Uso de dos electroforesis del Gel de la agarosa detergente semi desnaturalización Dimensional para confirmar la heterogeneidad de tamaño de las fibras amiloides o amiloide-como

El objetivo general de esta electroforesis bidimensional semidesnaturalizante en gel de agarosa es confirmar la heterogeneidad de tamaño de las fibras amiloides o similares a las amiloides observadas durante el SDD-AGE tradicional. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de agregación de aminoácidos o proteínas, como si la heterogeneidad de tamaño observada durante el SDD-AGE tradicional es el estado nativo de las fibras in vivo o el resultado de la degradación o disociación de proteínas durante la electroforesis en gel. La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar fácilmente en el laboratorio sin necesidad de equipos especializados.

No se requiere ningún equipo adicional más allá de lo que se utiliza en el SDD-AGE tradicional. Primero, siembre las células de cáncer de colon HT-29 productoras de amiloide en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros. Luego, incube las células durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.

Una vez que las células alcancen el 80% de confluencia, use solución salina tamponada con fosfato para lavar las células. A continuación, se añaden tres mililitros de tripsina a las células, y se incuba a 37 grados centígrados durante tres minutos. Después de que las células se hayan desprendido de la placa de cultivo, agregue 10 mililitros de medio de cultivo a la placa.

Luego, transfiera la suspensión de celdas a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, centrifugar la suspensión celular a 1.000 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, aspire el medio y vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de medio de cultivo.

Cuente las celdas usando un contador de celdas. Luego, deje dos placas de cultivo a 37 grados centígrados durante la noche. A continuación, agregue reactivos TSZ a una de las placas de cultivo como tratamiento.

Después de unas seis horas, recoja las células con un raspador de plástico. A continuación, transfiera la suspensión de la celda a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 1.000 veces g durante tres minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, lave el pellet de la célula dos veces con 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato helado y repita el proceso de centrifugación.

A continuación, aspire la solución de PBS y transfiera el pellet de la celda a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue 0,3 mililitros de tampón de lisis al pellet de la célula e incube en hielo durante 30 minutos. De nuevo, centrifugar a 20.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.

El sobrenadante obtenido es el lisado de la célula entera. Al sobrenadante, añadir 4X SDD-AGE tampón para preparar 20 microlitros de tres microgramos por microlitro de muestra. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Para preparar el gel, agregue dos gramos de polvo de agarosa a 200 mililitros de tampón TAE en un vaso de precipitados de vidrio. Luego, calienta el vaso en un microondas para derretir la agarosa. A continuación, agregue un mililitro de 20%SDS hasta una concentración final de 0.1%Agite suavemente el vaso de precipitados.

A continuación, vierta la agarosa líquida en una losa de gel de 15 por 14 centímetros. Para eliminar las burbujas de aire, utilice una pipeta de un mililitro. Luego, coloque un peine de 20 pocillos encima del gel.

A continuación, agregue aproximadamente 60 microgramos de lisado de células enteras en el carril extremo derecho del gel. Haga funcionar el gel a 60 voltios durante aproximadamente cuatro horas utilizando el tampón TAE que contiene 0,1%SDS como tampón de ejecución. Para hacer funcionar el gel en la segunda dimensión, gire con cuidado el gel 90 grados en sentido contrario a las agujas del reloj.

Luego, haga funcionar el gel a 60 voltios durante unas cuatro horas. En un recipiente de 20 por 20 centímetros, agregue 500 mililitros de tampón de transferencia. Justo al lado del recipiente, prepare una pila de toallas de papel de cinco centímetros de altura.

Luego, remoje dos papeles de filtro, cada uno de 14 por 15 centímetros, en un tampón de transferencia y colóquelos encima de la pila de toallas de papel. Active una membrana de PVDF de 14 por 15 centímetros en metanol durante 30 segundos. Después de la activación, coloque la membrana encima de los papeles de filtro y use un rodillo para eliminar todas las burbujas.

La parte más importante de la transferencia es asegurarse de que no se formen burbujas de aire entre el gel y la membrana. Enjuague el gel con tampón de transferencia y colóquelo sobre la membrana. Estira las burbujas que se hayan formado.

A continuación, use una envoltura de plástico para cubrir el borde de las toallas de papel más cercano al recipiente del tampón de transferencia. Luego, remoje un trozo de papel de filtro con dimensiones de 15 por 35 centímetros en el tampón de transferencia. Coloque el papel de filtro de manera que un extremo cubra la parte superior del gel y el otro extremo esté en el recipiente del tampón de transferencia.

Cubra el recipiente con una envoltura de plástico y déjelo toda la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, enjuague la membrana con 50 mililitros de PBST en un recipiente de 20 por 20 centímetros. A continuación, agregue 20 mililitros de leche al 5% en PBST sobre la membrana.

Luego, deje la membrana en el balancín a temperatura ambiente durante 30 minutos para que se bloquee. Pipetear 10 microlitros de anticuerpo anti-MLKL de conejo en 20 mililitros de leche al 5% en PBST. Luego, agregue la mezcla de anticuerpos en la membrana.

Incubar la membrana en un balancín durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego, lave la membrana con 20 mililitros de PBST durante cinco minutos. Este lavado se repite cinco veces.

A continuación, pipetear cuatro microlitros de anticuerpo anti-conejo-HRP a 20 mililitros de leche al 5% en PBST. Agregue el anticuerpo en la membrana. Deje el recipiente con la membrana en el balancín a temperatura ambiente durante dos horas.

Después de dos horas, lave la membrana cinco veces en 20 mililitros de PBST durante cinco minutos cada una. Finalmente, agregue sustrato de quimioluminiscencia mejorada en la membrana. Luego, exponga la membrana a una película de rayos X de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Este estudio se realiza para demostrar la presencia de fibras similares a amiloide resistentes a SDS en lisados de células enteras obtenidas de células tratadas con factor de necrosis tumoral alfa. Aquí se muestra que RIPK1 y RIPK3 muestran patrones similares a los amiloides idénticos. Curiosamente, las fibras MLKL parecen heterogéneas con un patrón de migración diferente al de las demás.

Esta imagen muestra el posible patrón de migración de amiloide o fibras similares al amiloide. En la primera dimensión SDD-AGE, las fibras amiloides o similares a las amiloides exhiben un frotis característico. En esta imagen, las fibras migran de manera idéntica en la segunda carrera y exhiben un patrón diagonal de migración en la membrana a 45 grados.

Esto demuestra que las fibras no sufren degradación ni disociación durante el proceso de funcionamiento del gel. Por el contrario, si las fibras se disocian, hay rayas verticales por debajo de la línea diagonal, lo que indica una migración más rápida de las fibras más pequeñas durante la segunda electroforesis. Tanto estas fibras SDD-AGE de primera como de segunda dimensión muestran que las fibras MLKL no se disocian durante el proceso SDD-AGE y, de hecho, son distintas de las fibras RIPK1 y RIPK3.

En esta imagen, las fibras MLKL muestran un frotis característico durante la primera dimensión. Sin embargo, las mismas fibras muestran una línea diagonal afilada sin rayas verticales en la segunda dimensión SDD-AGE. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que todas las condiciones, como el voltaje y la longitud del recorrido, permanecen iguales entre la primera y la segunda dimensión para garantizar una línea nítida en un ángulo de 45 grados.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la extracción de la membrana y la repetición de la prueba con otros anticuerpos, para responder preguntas adicionales, como si la fibra contiene otras proteínas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo confirmar que no se está produciendo ninguna degradación o disociación de la amiloide o de las fibras similares a la amiloide durante la SDD-AGE tradicional.