Uso de dos electroforesis del Gel de la agarosa detergente semi desnaturalización Dimensional para confirmar la heterogeneidad de tamaño de las fibras amiloides o amiloide-como
26 de abril de 2018
Aquí utilizamos electroforesis en agarosa semi desnaturalización bidimensional para confirmar la presencia de fibras de amiloide como de tamaño heterogéneo y excluir la posibilidad de que la heterogeneidad de tamaño es debido a la disociación de las fibras amiloides en el gel proceso en ejecución.
El objetivo general de esta electroforesis bidimensional semidesnaturalizante en gel de agarosa es confirmar la heterogeneidad de tamaño de las fibras amiloides o similares a las amiloides observadas durante el SDD-AGE tradicional. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de agregación de aminoácidos o proteínas, como si la heterogeneidad de tamaño observada durante el SDD-AGE tradicional es el estado nativo de las fibras in vivo o el resultado de la degradación o disociación de proteínas durante la electroforesis en gel. La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar fácilmente en el laboratorio sin necesidad de equipos especializados.
No se requiere ningún equipo adicional más allá de lo que se utiliza en el SDD-AGE tradicional. Primero, siembre las células de cáncer de colon HT-29 productoras de amiloide en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros. Luego, incube las células durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.
Una vez que las células alcancen el 80% de confluencia, use solución salina tamponada con fosfato para lavar las células. A continuación, se añaden tres mililitros de tripsina a las células, y se incuba a 37 grados centígrados durante tres minutos. Después de que las células se hayan desprendido de la placa de cultivo, agregue 10 mililitros de medio de cultivo a la placa.
Luego, transfiera la suspensión de celdas a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, centrifugar la suspensión celular a 1.000 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, aspire el medio y vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de medio de cultivo.
Cuente las celdas usando un contador de celdas. Luego, deje dos placas de cultivo a 37 grados centígrados durante la noche. A continuación, agregue reactivos TSZ a una de las placas de cultivo como tratamiento.
Después de unas seis horas, recoja las células con un raspador de plástico. A continuación, transfiera la suspensión de la celda a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 1.000 veces g durante tres minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, lave el pellet de la célula dos veces con 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato helado y repita el proceso de centrifugación.
A continuación, aspire la solución de PBS y transfiera el pellet de la celda a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue 0,3 mililitros de tampón de lisis al pellet de la célula e incube en hielo durante 30 minutos. De nuevo, centrifugar a 20.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
El sobrenadante obtenido es el lisado de la célula entera. Al sobrenadante, añadir 4X SDD-AGE tampón para preparar 20 microlitros de tres microgramos por microlitro de muestra. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Para preparar el gel, agregue dos gramos de polvo de agarosa a 200 mililitros de tampón TAE en un vaso de precipitados de vidrio. Luego, calienta el vaso en un microondas para derretir la agarosa. A continuación, agregue un mililitro de 20%SDS hasta una concentración final de 0.1%Agite suavemente el vaso de precipitados.
A continuación, vierta la agarosa líquida en una losa de gel de 15 por 14 centímetros. Para eliminar las burbujas de aire, utilice una pipeta de un mililitro. Luego, coloque un peine de 20 pocillos encima del gel.
A continuación, agregue aproximadamente 60 microgramos de lisado de células enteras en el carril extremo derecho del gel. Haga funcionar el gel a 60 voltios durante aproximadamente cuatro horas utilizando el tampón TAE que contiene 0,1%SDS como tampón de ejecución. Para hacer funcionar el gel en la segunda dimensión, gire con cuidado el gel 90 grados en sentido contrario a las agujas del reloj.
Luego, haga funcionar el gel a 60 voltios durante unas cuatro horas. En un recipiente de 20 por 20 centímetros, agregue 500 mililitros de tampón de transferencia. Justo al lado del recipiente, prepare una pila de toallas de papel de cinco centímetros de altura.
Luego, remoje dos papeles de filtro, cada uno de 14 por 15 centímetros, en un tampón de transferencia y colóquelos encima de la pila de toallas de papel. Active una membrana de PVDF de 14 por 15 centímetros en metanol durante 30 segundos. Después de la activación, coloque la membrana encima de los papeles de filtro y use un rodillo para eliminar todas las burbujas.
La parte más importante de la transferencia es asegurarse de que no se formen burbujas de aire entre el gel y la membrana. Enjuague el gel con tampón de transferencia y colóquelo sobre la membrana. Estira las burbujas que se hayan formado.
A continuación, use una envoltura de plástico para cubrir el borde de las toallas de papel más cercano al recipiente del tampón de transferencia. Luego, remoje un trozo de papel de filtro con dimensiones de 15 por 35 centímetros en el tampón de transferencia. Coloque el papel de filtro de manera que un extremo cubra la parte superior del gel y el otro extremo esté en el recipiente del tampón de transferencia.
Cubra el recipiente con una envoltura de plástico y déjelo toda la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, enjuague la membrana con 50 mililitros de PBST en un recipiente de 20 por 20 centímetros. A continuación, agregue 20 mililitros de leche al 5% en PBST sobre la membrana.
Luego, deje la membrana en el balancín a temperatura ambiente durante 30 minutos para que se bloquee. Pipetear 10 microlitros de anticuerpo anti-MLKL de conejo en 20 mililitros de leche al 5% en PBST. Luego, agregue la mezcla de anticuerpos en la membrana.
Incubar la membrana en un balancín durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego, lave la membrana con 20 mililitros de PBST durante cinco minutos. Este lavado se repite cinco veces.
A continuación, pipetear cuatro microlitros de anticuerpo anti-conejo-HRP a 20 mililitros de leche al 5% en PBST. Agregue el anticuerpo en la membrana. Deje el recipiente con la membrana en el balancín a temperatura ambiente durante dos horas.
Después de dos horas, lave la membrana cinco veces en 20 mililitros de PBST durante cinco minutos cada una. Finalmente, agregue sustrato de quimioluminiscencia mejorada en la membrana. Luego, exponga la membrana a una película de rayos X de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Este estudio se realiza para demostrar la presencia de fibras similares a amiloide resistentes a SDS en lisados de células enteras obtenidas de células tratadas con factor de necrosis tumoral alfa. Aquí se muestra que RIPK1 y RIPK3 muestran patrones similares a los amiloides idénticos. Curiosamente, las fibras MLKL parecen heterogéneas con un patrón de migración diferente al de las demás.
Esta imagen muestra el posible patrón de migración de amiloide o fibras similares al amiloide. En la primera dimensión SDD-AGE, las fibras amiloides o similares a las amiloides exhiben un frotis característico. En esta imagen, las fibras migran de manera idéntica en la segunda carrera y exhiben un patrón diagonal de migración en la membrana a 45 grados.
Esto demuestra que las fibras no sufren degradación ni disociación durante el proceso de funcionamiento del gel. Por el contrario, si las fibras se disocian, hay rayas verticales por debajo de la línea diagonal, lo que indica una migración más rápida de las fibras más pequeñas durante la segunda electroforesis. Tanto estas fibras SDD-AGE de primera como de segunda dimensión muestran que las fibras MLKL no se disocian durante el proceso SDD-AGE y, de hecho, son distintas de las fibras RIPK1 y RIPK3.
En esta imagen, las fibras MLKL muestran un frotis característico durante la primera dimensión. Sin embargo, las mismas fibras muestran una línea diagonal afilada sin rayas verticales en la segunda dimensión SDD-AGE. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que todas las condiciones, como el voltaje y la longitud del recorrido, permanecen iguales entre la primera y la segunda dimensión para garantizar una línea nítida en un ángulo de 45 grados.
Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la extracción de la membrana y la repetición de la prueba con otros anticuerpos, para responder preguntas adicionales, como si la fibra contiene otras proteínas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo confirmar que no se está produciendo ninguna degradación o disociación de la amiloide o de las fibras similares a la amiloide durante la SDD-AGE tradicional.
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Resumen
Este estudio utiliza electroforesis en gel de agarosa semidesnaturalizante bidimensional para investigar la heterogeneidad de tamaño de las fibras similares a amiloide. El método tiene como objetivo determinar si las variaciones de tamaño observadas son inherentes a las fibras o un resultado de la disociación durante el proceso de electroforesis.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Agregación de proteínas
Antecedentes
- Las fibras similares a amiloide están asociadas con diversas enfermedades neurodegenerativas.
- Comprender su tamaño y estabilidad es crucial para elucidar su papel en los mecanismos de las enfermedades.
- Los métodos tradicionales pueden no reflejar con precisión el estado nativo de estas fibras.
- La heterogeneidad en el tamaño puede complicar la interpretación de los resultados experimentales.
Objetivo del estudio
- Confirmar la presencia de fibras de tipo amiloide de tamaño heterogéneo.
- Determinar si la heterogeneidad en el tamaño se debe a características nativas o a artefactos experimentales.
- Proporcionar un método confiable para estudiar fibras amiloides en el laboratorio.
Métodos Utilizados
- Electroforesis en gel de agarosa semidesnaturalizante bidimensional.
- Siembra de células de cáncer de colon HT-29 productoras de amiloide.
- Incubación de células a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.
- Análisis de los resultados del gel para evaluar el tamaño y la estabilidad de las fibras.
Resultados principales
- Confirmación de la heterogeneidad de tamaño en fibras similares a amiloide.
- Exclusión de la disociación como causa de las variaciones de tamaño observadas.
- Validación del método como un enfoque confiable para el estudio de fibras amiloides.
- Información sobre el estado nativo de las fibras amiloides in vivo.
Conclusiones
- La electroforesis en gel de agarosa semidesnaturalizante bidimensional es efectiva para estudiar fibras similares a amiloide.
- La heterogeneidad de tamaño es una característica de las fibras y no un artefacto del método.
- Esta técnica puede impulsar la investigación en los campos de amiloides y agregación de proteínas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Confirmar el estado nativo de las fibras similares a amiloide es fundamental para la validación de dianas en la investigación de enfermedades neurodegenerativas, donde las proteínas propensas a la agregación representan objetivos de alto valor pero también de alto riesgo. Este método bidimensional de SDD-AGE permite reducir los riesgos mecanicistas al distinguir la heterogeneidad real de las fibras de los artefactos inducidos por la electroforesis, aumentando así la confianza predictiva en los ensayos de interacción con la diana. Al permitir una evaluación directa y cualitativa de la estabilidad de las fibras en lisados celulares sin necesidad de purificación, este enfoque apoya los flujos de trabajo iniciales de descubrimiento y disminuye la dependencia de técnicas especializadas de bajo rendimiento, como la microscopía electrónica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas al verificar si las distribuciones observadas de tamaños de fibras reflejan estructuras nativas de amiloide in vivo.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas sin necesidad de purificación proteica, acelerando los plazos de paso de compuesto activo a candidato preclínico en programas con dianas propensas a la agregación.
- Confianza predictiva: Apoya la selección de carteras al reducir los riesgos asociados a dianas cuyo comportamiento de agregación podría malinterpretarse debido a artefactos metodológicos.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para cribados posteriores mediante la confirmación de la integridad de las fibras bajo condiciones desnaturalizantes.
- Resultado cuantitativo: Genera datos de patrones de migración que pueden correlacionarse con cambios inducidos por compuestos en la estabilidad o el tamaño de las fibras.
- Reutilización de plataforma: Aprovecha la infraestructura existente de SDD-AGE, sin requerir equipos especializados más allá de las herramientas estándar de electroforesis en gel y transferencia.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Se aplica a las vías asociadas a amiloide en oncología y neurodegeneración, donde la heterogeneidad de las fibras puede influir en la señalización o toxicidad.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos in vitro con la confirmación en estado nativo, apoyando la alineación de biomarcadores en modelos preclínicos.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Aclara si la variabilidad de las fibras proviene de la complejidad biológica o de artefactos experimentales, informando decisiones de avance o interrupción.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, especialmente para programas que tienen como objetivo las vías de agregación proteica en las que la estabilidad de las fibras influye en el mecanismo de acción.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al distinguir la heterogeneidad nativa de las fibras de los artefactos de disociación durante el análisis electroforético.
- Detección: Permite la estandarización de ensayos al confirmar que los patrones de fibras observados son reproducibles y no se deben a la disociación inducida por el gel.
- Análisis: Proporciona resultados cualitativos de migración (por ejemplo, patrones de manchado diagonal) que ayudan a comparar la estabilidad de las fibras en distintas condiciones o perturbaciones genéticas.
- Investigación Traducional: Conecta los fenotipos de agregación basados en células con la validación del estado nativo, facilitando el avance ajustado al riesgo en modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad de plataforma reutilizable en múltiples objetivos propensos a amiloide, reduciendo el desarrollo metodológico redundante.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación del blanco al confirmar que la heterogeneidad del tamaño de las fibras es biológicamente significativa.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización entre laboratorios al eliminar una fuente clave de variabilidad en el análisis de fibras.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al reducir los falsos positivos derivados de artefactos metodológicos en los ensayos de agregación.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en datos fiables de estabilidad de fibras.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de bioquímica de proteínas y electroforesis en gel.
- Depende de equipos estándar de electroforesis, agarosa, SDS, tampón TAE y materiales para el trasvase.
- Exige la estandarización entre equipos en voltaje, tiempo de corrida y manipulación de geles para garantizar patrones de migración diagonal reproducibles.
- La adaptación a agregados no amiloides puede requerir la optimización de las condiciones de lisis y electroforesis.
- Se limita a evaluaciones cualitativas; no sustituye a los métodos cuantitativos de determinación de tamaño cuando se necesita una medida precisa de masa.
