Name: Uso de dos electroforesis del Gel de la agarosa detergente semi desnaturalización Dimensional para confirmar la heterogeneidad de tamaño de las fibras amiloides o amiloide-como (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprende electroforesis bidimensional semi-desnaturalizante en agarosa para confirmar la heterogeneidad de tamaño de fibras amiloides. Este método permite determinar si las variaciones son propias de las fibras o artefactos experimentales.

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Este trabajo es apoyado por una beca para la S.H.-A. de NIH/NCATS (TL1TR001104), una Fundación de Welch conceder (I-1827) y una subvención R01 de NIGMS (RGM120502A) a Z.W. Z.W. es el Virginia Murchison Linthicum erudito en investigación médica y la prevención del cáncer e Instituto de investigación de Texas erudito (R1222).

1. preparar las muestras
<ol><li>Amiloide de cultura 2 x 106 produciendo las células de cáncer de colon HT-29 en un plato de cultivo de tejidos de 10 cm en 10 mL de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con suero bovino fetal 10% y penicilina-estreptomicina. Las células de cultivos durante la noche en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2.<ol>
<li>Después de que las células crecen al 80% de confluencia, lavan las células con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 3 mL de solución de tripsina e incubar a 37 ° C durante 3 minutos.</li>
		<li>Después de que las células están totalmente disociadas de la fuente, añadir 10 mL de medio de cultivo y transferencia de las células con una pipeta de 10 mL a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Aspire el medio, resuspender las células en 5 mL de medio de cultivo y contar las células usando un contador de células. Placa de 2 x 106 células en cada uno de los dos platos de 10 cm.</li>
		<li>Permitir que las células se adhieren y recuperar durante la noche en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2. Aplicar un tratamiento a un plato para inducir la formación de amiloides con 20 ng/mL de Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α), 100 inhibidor nM Smac mimética y 20 μm pan-caspasas Z-VAD-FMK11. La combinación se abrevia como zona temporal de seguridad. Tratar el otro plato con el vehículo como un control.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de la longitud adecuada de tiempo, generalmente 6 h, cosecha el lysate de la célula.<ol>
<li>Raspar las células de la placa con una rasqueta de plástico y usar una pipeta de 10 mL para transferir a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min a 4 ° C.</li>
		<li>Lavar las células 2 veces a resuspender en 10 mL de PBS frío hielo y centrifugación a 1.000 x g durante 3 min a 4 ° C. Aspirar la solución de PBS. Nota: El proceso puede hacer una pausa aquí congelando el precipitado de células en nitrógeno líquido y guardar a ˗80 ° C durante 1 mes.</li>
		<li>Transfiera el sedimento de células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e incubar en 0,3 mL de tampón de lisis por 30 min en hielo. Centrifugar a 20.000 x g durante 15 min a 4 ° C. El sobrenadante es el lisado de células enteras. Nota: El proceso puede hacer una pausa aquí mediante el almacenamiento de la muestra a-20 ° C por hasta varios meses.</li>
		<li>Medir la concentración de proteína por un ensayo de Bradford según protocolo del fabricante. Añadir 4 x buffer de carga de SDD-edad preparar 20 μl de muestra de 3 μg/μl e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparar y ejecutar geles
<ol><li>Añadir 2 g de agarosa a 200 mL de tampón de Tris acetato 1 x (TAE) en un vaso de vidrio y calor en el microondas para fundir la agarosa. Añadir 1 mL de SDS 20% para una concentración final de 0.1% SDS. Agitar cuidadosamente para mezclar. Tenga cuidado de no para generar burbujas después de la adición de SDS.</li>
	<li>Verter la solución de agarosa en una placa de gel de 15 cm x 14 cm. Utilice una pipeta de 1 mL para eliminar cualquier burbuja. Coloque un peine de 20 pozos en la parte superior.</li>
	<li>Primera dimensión: pipeta 60 μg de células enteras lisado en el carril de extrema derecha. Correr el gel a 60 V por cerca de 4 horas (hasta que el frente del tinte es de ¾ a través del gel) con la TAE que contiene 0.1% SDS como el búfer de ejecución.</li>
	<li>Segunda dimensión: gire con cuidado el gel 90° en sentido antihorario (figura 2A). Correr el gel a 60 V por cerca de 4 horas. Nota: La condición general de la corriente es 4 V/cm longitud de gel. Es importante que las condiciones son exactamente iguales a las dimensiones primeras y segunda.</li>
</ol>3. transferencia
<ol><li>Utilice el método de transferencia capilar para transferir las proteínas a una membrana (PVDF) de difluoruro de polivinilideno (figura 2B).<ol>
<li>Añadir 500 mL de tampón de transferencia a un contenedor de 20 cm x 20 cm aproximadamente. Hacer una pila alta de 5 cm de toallas de papel al lado del contenedor. La superficie de la parte superior de la pila debe ser mayor que las dimensiones del gel.</li>
		<li>Empapar un papel de filtro de 14 cm x 15 cm en tampón de transferencia y coloque encima de la pila de toallas de papel. Tenga cuidado de colocar en el papel sin arrugas o burbujas. Repita con el otro trozo de papel de filtro.</li>
		<li>Activar una membrana PVDF de 14 cm x 15 cm en metanol por 30 s entonces la capa en el papel filtro, teniendo cuidado de utilizar un rodillo para quitar todas las burbujas. Enjuagar el gel con el tampón de transferencia y capa encima de la membrana, otra vez el despliegue de las burbujas.</li>
		<li>Cubrir el borde de las toallas de papel más cercanos al recipiente que contiene el tampón de transferencia con envoltura de plástico. Es importante que el puente de papel, construido en el paso siguiente no entra en contacto directo con la pila de toallas de papel.</li>
		<li>Remoje un pedazo de papel de filtro de 15 cm x 35 cm en tampón de transferencia y coloque un extremo cubre la parte superior del gel y el otro está en el recipiente que contiene el tampón de transferencia. Repita con el otro puente.</li>
		<li>Cubrir el recipiente con papel plástico y dejar durante la noche a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Western Blot detección
<ol><li>Lavar la membrana con 50 mL de PBS que contenga 0.05% Tween-20 (SAFT) en un recipiente de 20 cm x 20 cm. Añadir 20 mL de leche de 5% en SAFT. Roca a temperatura ambiente durante 30 min para bloquear.</li>
	<li>Pipetear 10 μl de anticuerpo de conejo anti-MLKL en 20 mL de leche de 5% en SAFT y agregar al contenedor. Incubar en el eje de balancín de la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar la membrana en 20 mL de SAFT para 5 minutos repita 5 veces.</li>
	<li>Pipetear 4 μL de HRP anti-conejo a 20 mL de leche de 5% en SAFT y agregar al contenedor. Incubar en el eje de balancín a temperatura ambiente durante 2 h.</li>
	<li>Lavar la membrana en 20 mL de SAFT para 5 minutos repita 5 veces.</li>
	<li>Añadir substrato quimioluminescencia realzada (ECL) y exponga a las películas de radiografía según protocolo del fabricante.</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li>
<li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+protein-based+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+2014%3A+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid+%3A+the+international+journal+of+experimental+and+clinical+investigation+%3A+the+official+journal+of+the+International+Society+of+Amyloidosis%22%5BJournal%5D)">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li>
<li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687906120030">Methods in Enzymology</a>. 412, Academic Press. 33-48 (2006).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

El aspecto más crítico de la SDD-edad 2D es que las condiciones de electroforesis son las mismas para la primera y la segunda dimensión. La capacidad para detectar una fuerte línea diagonal a 45° (lo que indica que no se ha producido ninguna disociación o degradación) depende de las fibras de migrar de manera idéntica durante electroforesis. Usando diferentes condiciones, por ejemplo cambiando la tensión o la longitud de tiempo de ejecución, se oscurecen estos resultados. También, como es el caso de tradicional 1D SDD-ed...

La formación de fibras amiloides debido a mal plegamiento de proteínas ha sido conocida para jugar un papel en condiciones patológicas como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington1. Más recientemente, la formación de fibras amiloides o amiloide-como se ha demostrado que una parte de vías de señalización en los seres humanos, incluyendo durante la respuesta inmune innata antiviral2 y necroptosis3,4y en organismos inferiores como levadura5,6. Por lo tanto, la capacidad para detectar estas fibras en el laboratorio es importante. Actualmente, hay tres maneras principales para detectar amiloide y las fibras de amiloide-como: el uso de tintes, EM y SDD-edad.
El uso de tintes, como el rojo Congo o tioflavina T, ofrece la ventaja de ser rápida y fácilmente detectable mediante microscopía o espectroscopia7. Sin embargo, la detección por microscopía, en el caso de Congo rojo, proporciona ninguna especificidad acerca de que las proteínas constituyen las fibras, o el tamaño de las fibras. Del mismo modo, el uso de la espectroscopia para detectar rojo Congo o Thioflavin T Unión a complejos de proteínas proporciona sólo un resultado positivo o negativo.
EM proporciona pruebas concluyentes de la presencia de fibras y también información cuantitativa acerca de la fibra longitud y diámetro8. Sin embargo, este método requiere purificación muy estricta. Además, la EM es una técnica especializada que utiliza el equipo costoso.
SDD-edad se ha utilizado para detectar resistente SDS mega Dalton complejos incluyendo las fibras de amiloide o amiloide-como. Ofrece muchas ventajas. En primer lugar, no requiere la purificación de las fibras y es fácil de realizar9. En segundo lugar, proporciona información cualitativa sobre el tamaño de las fibras, como el tamaño relativo y la cantidad de heterogenicidad de la fibra. Por último, porque el borrar occidental puede realizarse después de la electroforesis, es fácil de detectar la presencia de cualquier proteína que se encuentra un anticuerpo, aunque cabe señalar que debido a SDD-edad es semi-desnaturalización, algunos epitopos pueden permanecer oculto que complica la detección de anticuerpos.
Recientemente, receptor interacción proteína quinasa 1 (RIPK1) y 3 (RIPK3) se han divulgado para formar fibras amiloides para servir como plataformas de señalización durante la necroptosis, forma programada de necrosis3. Mientras que de estudiar estas fibras, nuestro laboratorio demostró que otra proteína asociada a la necroptosis, mezclado quinasa de linaje como dominio (MLKL), también forma las fibras de amiloide-como4. Sin embargo, en el examen con SDD-edad, el tamaño de las fibras MLKL apareció distinto de las fibras RIPK1 y RIPK3, que parecían idénticas entre sí (figura 1). Esto fue inesperado porque es bien sabido que MLKL se une a RIPK1/RIPK3 para formar la necroptosis señalización complejo llamado el necrosome10.
Hay al menos dos explicaciones. En primer lugar, dos fibras de amiloide-como totalmente distintas pueden formar durante la necroptosis, RIPK1/RIPK3 con uno y el otro MLKL que contiene. En segundo lugar, sólo un tipo de amiloide-como las fibras que contienen RIPK1/RIPK3/MLKL pueden formarse durante la necroptosis, pero la Asociación de MLKL con otras proteínas es débil lo suficiente que disocia en SDD-edad.
Para hacer frente a esto, proponemos realizar una edad SDD bidimensional (2D). SDD-edad-stable amiloide o fibras de amiloide-como tienen el mismo patrón de migración durante la electroforesis de la primera y la segunda dimensión. Esta será detectable después de la transferencia de las proteínas a una membrana y realizar un Western blot. Fibras estables exhiben un patrón diagonal fuerte. Cualquier desviación de esto sugeriría que las fibras se someten a cambios debido a la electroforesis de SDS.

<table><tbody><tr><td>unidad de electroforesis en gel</td><td>Fisher</td><td>HE99XPRO</td><td>appratus para correr en gel.</td></tr><tr><td>agrose</td><td>VWR</td><td>97062-250</td><td>Para gel de agarosa.</td></tr><tr><td>torre de papel</td><td>Fisher</td><td>19-120-2484</td><td>para transferencia</td></tr><tr><td>de papel de filtro</td><td>VWR</td><td>21427-386</td><td>para transferencia de</td></tr><tr><td>PVDF membrana</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td>para transferencia de</td></tr><tr><td>leche en polvo bloqueante</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404XTU</td><td>para bloqueo en Western blot</td></tr><tr><td>Anticuerpo MLKL</td><td>Genetex</td><td>GTX107538</td><td>conejo anticuerpo anti-MLKL</td></tr><tr><td>Anticuerpo RIPK1</td><td>BD Biosciences</td><td>610459</td><td>ratón anticuerpo anti-RIPK1 anticuerpo</td></tr><tr><td>RIPK3</td><td>regalo del Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>conejo anti-RIPK3. Véase refenence 11.</td></tr><tr><td>anti-Rabbit-HRP</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Fisher</td><td>WBKLS0500</td><td>sustrato HRP quimioluminiscente occidental</td></tr><tr><td>película de rayos X</td><td>Fisher</td><td>F-BX810</td><td>para resultado de Western blot</td></tr><tr><td>DMEM Sigma</td><td></td><td>D6429</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>suero fetal bovino</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>Solución de tripsina</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>PBS para cultivo de tejidos</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>TNF recombinante</td><td>fabricado en nuestro laboratorio</td><td></td><td>para inducir necroptosis. Véase la referencia 11.</td></tr><tr><td>regalo mimético del</td><td>Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>para inducir la necroptosis. Véase la referencia 11.</td></tr><tr><td>ZVAD-FMK</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>para inducir la necroptosis. Véase la referencia 11.</td></tr><tr><td>Contador</td><td>de células Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>modelo TC20; para el recuento de células</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>para medir la concentración de proteínas en lisados celulares</td></tr><tr><td>Elevador de células</td><td>Fisher</td><td>07-200-364</td><td>para eliminar células de la placa</td></tr><tr><td>Tampón de lisis (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glicerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (inhibidores de proteasas y fosfatos según se desee)</td></tr><tr><td>10X TAE (1 L)</td><td></td><td></td><td>48.4 g Tris base 11.42 mL ácido acético glacial 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 a 1 L</td></tr><tr><td>4X SDD-AGE TAMPÓN DE CARGA (50 mL)</td><td></td><td></td><td>5 mL 10X TAE 10 mL glicerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% azul de bromofenol 31 mL tampón de transferencia TBS ddH2O</td></tr><tr><td>(1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 m Tris pH 7.4 30 mL 5 m NaCl 950 mL ddH2O</td></tr><tr><td>Tampón de lavado PBST (1 L)</td><td></td><td></td><td>100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20</td></tr><tr><td>10X PBS (10 L)</td><td></td><td></td><td>800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4&middot; 2H2O 24 g KH2PO4 añadir ddH2O a 10 L</td></tr></tbody></table>

uso de dos electroforesis del gel de la agarosa detergente semi desnaturalización dimensional para confirmar la heterogeneidad de tamaño de las fibras amiloides o amiloide-como

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Fibras amiloides o amiloide-como han sido asociadas con muchas enfermedades humanas y ahora se están descubriendo importantes para muchas vías de señalización. La capacidad de detectar fácilmente la formación de estas fibras en diferentes condiciones experimentales es esencial para la comprensión de su función potencial. Muchos métodos se han utilizado para detectar las fibras, pero no sin algunos inconvenientes. Por ejemplo, microscopía electrónica (EM), o tinción con rojo Congo o Thioflavin T a menudo requiere purificación de las fibras. Por otra parte, la electroforesis en gel de agarosa detergente la desnaturalización (SDD-edad) permite la detección de las fibras de amiloide-como SDS-resistente en los extractos de célula sin purificación. Además, permite la comparación de la diferencia de tamaño de las fibras. Más importante aún, puede utilizarse para identificar proteínas específicas dentro de las fibras por borrar occidental. Es mucho menos tiempo y más fácilmente accesible a un mayor número de laboratorios. SDD-edad resultados a menudo muestran grados variables de heterogeneidad. Plantea la pregunta de si parte de la heterogeneidad resulta de la disociación de la proteína del compleja durante la electroforesis en presencia de SDS. Por esta razón, hemos empleado una segunda dimensión de SDD-edad para determinar si la heterogeneidad de tamaño vista en SDD-edad es realmente consecuencia de la heterogeneidad de fibra en vivo y no un resultado de la degradación o la disociación de algunas de las proteínas durante el electroforesis. Este método permite la confirmación rápida y cualitativa que las fibras de amiloide o amiloide-como no están disociando parcialmente durante el proceso de SDD-edad.

Después de la inducción de la necroptosis, RIPK1 y RIPK3 mostraron patrones de amiloide-como casi idénticos (carriles 2 y 4, figura 1). Sin embargo, las fibras MLKL fueron más heterogéneas y parecen ser más pequeño que las fibras RIPK1/RIPK3 (carril 6, figura 1). Nos impulsó a desarrollar el método SDD-edad 2D para hacer frente a la posibilidad o MLKL forma fibras RIPK1/RIPK3-independiente MLKL simplemente se disocia de las grand...

Aquí utilizamos electroforesis en agarosa semi desnaturalización bidimensional para confirmar la presencia de fibras de amiloide como de tamaño heterogéneo y excluir la posibilidad de que la heterogeneidad de tamaño es debido a la disociación de las fibras amiloides en el gel proceso en ejecución.

Uso de dos electroforesis del Gel de la agarosa detergente semi desnaturalización Dimensional para confirmar la heterogeneidad de tamaño de las fibras amiloides o amiloide-como

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

El objetivo general de esta electroforesis bidimensional semidesnaturalizante en gel de agarosa es confirmar la heterogeneidad de tamaño de las fibras amiloides o similares a las amiloides observadas durante el SDD-AGE tradicional. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de agregación de aminoácidos o proteínas, como si la heterogeneidad de tamaño observada durante el SDD-AGE tradicional es el estado nativo de las fibras in vivo o el resultado de la degradación o disociación de proteínas durante la electroforesis en gel. La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar fácilmente en el laboratorio sin necesidad de equipos especializados.No se requiere ningún equipo adicional más allá de lo que se utiliza en el SDD-AGE tradicional. Primero, siembre las células de cáncer de colon HT-29 productoras de amiloide en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros. Luego, incube las células durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.Una vez que las células alcancen el 80% de confluencia, use solución salina tamponada con fosfato para lavar las células. A continuación, se añaden tres mililitros de tripsina a las células, y se incuba a 37 grados centígrados durante tres minutos. Después de que las células se hayan desprendido de la placa de cultivo, agregue 10 mililitros de medio de cultivo a la placa.Luego, transfiera la suspensión de celdas a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, centrifugar la suspensión celular a 1.000 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, aspire el medio y vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de medio de cultivo.Cuente las celdas usando un contador de celdas. Luego, deje dos placas de cultivo a 37 grados centígrados durante la noche. A continuación, agregue reactivos TSZ a una de las placas de cultivo como tratamiento.Después de unas seis horas, recoja las células con un raspador de plástico. A continuación, transfiera la suspensión de la celda a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 1.000 veces g durante tres minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, lave el pellet de la célula dos veces con 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato helado y repita el proceso de centrifugación.A continuación, aspire la solución de PBS y transfiera el pellet de la celda a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue 0,3 mililitros de tampón de lisis al pellet de la célula e incube en hielo durante 30 minutos. De nuevo, centrifugar a 20.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.El sobrenadante obtenido es el lisado de la célula entera. Al sobrenadante, añadir 4X SDD-AGE tampón para preparar 20 microlitros de tres microgramos por microlitro de muestra. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos.Para preparar el gel, agregue dos gramos de polvo de agarosa a 200 mililitros de tampón TAE en un vaso de precipitados de vidrio. Luego, calienta el vaso en un microondas para derretir la agarosa. A continuación, agregue un mililitro de 20%SDS hasta una concentración final de 0.1%Agite suavemente el vaso de precipitados.A continuación, vierta la agarosa líquida en una losa de gel de 15 por 14 centímetros. Para eliminar las burbujas de aire, utilice una pipeta de un mililitro. Luego, coloque un peine de 20 pocillos encima del gel.A continuación, agregue aproximadamente 60 microgramos de lisado de células enteras en el carril extremo derecho del gel. Haga funcionar el gel a 60 voltios durante aproximadamente cuatro horas utilizando el tampón TAE que contiene 0,1%SDS como tampón de ejecución. Para hacer funcionar el gel en la segunda dimensión, gire con cuidado el gel 90 grados en sentido contrario a las agujas del reloj.Luego, haga funcionar el gel a 60 voltios durante unas cuatro horas. En un recipiente de 20 por 20 centímetros, agregue 500 mililitros de tampón de transferencia. Justo al lado del recipiente, prepare una pila de toallas de papel de cinco centímetros de altura.Luego, remoje dos papeles de filtro, cada uno de 14 por 15 centímetros, en un tampón de transferencia y colóquelos encima de la pila de toallas de papel. Active una membrana de PVDF de 14 por 15 centímetros en metanol durante 30 segundos. Después de la activación, coloque la membrana encima de los papeles de filtro y use un rodillo para eliminar todas las burbujas.La parte más importante de la transferencia es asegurarse de que no se formen burbujas de aire entre el gel y la membrana. Enjuague el gel con tampón de transferencia y colóquelo sobre la membrana. Estira las burbujas que se hayan formado.A continuación, use una envoltura de plástico para cubrir el borde de las toallas de papel más cercano al recipiente del tampón de transferencia. Luego, remoje un trozo de papel de filtro con dimensiones de 15 por 35 centímetros en el tampón de transferencia. Coloque el papel de filtro de manera que un extremo cubra la parte superior del gel y el otro extremo esté en el recipiente del tampón de transferencia.Cubra el recipiente con una envoltura de plástico y déjelo toda la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, enjuague la membrana con 50 mililitros de PBST en un recipiente de 20 por 20 centímetros. A continuación, agregue 20 mililitros de leche al 5% en PBST sobre la membrana.Luego, deje la membrana en el balancín a temperatura ambiente durante 30 minutos para que se bloquee. Pipetear 10 microlitros de anticuerpo anti-MLKL de conejo en 20 mililitros de leche al 5% en PBST. Luego, agregue la mezcla de anticuerpos en la membrana.Incubar la membrana en un balancín durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego, lave la membrana con 20 mililitros de PBST durante cinco minutos. Este lavado se repite cinco veces.A continuación, pipetear cuatro microlitros de anticuerpo anti-conejo-HRP a 20 mililitros de leche al 5% en PBST. Agregue el anticuerpo en la membrana. Deje el recipiente con la membrana en el balancín a temperatura ambiente durante dos horas.Después de dos horas, lave la membrana cinco veces en 20 mililitros de PBST durante cinco minutos cada una. Finalmente, agregue sustrato de quimioluminiscencia mejorada en la membrana. Luego, exponga la membrana a una película de rayos X de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Este estudio se realiza para demostrar la presencia de fibras similares a amiloide resistentes a SDS en lisados de células enteras obtenidas de células tratadas con factor de necrosis tumoral alfa. Aquí se muestra que RIPK1 y RIPK3 muestran patrones similares a los amiloides idénticos. Curiosamente, las fibras MLKL parecen heterogéneas con un patrón de migración diferente al de las demás.Esta imagen muestra el posible patrón de migración de amiloide o fibras similares al amiloide. En la primera dimensión SDD-AGE, las fibras amiloides o similares a las amiloides exhiben un frotis característico. En esta imagen, las fibras migran de manera idéntica en la segunda carrera y exhiben un patrón diagonal de migración en la membrana a 45 grados.Esto demuestra que las fibras no sufren degradación ni disociación durante el proceso de funcionamiento del gel. Por el contrario, si las fibras se disocian, hay rayas verticales por debajo de la línea diagonal, lo que indica una migración más rápida de las fibras más pequeñas durante la segunda electroforesis. Tanto estas fibras SDD-AGE de primera como de segunda dimensión muestran que las fibras MLKL no se disocian durante el proceso SDD-AGE y, de hecho, son distintas de las fibras RIPK1 y RIPK3.En esta imagen, las fibras MLKL muestran un frotis característico durante la primera dimensión. Sin embargo, las mismas fibras muestran una línea diagonal afilada sin rayas verticales en la segunda dimensión SDD-AGE. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que todas las condiciones, como el voltaje y la longitud del recorrido, permanecen iguales entre la primera y la segunda dimensión para garantizar una línea nítida en un ángulo de 45 grados.Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la extracción de la membrana y la repetición de la prueba con otros anticuerpos, para responder preguntas adicionales, como si la fibra contiene otras proteínas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo confirmar que no se está produciendo ninguna degradación o disociación de la amiloide o de las fibras similares a la amiloide durante la SDD-AGE tradicional.

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Bioquímica

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