Summary
Ici, nous utilisons bidimensionnelle semi dénaturation gel d’agarose pour confirmer la présence de fibres amyloïdes semblables de taille hétérogène et exclure la possibilité que l’hétérogénéité de taille est due à la dissociation des fibres amyloïdes durant le gel processus en cours d’exécution.
Abstract
Des fibres amyloïdes ou type amyloïde ont été associés à plusieurs maladies humaines et sont maintenant découverts importante pour nombreuses voies de signalisation. La capacité de facilement détecter la formation de ces fibres dans différentes conditions expérimentales est essentielle pour comprendre leur fonction potentielle. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour détecter les fibres, mais pas sans quelques inconvénients. Par exemple, la microscopie électronique (me), ou coloration au rouge Congo ou thioflavine T souvent nécessite purification des fibres. En revanche, semi-dénaturation détergent gel d’agarose (SDD-AGE) permet de détecter des fibres amyloïdes semblables SDS-résistants dans les extraits de cellules sans purification. En outre, il permet la comparaison de la différence de taille des fibres. Plus important encore, il peut être utilisé pour identifier des protéines spécifiques dans les fibres par Western Blot. C’est moins fastidieux et plus facilement accessibles à un plus grand nombre de laboratoires. Résultats de la SDD-âge présentent souvent un degré variable d’hétérogénéité. Cela soulève la question de savoir si la partie de l’hétérogénéité résulte de la dissociation de la protéine complexe lors de l’électrophorèse en présence de SDS. Pour cette raison, nous avons utilisé une deuxième dimension du SDD-âge pour déterminer si l’hétérogénéité de taille vue dans SDD-âge est vraiment un résultat de fibre hétérogénéité en vivo et non le résultat de dégradation ou de dissociation de certains des protéines au cours de électrophorèse. Cette méthode permet la confirmation rapide et qualitative que les fibres amyloïdes ou type amyloïde ne sont pas partiellement dissociant au cours du processus de la SDD-âge.
Introduction
La formation de fibres amyloïdes due à un mauvais repliement des protéines a longtemps à jouer un rôle dans des conditions pathologiques comme la maladie d’Alzheimer, de Parkinson et la maladie de Huntington1. Plus récemment, la formation des fibres amyloïdes ou type amyloïde s’est avérée être une partie des voies de signalisation chez les humains, y compris lors des anti-viraux réponse immunitaire innée2 et necroptosis3,4et chez les organismes inférieurs comme la levure5,6. Par conséquent, la capacité à détecter ces fibres dans le laboratoire est importante. Actuellement, il existe trois manières de détecter amyloïde et les fibres de type amyloïde : l’utilisation de colorants, EM et SDD-âge.
L’utilisation de colorants, comme le rouge Congo ou thioflavine T, offre l’avantage d’être rapide et facilement détectables à l’aide de la microscopie ou spectroscopie7. Toutefois, la détection au microscope, dans le cas du rouge Congo, ne fournit aucune spécificité dont les protéines forment les fibres ou la taille des fibres. De même, l’utilisation de la spectroscopie pour détecter le rouge Congo ou thioflavine T contraignant pour des complexes de protéine fournit seulement un résultat positif ou négatif.
EM fournit une preuve concluante de la présence de fibres ainsi que des informations quantitatives sur la longueur et le diamètre de fibre8. Toutefois, cette méthode nécessite une purification très stricte. En outre, l’EM est une technique spécialisée qui utilise des équipements coûteux.
DDD-AGE a été utilisé pour déceler les SDS résistant mega Dalton protéines complexes incluant des fibres amyloïdes ou type amyloïde. Il offre de nombreux avantages. Tout d’abord, il ne nécessite pas la purification des fibres et est facile à réaliser9. Deuxièmement, il fournit des informations qualitatives sur la taille des fibres, y compris la taille relative et la quantité de heterogenicity de la fibre. Enfin, parce que le Western blot peut être réalisée après électrophorèse, il est facile de détecter la présence d’une protéine pour laquelle il y a un anticorps, bien qu’il est à noter que DDD-âge étant semi dénaturation, certains épitopes peuvent rester cachés qui complique la détection de l’anticorps.
Récemment, interaction protéine kinase du récepteur de 1 (RIPK1) et 3 (RIPK3) ont été signalés à fibres amyloïdes forme pour servir de plates-formes de signalisation au cours de la necroptosis, une forme programmée de nécrose3. Alors qu’ils étudiaient ces fibres, notre laboratoire a montré qu’une autre protéine associée à la necroptosis, mélangé de kinase de lignée domaine ressemblant (MLKL), a également formé des fibres de type amyloïde4. Toutefois, suite à l’examen avec SDD-âge, la taille des fibres MLKL semblait distingue les fibres RIPK1 et RIPK3, qui est apparu identiques les uns aux autres (Figure 1). C’était inattendu, parce qu’il est bien connu que les MLKL se lie à RIPK1/RIPK3 pour former la necroptosis signalisation complexe appelé le necrosome10.
Il y a au moins deux explications. Tout d’abord, deux fibres de type amyloïde totalement distincts peuvent se former lors de necroptosis, un contenant RIPK1/RIPK3 et autre MLKL le contenant. En second lieu, qu’un seul type de fibres de type amyloïde que contenant RIPK1/RIPK3/MLKL peut se former pendant la necroptosis, mais l’association des MLKL avec les autres protéines est suffisamment faible pour qu’il se dissocie au cours de la SDD-âge.
Pour y remédier, nous vous proposons effectuant un bidimensionnel (2D) DDD-âge. DDD-âge-stable amyloïde ou des fibres de type amyloïde aura le même schéma de migration lors de l’électrophorèse de la première et la deuxième dimension. Ce sera détectable après transfert des protéines à une membrane et de réaliser un Western blot. Fibres stables exposera un motif diagonale forte. Tout écart par rapport à cela suggère que les fibres subissent des changements en raison de l’électrophorèse SDS.
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Protocol
1. préparer les échantillons
- Amyloïde de6 culture 2 x 10 produisant des cellules de cancer du côlon HT-29 dans un plat de culture de tissu de 10 cm dans 10 mL de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) contenant 10 % sérum de veau fœtal et la pénicilline-streptomycine. Cellules en culture pour la nuit dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2.
- Après que les cellules se développent à la confluence de 80 %, laver les cellules avec 10 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 3 mL de solution de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 3 min.
- Après que les cellules sont totalement dissociés du plat, ajouter 10 mL de milieu de culture et transférer les cellules avec une pipette de 10 mL dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger les cellules à 1 000 x g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le milieu, remettre en suspension les cellules dans 5 mL de milieu de culture et compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Plaque de 2 x 106 cellules dans chacune des deux plats de 10 cm.
- Permettre aux cellules d’adhérer et de récupérer toute la nuit dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2. Appliquer le traitement à une seule soucoupe pour induire la formation d’amyloïdes avec 20 ng/mL de facteur de nécrose tumorale-Alpha (TNF-α), 100 inhibiteur nM Smac-mimétiques et 20 µM pan-caspase Z-VAD-FMK11. La combinaison est abrégée comme zone de sécurité temporaire. Traiter l’autre plat avec le véhicule comme un contrôle.
- Après la durée appropriée, habituellement de 6 h, récolter le lysat cellulaire.
- Gratter les cellules de la plaque avec une spatule en plastique et une pipette de 10 mL permet de transférer dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger les cellules à 1 000 x g pendant 3 min à 4 ° C.
- Laver les cellules 2 fois par resuspendant dans 10 mL de PBS froid glace et centrifugation à 1 000 x g pendant 3 min à 4 ° C. Aspirer la solution de PBS.
Remarque : Le processus peut être interrompu ici par le culot de congélation dans l’azote liquide et le stockage à ˗80 ° C pendant environ 1 mois. - Transférer le culot cellulaire dans un tube de microtubes de 1,5 mL et incuber dans 0,3 mL de tampon de lyse pendant 30 minutes sur la glace. Centrifuger à 20 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Le surnageant est le lysat de cellules entières.
Remarque : Le processus peut être interrompu ici en stockant l’échantillon à-20 ° C pendant plusieurs mois. - Mesurer la concentration en protéine par une analyse de Bradford, selon le protocole du fabricant. Ajouter 4 x tampon de charge SDD-âge pour préparer 20 µL de 3 µg/µL d’échantillon et incuber à température ambiante pendant 10 min.
2. préparer et exécuter les Gels
- Ajouter 2 g d’agarose dans 200 mL de tampon Tris-acétate de 1 x (TAE) dans un bécher en verre et chauffer au micro-ondes pour faire fondre l’agarose. Ajouter 1 mL de la SDD de 20 % pour une concentration finale de 0,1 % SDS. Bien agiter pour mélanger. Prendre soin de ne pas pour générer des bulles après l’ajout de SDS.
- Verser la solution de gel d’agarose dans une plaque de gel de 15 cm x 14 cm. Utiliser une pipette 1 mL d’éliminer toutes les bulles. Placer un peigne de 20 puits au sommet.
- Première dimension : Pipette 60 µg de germes entiers lysat dans la voie de l’extrême-droite. Exécutez le gel à 60 V pendant 4 h environ (jusqu'à ce que le front de colorant est environ ¾ à travers le gel) en utilisant de la TAE contenant du SDS 0,1 % comme le tampon en cours d’exécution.
- Deuxième dimension : tourner soigneusement le gel de 90° dans le sens antihoraire (Figure 2A). Exécutez le gel à 60 V pendant environ 4 h.
Remarque : L’état général de fonctionnement est de 4 V/cm de longueur de gel. Il est important que les conditions de marche ne sont exactement les mêmes pour les dimensions de la premières et la deuxième.
3. transfert
- La méthode de transfert capillaire permet de transférer les protéines à une polyvinylidène difluoride (PVDF) membrane (Figure 2B).
- Ajouter 500 mL de tampon de transfert à un conteneur de 20 x 20 cm environ. Faire une pile haute de 5 cm de serviettes en papier à côté du conteneur. La superficie de la partie supérieure de la pile doit être supérieure aux dimensions de gel.
- Tremper un papier-filtre 14 x 15 cm dans le tampon de transfert et les placer sur le dessus de la pile de serviettes de papier. Prenez soin de placer sur le papier sans rides ni bulles. Répéter l’opération avec un autre morceau de papier filtre.
- Activer une membrane PVDF 14 x 15 cm dans le méthanol pendant 30 s puis il couche sur le papier filtre en prenant soin d’utiliser un rouleau pour enlever toutes les bulles. Rincer le gel avec tampon de transfert et il couche sur le dessus de la membrane, à nouveau dérouler toutes les bulles.
- Couvrir le bord des plus proche sur le conteneur de tampon de transfert d’une pellicule plastique serviettes en papier. Il est important que le pont de papier construit à l’étape suivante n’entre pas en contact direct avec la pile de serviettes de papier.
- Tremper un morceau de papier filtre 15 x 35 cm dans le tampon de transfert et placez-le donc une extrémité couvre le haut du gel et l’autre extrémité est dans le conteneur de tampon de transfert. Répéter l’opération avec un autre pont.
- Couvrir le récipient d’une pellicule plastique et laisser une nuit à température ambiante.
4. Western Blotting détection
- Rincer la membrane avec 50 mL de PBS contenant 0,05 % de Tween-20 (PBST) dans un récipient de 20 × 20 cm. Ajouter 20 mL de lait 5 % dans du PBST. Roche à température ambiante pendant 30 min à bloquer.
- Déposer 10µl d’anticorps de lapin anti-MLKL dans 20 mL de lait 5 % dans du PBST et ajouter au conteneur. Incuber le rocker durant la nuit à 4 ° C.
- Laver la membrane dans 20 mL de PBST pendant 5 min. Répétez 5 fois.
- Déposer 4 µL d’anti-rabbit-HRP à 20 mL de lait 5 % dans du PBST et ajouter au conteneur. Incuber le rocker à température ambiante pendant 2 h.
- Laver la membrane dans 20 mL de PBST pendant 5 min. Répétez 5 fois.
- Ajoutez le substrat chimiluminescence améliorée (ECL) et exposer aux films radiographiques selon le protocole du fabricant.
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Representative Results
Après l’induction de la necroptosis, RIPK1 et RIPK3 ont montré des patrons de type amyloïde presque identiques (pistes 2 et 4, Figure 1). Cependant, les fibres MLKL sont plus hétérogènes et semblaient être plus petites que les fibres de RIPK1/RIPK3 (voie 6, Figure 1). Qui nous a amenés à développer la méthode 2D de SDD-âge pour aborder la possibilité MLKL forme des fibres RIPK1/RIPK3-indépendant ou MLKL se dissocie simplement des grandes fibres de RIPK1/RIPK3/MLKL au cours de la SDD-âge.
Un schéma général de la procédure de l’électrophorèse et de transfert est illustré à la Figure 2. Au cours de la première dimension SDD-âge, les fibres amyloïdes ou type amyloïde exposera un frottis caractéristique, comme le montre la Figure 3A. Lors de l’exécution de la deuxième dimension SDD-AGE, il y a deux résultats possibles. Dans le cas d’aucune dégradation ou dissociation pendant le gel exécutant les processus, les fibres vont migrer identiquement au cours de la deuxième manche comme ils le faisaient dans la première manche. Dans ce cas, un Western blot exposera un motif diagonale sur la membrane à un angle de 45° comme le montre la Figure 3B. Si les fibres se dissocient pendant le processus de la SDD-âge, les fibres plus petites migrera plus vite au cours de la deuxième électrophorèse. Dans ce cas, un Western blot exposera des stries verticales au-dessous de la ligne diagonale, comme illustré à la Figure 3C.
Dans le cas des fibres MLKL vus au cours de la necroptosis, ils montrent le frottis caractéristique au cours de la première dimension SDD-âge (Figure 4A). Lorsque ces mêmes fibres étaient soumis aux 2D SDD-âge, ils ont montré une forte diagonale avec aucune verticale formant des stries (Figure 4B). Avec cette preuve, il a été conclu que MLKL ne était pas dissociant les fibres au cours du processus de la SDD-âge et que les fibres contenant MLKL illustrés à la Figure 1 ont été en effet distinguer les fibres RIPK1/RIPK3. En outre, lorsque RIPK3 était immuno-deplété des lysats de cellules, les fibres MLKL est resté intact4, confirmant que les fibres MLKL et RIPK1/RIPK3 fibres sont des entités distinctes en effet.
Figure 1 . Examen des fibres amyloïdes semblables au cours de la necroptosis. Lysats de cellules entières ont été récoltées à partir des cellules subissant necroptosis induite par le TNF et soumis à la SDD-âge. Transfert Western ont été effectués pour RIPK1, RIPK3 et MLKL. Les fibres contenant MLKL expose un modèle de migration distinctes des RIPK1/RIPK3-contenant des fibres. Le monomère MLKL est à peine visible sous cette condition. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Protocole expérimental. (A) Représentation schématique du bidimensionnel semi dénaturation détergent gel d’agarose (2D SDD-AGE). Commencez par charger l’échantillon dans la voie de droite la plupart marquée en rouge. Après la fin de la première manche de la dimension, faire pivoter le gel de 90° dans le sens anti-horaire. Exécuter la deuxième électrophorèse de dimension. Solide flèche indique le sens de la première dimension exécuter, les flèches en pointillés indiquent la direction de la deuxième dimension exécute. (B) schéma de transfert par capillarité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Résultats possibles. Modèle (A) la migration prévue des fibres amyloïdes ou type amyloïde après la première dimension de SDD-âge. Solide flèche indique le sens de la migration. Modèle (B) la migration attendue de l’amyloïde SDD-âge-stable (pas de dégradation ou de dissociation) ou des fibres de type amyloïde après 2D SDD-âge. Solide flèche indique le sens de la première dimension SDD-âge. Flèches en pointillés indiquent la direction de la deuxième dimension SDD-âge. (C) le modèle de migration attendue de l’amyloïde non SDD-âge-stable ou de fibres de type amyloïde. Solide flèche indique le sens de la première dimension SDD-âge. Flèches en pointillés indiquent la direction de la deuxième dimension SDD-âge. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 4. Fibres contenant de la migration de MLKL au cours de la 1D et 2D SDD-âge. (A) les lysats de cellules entières ont été récoltés sur les cellules stimulées par TSZ subir une necroptosis. Les lysats ont été soumis à la SDD-âge et un Western blot a été réalisé pour MLKL. Un frottis caractéristique a été observé. (B) les lysats de cellules entières ont été récoltés sur les cellules stimulées par TSZ subir une necroptosis. Les lysats ont subi 2D SDD-âge et un Western blot a été réalisé pour MLKL. Une ligne pointue à un angle de 45° a été observée, ce qui indique que les fibres ne subissent pas de dissociation pendant âge SDD. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’aspect le plus important de la SDD 2D-âge, c’est que les conditions de l’électrophorèse sont les mêmes pour la première et la deuxième dimension. La capacité à détecter une forte diagonale à 45° (ce qui indique qu’aucune dissociation ou la dégradation ne s’est produite) dépend des fibres de migration de manière identique pendant les deux electrophoreses. À l’aide de conditions différentes, par exemple changer la tension ou la longueur du moment de l’exécution, masquera ces résultats. En outre, comme c’est le cas pour traditionnel 1D SDD-âge, point d’ébullition de l’échantillon il faut éviter, car cela va perturber amyloïde et les fibres de type amyloïde. Comme c’est le cas pour tous les transferts, il faut pour éviter les bulles entre les couches de papier filtre, membrane et gel. Enfin, au cours de l’étape de transfert, il est essentiel que le pont ne pas s’affaisser et contacter directement la pile de serviettes de papier. Un moyen fiable pour éviter cela est d’utiliser un petit morceau de pellicule de plastique pour couvrir le bord de l’essuie-tout.
Les conditions de fonctionnement prévues dans le protocole (60 V pendant 4 h) peuvent être ajustées. Par exemple, dans le présent protocole, le gel d’agarose a 14 x 15 cm. Si on utilise un gel plus petit, tension (longueur de gel 4 V/cm) et le moment de l’exécution doivent être ajustées proportionnellement. Deux échantillons peuvent être analysés à la fois à l’aide de deux peignes, lors de la préparation du gel. Les échantillons doivent être chargés dans le droit plus bien pour chaque peigne. Dans ce cas, le moment de l’exécution devrait à nouveau être raccourcie afin que l’échantillon supérieur ne s’exécute pas dans le fond la moitié du gel. Si l’heure est ajustée pour l’une dimension du gel, il est essentiel que l’autre dimension est ajustée pour correspondre.
Contrairement à la SDS-PAGE, les 1D et 2D SDD-âge sont semi-dénaturation. Parce que les fibres restent intacts, certains épitopes pourraient rester inaccessibles. Cela peut limiter la détection de certains anticorps. DDD-âge 2D est limité dans sa capacité à déterminer la taille exacte des fibres amyloïdes ou type amyloïde. Cependant, on peut faire une comparaison de taille relative.
Tous les complexes de protéine sont soumises à la dissociation ou de dégradation au cours de la SDD-âge, et donc les résultats qualitatifs peuvent être difficiles à interpréter. L’utilisation de 2D SDD-âge permet la confirmation que l’hétérogénéité de taille vue au cours de la SDD-AGE n’est pas à cause de la dissociation de SDS-dépendante pendant l’électrophorèse. DDD-âge 2D est approprié à utiliser dans un contexte où le traditionnel D 1 SDD-AGE sert. 2D SDD-âge est particulièrement utile lors de l’hétérogénéité de taille est observée dans 1 D DDD-âge.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par une bourse de recherche pour S.H..-a. du NIH/NCATS (TL1TR001104), une fondation de Welch accorder (I-1827) et une bourse de R01 de NIGM (RGM120502A) au Z.W. Z.W. est le savant de Linthicum Virginie Murchison en recherche médicale et de prévention du Cancer Research Institute of Texas Scholar (R1222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
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