. 1 h tedavi içinde üretilen BrU etiketli RNA RNA ("giriş" şekil 3B) toplam havuzundan BrU-IP ("BrU-IP" şekil 3B) kullanılarak toplanmıştır. RNA miktarı BrU-IP ile 40 elde edilen malzeme başlayan µg farklı hücre hatları arasında değişir ve genellikle yaklaşık 500 elde HEK293T hücreleri ng ama sadece 10-50 ng HeLa hücreleri. PLK-2 inhibisyon düşündüren α-synuclein mRNA hem giriş hem de BrU-IP (şekil 3B) artış artış RNA RNA sentezi bir artış nedeniyle oluşur kararlı duruma neden oldu. PLK-2i sadece genel bir artış RNA üretimde neden olmaz, 3 ek endojen genler (ACTB, HMBS ve NADH) olduğunu emin olmak için (şekil 4) ölçülür. Bu genlerin hiçbiri PLK-2i tedavi giriş (şekil 4A) ve BrU-IP (şekil 4B) yükseltilmiştir.
BrU-IP özgüllük doğrulamak için bir denetim BrU-tedavi hücrelerle dahil edildi. BrU-IP BrU-tedavi ve tedavi edilmezse hücrelerden tarafından yakalanan 18sRNA düzeyleri karşılaştırıldı (şekil 5). Bu açıkça gösteriyor ki BrU-IP çok özel ve sadece sigara etiketli RNA (şekil 5) çok küçük bir kısmını yakalar.
BrU-etiketli RNA yalnızca 1s içinde üretilen çünkü normalde uygun bazı genler güvenilir olması için çok düşük konsantrasyonlarda ifade beri uygun başvuru gen seçmek önemlidir. 18sRNA şekil 3B ve şekil 4 nedeniyle yüksek onun bereket sunulan veriler için bir referans gen olarak seçilmiştir. Birkaç başvuru genler ancak, test edildi ve bazı yüksek eşik döngüleri gösterdi (> 30) (şekil 6). Bu veri de BrU etiketli IP'ed RNA ve toplam RNA arasındaki fark giriş yaklaşık 5 olduğunu gösterir tomografi ve hücre düşük miktarlarda, ifade Bazı RNA'lar bu nedenle düzgün BrU-IP ardından algılanmayabilir.
Şekil 1: BrU-IP soruşturma RNA sentezi için açıklaması. (A)RNA transkripsiyonu arasındaki DNA RNA polimeraz tarafından. (B) ek medya olarak, BrU hücreleri tarafından alınan ve yeni transkripsiyonu RNA dahil. (C) RNA sentezi oranları ölçmek için: (1) yeni sentezlenmiş RNA BrU ile 1 h için etiketli, hemen sonra etiketleme hücrelerden ayıklanmış (2) RNA, RNA (3) BrU etiketli olan anti-BrU antikorlar, kullanarak immunoprecipitated (4) BrU etiketli (ve Giriş karşılık gelen) RNA RT-qPCR veya sıralama tarafından analiz edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: zaman etiketleme değerlendirmesi. BrU-etiketi zaman ilk bir değerlendirme örneği. Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) ortamda yetiştirilen AsPC-1 hücrelerin % 10 fetal sığır serum ve 50 U/mL ile desteklenmiş / 50 µg/mL penisilin/streptomisin için 0, 1, 2 2 mM ve daha önce RNA çıkarma ve analizi ile 4.5 h son bir konsantrasyon, BrU ile tedavi RT-qPCR. Veri 2-Ctsayılabilir ve teknik triplicates ± standart sapma, n ortalama sunulan = 1. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: giriş ve BrU-IP RNA DMSO ve PLK-2i gösteren temsilcisi sonuçları hücreleri tedavi. (A)1 h ve 4 h 2 mM BrU tedavi HEK293T hücrelerdeki görünür morfolojik değişiklikler değil ikna etmek. Ölçek çubuğu 100 µm. (B) uyarlama şekil başvuru1=. 3.500.000 HEK293T hücre 10 cm çanak tohumlari ve α-synuclein 24 saat sonra tohum ifade bir plazmid ile transfected. 24 saat mesaj transfection hücreleri için 1S BrU DMSO veya PLK-2i, ardından RNA ayıklama ve BrU-IP huzurunda inkübe. RNA analizi RT-qPCR tarafından yapıldı yönettiği insan SNCA (α-synuclein) ve 18sRNA karşı sonda kümesi'ni kullanma. BrU-IP ve giriş SNCA BrU-IP göre sayısal ve 18sRNA, sırasıyla, 2-ΔΔCT yöntemi kullanarak giriş. Sonuçları DMSO tedavi örnekleri için normalleştirilmiş. Veriler olarak ortalama ± standart sapma sunulur. İstatistiksel karşılaştırmalar gerçekleştirilen öğrenci unpaired t-Testi, kullanarak * p < 0,001, n = 3. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: ölçüm diğer genlerin PLK-2i tarafından değişmedi. PLK-2i ne toplam ne de sentezlenmiş ACTB RNA, HMBS ve NADH değiştirir. (A)ACTB, HMBS ve NADH RNA gelen giriş nüsha bir denemede ölçülen ve 2-ΔΔCT yöntemini kullanarak giriş 18sRNA göre sayılabilir. Değerleri tedavi DMSO örnekleri için normalleştirilmiş ve barlar temsil ortalaması triplicates ± standart sapma, n = 1. (B) ACTB, HMBS ve NADH da BrU-IP'ed RNA ölçülen ve 18sRNA BrU-IP göreli olarak sayılabilir. Değerleri DMSO için normalleştirilmiş ve Aolduğu gibi sunulan n = 1. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: BrU-IP özgüllüğü. BrU-IP BrU - ve sigara-BrU-tedavi hücrelerden tarafından yakalanan 18sRNA karşılaştırma için RNA BrU-IP adresinden giriş malzeme başlayarak farklılıkları hesaba RNA göre doğrulanır ve bundan sonra BrU-tedavi örnekleri için normalleştirilmiş. Sadece çok küçük bir kısmını (0,002) BrU etiketli 18sRNA immunoprecipitated, BrU-IP çok özel olduğunu gösteren oldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: BrU-IP giriş RNA karşılaştırıldığında RNA içinde farklı mRNA'ların düzeyde. Bazı RNA'lar BrU-IP RNA 1s BrU tedavi içinde üretilen RNA az miktarda nedeniyle çok düşük konsantrasyonlarda mevcut olacaktır çünkü birkaç potansiyel başvuru genler test edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA üretim, yeni etiketleme tarafından belirlenmesi için 1S BrU, ardından hemen RNA ayıklama ve immunoprecipitation BrU etiketli RNA'ın RNA üretilen için bu protokolü BrU-IP kullanımını açıklar. Bu yöntem daha önce başvuru16açıklandığı ve bu makale IP özgüllük ve RNA saflık, BrU yanı sıra bir fenol kloroform arıtma adıma düşük konsantrasyonları ile önceden tedavi boncuk artırmak için bazı ek adımlar içerir IP takip RNA saflık artırın. Ayrıca, biz de burada BrU-IP özgüllük BrU ve sigara-BrU yakalanan RNA karşılaştırarak gösteren veri mevcut tedavi hücreleri. Fenol kloroform arıtma ucuz olsa da BrU ile etiketli RNA düşük miktarda göz önüne alındığında, artan sinyaller aşağı akım analizi de RNA temizlik setleri yerine kullanılarak alınabilir. Deneyimlerimiz, RNA en eşit çıkarma örnekleri arasında fenol kloroform arıtma kullanarak elde edilir ise.
BrU-etiketi ve - IP, aksine toplam RNA düzeyleri, kararlı duruma RNA düzeylerinde değişiklikler nedenleri yanız analizi vardır. Yöntem yoktur veya sınırlı etkileri üzerinde hücre fizyolojisi, buna ek olarak transkripsiyon inhibitörleri kullanımı böyle α-amanitin ve actinomycin ö. Karşılaştırma kararlı duruma düzeyleri için yeni sentezlenmiş RNA'ın RNA çürüme oranları17hesaplamak için kullanılabilir ve RNA sentezi ve çürüme bir tahlil eşzamanlı belirlenmesi burada açıklanan BrU-IP yöntemi sağlar sürülmüştür.
Şekil 5' te, RNA gerçekten burada kullanılan hücre doğrultusunda RNA içine dahil BrU olduğunu gösteren hücreler, sadece IP'ed BrU üzerinden tedavi olduğunu gösterdi. Ancak, biz diğer hücre hatlarında RNA içine BrU birleşme BrU-IP gerçekleştirmeden önce bir başlangıç test iletken öneririz. Bu örneğin, nokta leke veya enzim bağlı immunosorbent assay üzerinden toplam RNA özleri BrU ölçmek için anti-BrU antikorları kullanarak yapılabilir.
Burada biz bir test BrU-IP verimlilik örnekler üzerindeki sundu değil ama bu da üretilen RNA vitro veya başka bir organizma, Drosophila melanogastergibi sivri BrU etiketli kullanarak araştırıldı. Bu RNA sonra da aşağı akım quantifications ve normalizations kullanılabilir.
BrU-IP ve RT-qPCR, gibi son derece hassas nicel deneyleri yaparken doğru pipetting teknikleri açısından büyük önem taşıyor ve belirli bir çaba eşit örnekler üzerindeki pipetting gerçekleştirmek için yapılmalıdır. Fenol kloroform çekimi biraz tecrübe talep, ancak yetersiz pipetting üzerine sulu ve fenol/kloroform aşamaları yeniden karışık olabilir ve yeniden centrifuged.
Bu iletişim kuralı BrU-etiketi için 1 h RNA sentezi ölçerken öneriyor. Bu etiketleme süre değişiklikleri transkripsiyon, insan çoğunluğu beri kaba bir tahmin etkinleştirir ve half-life için tahmini fareler mRNA'ların > 6 h18,19. Dikkat gerekir, ancak, birçok RNA'ların yarı canlıdır bu yana verileri yorumlama, elde edilen icra edilebilir < 1s18,19, hangi hızla stimülasyon artırmak ve geri düşüş A, Lipid tarafından indüklenen birkaç transkript gibi Base-line 2 h sonra indüksiyon20seviyede. RNA bozulması, BrU-etiketi zaman etkilerden riskini düşürmek için azalmıştır, ancak, ayrıca 1 h etiketleme bizim eller (sonra elde edildi arka planı (BrU-IP tarafından elde RNA ayırt edebilmek için yeterli RNA etiketlemek önemlidir Şekil 2)). RNA sentezi ve gen BrU-etiketleme ve IP kullanarak ilgi çürüme ölçmek için başka bir seçenektir, ikinci yöntem2' de açıklanan. Bu iki yaklaşım verilerden birbirlerini tamamlamak ve sentez iki koşul arasında bir değişiklik ölçülür, ancak herhangi bir değişiklik çürüme oranlarında görülüyor bu ölçülen değişiklikleri RNA sentezi düzenlenmesi nedeniyle olduğunu söylenebilir. Ancak, her iki teknikleri sadece RNA işlevi RNA düzeyleri hesaplanıyor tarafından ölçmek ve tamamen kimyasal değişimleri14gibi RNA işlevleri etkileyen diğer mekanizmaları araştırmak ihmal hatırlamak önemlidir.
Hücreleri BrU ile sadece 1 saat inkübe beri çok yavaş üretilen mRNA'ların BrU-IP yöntemini kullanarak ölçmek zor olabilir. Bu nerede α-amanitin ve actinomycin D gibi transkripsiyon inhibitörleri kullanımı olabilir tercih edilen BrU-IP üzerinden bir noktadır ancak, onlar sadece bozulması değişiklikleri ölçmek ve doğrudan RNA üretim ölçmek için kullanılabilir. BrU-etiketli RNA düşük düzeyde da aşılabilir BrU kuluçka zamanla artırarak, olsa da, uzun bir kuluçka kez etkiler riski RNA bozulması tarafından artırmak. Bu durumda, artık BrU etiketli RNA değişimler RNA üretim veya çürüme değişiklikleri nedeniyle olup olmadığını bilmek mümkün değil.
Bu örnekte, RT-qPCR kullanılarak yakalanan BrU etiketli RNA aşağı akım analizi yapılır, ancak, yeni nesil sıralama da RNA'ların2,13büyük bir havuz değişimler için ekran için yaygın olarak kullanılan bir aşağı akım yöntemi. Benzer şekilde, yöntem mRNA'ların analizi için sınırlı değildir, ancak RNA'ların2her türlü analiz edebiliriz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Lundbeck Vakfı, Aarhus Üniversitesi, Dandrite ve Lundbeck A/S bu çalışmaları destekledi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
- Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
- Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
- Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
- Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
- Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity? Transcription. 2, 103-108 (2011).
- Tani, H., et al. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
- Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
- Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
- Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
- Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
- Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
- Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).
