Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

膜片钳后单细胞多重反转录聚合酶链反应

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57627
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université
* These authors contributed equally

Summary

本协议描述了在膜片钳后执行单细胞多重反向转录聚合酶链反应所需的关键步骤和预防措施。该技术是一种简单有效的方法, 用于分析由膜片钳记录的单个细胞所确定的一组基因的表达谱。

Abstract

大脑皮层由多种细胞类型组成, 表现出多种形态、生理和分子特征。这种多样性阻碍了对这些细胞类型的识别和鉴定, 研究其特定功能的先决条件。本文介绍了多路单细胞反向转录聚合酶链反应 (rt-pcr) 协议, 它允许在切片的补丁钳记录后, 同时检测在单个细胞中的十个基因的表达。这种简单的方法可以进行形态学表征, 广泛适用于确定各种细胞类型的表型特征及其特定的细胞环境, 如血管附近。本协议的原则是用膜片钳技术记录一个细胞, 收获和反转转录其细胞质含量, 并通过多重 PCR 对预定义基因组的表达进行定性检测。它需要精心设计的 pcr 引物和细胞内贴钳解决方案兼容 rt-pcr。为了确保有选择和可靠的成绩单检测, 这项技术还需要适当的控制从细胞质采集到放大步骤。尽管这里讨论的预防措施必须严格遵循, 但几乎任何电生理学实验室都可以使用多重单细胞 rt-pcr 技术。

Introduction

大脑皮层包括多种细胞类型, 涉及各种生理过程。考虑到皮层细胞类型的形态学、生理和分子多样性, 它们的识别和表征是理解其特定功能的先决条件, 这是非常有挑战性的.1 ,2,3,4。

单细胞复合 rt-pcr 是基于膜片钳和 rt-pcr 技术相结合的。它可以同时探测30多个预定义基因在 electrophysiologically 识别细胞5中的表达。在记录吸管中加入神经元示踪剂进一步允许在组织化学揭示6、7、8、9后, 记录细胞的形态学特征,10. 基于对其表型性状5、9、10、11、12 的多元分析, 这是一种非常有用的神经类型分类方法. ,13,14。单细胞多重 rt-pcr 也适合于非神经细胞的特征, 如星形胶质细胞15,16,17, 几乎可以应用到每一个大脑结构18, 19、20、21、22、23和单元格类型, 假设它们可以在全单元格配置中进行记录。

这项技术是非常方便的识别细胞源和/或目标的传输系统7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, 特别是缺乏特定抗体时。它依赖于从视觉上识别出的细胞29的补丁钳录音, 因此也允许在特定的蜂窝环境8,15,16中定位细胞。此外, 由于大脑组织的细胞构筑被保存在脑切片中, 这种方法还可以研究具有神经元和非神经元元素的特征细胞的解剖关系7,8,18。

由于该技术受所收获细胞质数量和 RT 效率的限制, 在低拷贝数的情况下检测 mRNA 可能很难。虽然基于 RNaseq 技术的其他方法允许分析单个单元3、4、30、31的整个转录, 但它们需要高吞吐量的昂贵音序器不一定每个实验室都可以使用。由于单细胞复用 rt-pcr 技术采用终点 pcr 方法, 因此只需要广泛使用 thermocyclers。它可以很容易地开发在装有电生理设置的实验室, 不需要昂贵的设备。它可以在一天内提供一组预定义基因的定性分析。因此, 这种方法可以很容易地获得单个细胞的分子特征。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

所有使用动物的实验程序都严格按照法国的规定进行 (农村 R214/87 R214/130), 符合欧洲经济共同体 (86/609/欧洲经济共同体) 和法国国家宪章的道德准则。动物实验伦理学研究。所有议定书均经查尔斯·达尔文道德委员会批准, 并提交法国教育部和研究部 (批准 2015 061011367540)。IBPS 动物设施由法国当局 (A75-05-24) 认证。

1. 初步考虑

注: 为避免污染, 在进行单细胞 rt-pcr 后, 应遵循以下建议。

  1. 不要在实验室中使用含有感兴趣基因的质粒, 因为它们是潜在的污染源。
  2. 从凝胶电泳室预留一个实验台, 准备 PCRs。
  3. 奉献一套吸管和气溶胶抗性过滤技巧, 以操纵 DNA 和 RNA 的浓度低于 1 ng/µL。不要用这些来分析 PCR 产品。
  4. 始终使用 RNase 和 DNase 的产品, 戴上手套。
  5. 使用专用化学品准备内部膜片钳解决方案。不要使用刮刀, 而是称量纸张来称量粉末。
  6. 使用专用的 ph 电极和 ph 标准溶液, 因为它们可能是污染的源头 (例如, RNase)。
  7. 贮存硼硅酸盐玻璃毛细血管;20µL 长, 细腻灵活的小贴士;20µL 微;自制的推出器 (贴在10毫升注射器上的补丁钳夹吸管);500µL PCR 管;10µL 气溶胶抗滤小贴士;和在专用框中的细长永久性标记 (图 1)。

2. 底漆设计

注: 多路 rt-pcr 依赖两个放大步骤。在第一次 pcr 过程中, 所有感兴趣的基因都通过混合聚合 pcr 引物共同放大。为检测单细胞可靠的成绩单, 设计高效、选择性的 PCR 引物是必不可少的。使用嵌套 (内部) 引物的第二轮 PCR 提高了特异性和效率的放大。

  1. 检索 NCBI 参考序列数据库中感兴趣基因的被策划的 mRNA 序列32并且他们的相关的家庭 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)。
    1. 输入该基因的名称和感兴趣的种类作为查询, 并单击检索到的相关序列。
    2. 为了限制对基因编码序列的分析, 点击发送到(右上角), 选择编码序列和FASTA 核苷酸作为格式。然后单击 "创建文件" 并使用 ". nt" 文件扩展名保存 FASTA 序列。
  2. 使用金刚鹦鹉软件33 (多对齐构造 & 分析工作台) 或任何其他多对齐软件, 以确定同源区域。
    1. 点击文件 |新建项目...并选择DNA作为序列类型。要导入基因序列, 请选择序列 |导入序列...并加载一个 ". nt" 文件。对所有相关序列重复该过程。
    2. 单击并拖动 "示意图" 窗口中的所有序列以选择整个序列。
    3. 通过选择对齐方式搜索同源区域 |搜索块...(ctrl+ S)。选择搜索方法中的线段对重叠。调整配对分数截止到一个相对较高的值 (例如, 1000) 和最小 seqs. 每块到要对齐的序列总数, 然后单击开始。
    4. 在 "出现的搜索结果" 窗口中, 选择具有最高 MP 分数的结果, 然后单击 "链接"。如果找不到结果, 则减少每块的配对分数截止和/或最小 seqs.
    5. 为促进同源区域的可视化, 选择对齐方式 |底纹 |平均得分。
    6. 选择序列中未链接的部分, 然后重复步骤 2.2. 3–2.2 4 以潜在地确定其他与较低 MP 分数的同源区域。
    7. 要获得最具体的引物, 请选择具有最少序列同源性的区域。
  3. 获取所有拼接变体的序列并重复步骤 2.2. 1–2.2. 6。选择它们的共同区域以进行整体检测。考虑专用拼接变体分析20,34,35,36的替代卡带。
  4. 使用37基因组 (基本局部对准搜索工具) 对动物模型基因组的 mRNA 序列进行排列, 以确定基因的内含子-外显子结构 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。
    1. 通过单击鼠标并在 "输入查询序列" 部分中上载检索到的 FASTA 序列, 选择爆炸鼠标基因组。在程序选择中, 选择 "对高度相似的序列 (megablast)进行优化", 然后单击 "爆炸" 按钮。
    2. 在 "说明" 部分中, 选择具有最高标识的对齐方式 (最多100% 个)。确保它对应于感兴趣的基因, 如在对齐部分的特征中所示。
    3. 按查询起始位置在同一节中对齐方式进行排序, 以获得编码序列的外显子继承。记下所有命中的开始和结束位置, 这些点击大致对应于查询序列中内含子的位置 (图 2A)。
  5. 选择两个不同的外显子的意义和反义引物, 以区分容易 cDNA 的基因组 DNA (gDNA) 放大的基础上的大小标准 (图 2)。
    注: 当细胞核与细胞质一起收割时, gDNA 的扩增可能发生在低频。因此, 必须设计内含子 overspanning 底漆对 (图 2A)。在无内含子基因的情况下, 细胞核的收集是有问题的, 因为它可能导致潜在的混淆结果。为了解决这个问题, 包括一组引物, 旨在放大内含子序列, 以探测 gDNA25的存在。如果基因组控制是阳性的, 那么所有内含子的基因的结果必须被丢弃。
  6. 为了实现有效的放大, 选择引物生成 amplicons, 其长度理想地由200和400基对组成 (图 2)。
  7. 在多重 PCR 步骤中同时放大各种基因, 设计引物, 长度介于18和24核苷酸之间, 熔化温度 (Tm) 介于55和60摄氏度之间。
  8. 为了尽量减少二次结构的形成, 降低放大率, 选择具有最小发夹和双工长度的感觉和抗感底漆 (图 2B)。
  9. 使用相同的标准设计内部引物 (步骤 2.5–2.8)。
  10. 验证 PCR 引物的特异性, 方法是将引物对准感兴趣生物体的参考 RNA 序列数据库, 使用核苷酸爆炸。
    1. 在爆炸 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), 点击核苷酸爆炸。在输入查询序列中粘贴底漆的序列。
    2. 在 "选择搜索集" 部分中, 单击其他 (nr 等), 在数据库选项中选择参考 RNA 序列 (refseq_rna) , 并指定有机体 (例如, taxid:10090) ) 限制对所需物种的分析。
    3. 在节目选择选择优选为有些相似的序列 (blastn)。在 "算法参数" 部分中, 将单词大小降低到 7, 以增加获取命中的机会。
  11. 要设计选择性引物, 只保留那些序列至少有3不匹配的基因, 如果可能的话。
  12. 在相对较高浓度的淡化底漆 (例如, 200 µM), 以确保所有外部引物可以混合在一起, 最终浓度为1µM。

3. RT 试剂的制备

  1. 5x RT 混合: 在无 RNase 水中准备400µL 的工作 RT 混合溶液 (5x), 其中含有随机引物在25µM 和 dNTPs 2.5 毫米每。将此工作组合存储为20µL 整除数在500µL 管中。
  2. 20x Dithiothreitol: 在 RNase 水中准备1毫升的0.2 米, 并将其存储为50µL 整除数。
  3. 存储 2500 u 的 RNase 抑制剂 (40 u/µL) 和 1万 u 的逆转录酶 (RTase, 200 U/µL) 5 µL 整除数。
  4. 为确保 RT 试剂的最佳质量, 请将整除数保存在-80 摄氏度。使用它们多达10个细胞, 只有一天。

4. PCR 验证

  1. 通过对相对大量的总 RNA (通常为1µg) 进行反向转录, 制备基因, 从感兴趣的结构中提取38 。
    1. 不要使用吸管专用于单细胞 rt-pcr 的这些初步步骤, 但使用无 RNase 吸管。稀释总 RNA 到1µg/µL。
    2. 在500µL PCR 管, 添加1µL 稀释总 RNA 和8µL RNase 水。变性95摄氏度, 1 分钟, 冷却在冰管。
    3. 添加4µL 的 rt 5x 缓冲器, 由制造商提供, 4 µL 的 rt 混合液, 1 µL RTase, µL 抑制剂 1 RNase, 1 毫米 (见 200)。
    4. 轻拍管子, 旋转它, 在37摄氏度一夜之间孵化。
    5. 储存的基因在-80 摄氏度, 长达数年。制备基因稀释到1整除/µL 的总 rna 当量。
  2. 混合和稀释每一个底漆对在1µM 与吸管专用的单细胞 rt-pcr。使用20µL 的每个底漆组合为100µL PCRs。
  3. 在冰上, 准备每个底漆对一个预混料包含: 水 (q.s., 80 µL), 10 µL 10X 缓冲器, 1 µL 100x dNTPs (每50µM), 500–1,000 pg 的 cDNA 稀释在 1 ng/µL, 0.5 µL (2.5 u, 5 u/µL) 的 Taq 聚合酶。
  4. 使用 pcr 管紧密配合 pcr 机的水井, 以达到最佳温度控制。添加2滴 (~ 100 µL) 矿物油到预混料不接触壁或 PCR 管的上限。
  5. 为了尽量减少底漆-脂肪酸的形成, 通过将 PCR 管放在 thermocycler 预加热95摄氏度, 进行热启动。三十年代后, 迅速排出20µL 的底漆混合在油顶部。
  6. 在3分钟以后在95°c, 跑40个周期 (95 °c, 三十年代; 60 °c, 三十年代; 72 °c, 三十五年代) 后跟最后伸长步骤在72°c 为5分钟。
  7. 用琼脂糖凝胶电泳 (2%, 重量/体积) 分析每种 PCR 产品10µL39。如果一些 PCR 产品没有预期的大小, 重新设计其他底漆 (见第2节)。
    注意: 溴溴化铵是一种锂化学物质, 可以诱发 DNA 突变。使用前请咨询当地的安全办公室。操作时要戴手套。使用溴溴化 (10 毫克/毫升) 溶液的商业可用溶液, 而不是粉末, 以减少吸入的风险。同样, uv 光也会有害, 所以一定要戴上防紫外线防护眼镜或口罩。在专用于溴废料的容器中提取沾污的凝胶、小贴士、手套和缓冲器。
  8. 一旦所有底漆对被单独验证, 测试多路协议 (图 3)。
    1. 混合和稀释所有外部引物一起在1µM. 存储复合底漆混合在-20 摄氏度, 长达数周。
    2. 在冰上, 准备一个预混料: 水 (q.s., 80 µL), 10 µL 10X 缓冲器, 1 µL 100x dNTPs (每50µM), 500–1,000 pg 的基因稀释在 1 ng/µL, 0.5 µL (2.5 u, 5 u/µL) 的 Taq 聚合酶。
    3. 轻拍 PCR 管, 旋转, 并添加两滴 (100 µL) 矿物油。
    4. 按照步骤4.5 中的说明进行热启动, 20 µL 复合底漆组合。在95摄氏度后3分钟, 运行 20 PCR 周期相同的步骤4.6。
    5. 准备一些与分析的基因数量相同的 PCR 管。准备一个预混料, 在步骤 4.8.2, 但使用1µL 的第一 PCR 产品每基因作为模板。根据基因数量调整所有体积, 分析并考虑使用10% 的额外体积来补偿吹打错误。
    6. 轻轻摇动, 旋转管, 在每个 PCR 管中分配80µL 预混料, 并添加两滴 (100 µL) 每管矿物油不接触壁或管帽。
    7. 执行热启动 (请参见步骤 4.5), 将步骤4.2 中准备的内部底漆混合的20µL。运行 35 PCR 周期相同的步骤4.6。
    8. 采用琼脂糖凝胶电泳技术对二次 PCR 产物进行分析。确保每一秒的 PCR 产生一个扩增子的预期大小。在低效或非特异性放大的情况下, 重新设计新的引物 (步骤 2.5–2.12) 并验证它们 (步骤 4.2–4.8)。

5. 细胞内膜片钳溶液的制备和验证

注: 下面的协议描述了一种基于 K/葡萄糖酸盐的内部解决方案的制备和验证, 但几乎任何类型的补丁钳解决方案都可以使用, 只要它不妨碍 rt-pcr 的效率。佩戴手套是强制性的, 以获得一个无 RNase 的内部解决方案。

  1. 对于60毫升内贴钳记录解决方案, 准备即兴10毫升0.1 米的 KOH。
  2. 溶解11.4 毫克 EGTA (0.5 毫米决赛) 在0.9 毫升 0.1 M KOH。
  3. 添加40毫升 RNase 水, 溶解2.02 克葡萄糖酸盐 (144 毫米最终), 143 毫克的 HEPES (10 毫米决赛), 180 µL 1 米氯化镁2 (3 毫米决赛)。
  4. 将 pH 值调整为 7.2, 加6毫升0.1 米的 KOH。
  5. 调整渗透到 295 mOsm 13 毫升的 RNase 免费水。
  6. 由于内部解决方案也被用作反向转录的缓冲器, 所以小心控制 Mg2 +浓度。在内部溶液中加入氯化镁2 , 以在 RT 反应中达到2毫米的最终浓度, 以补偿较低的镁2 +浓度。
  7. 要在膜片钳录音后对收获的细胞进行标记, 请在上面描述的内部解决方案中添加2–5毫克/毫升 RNase biocytin (步骤 5.1–5.5)。
  8. 过滤器 (0.22 µm 孔径) 内部解决方案, 并存储在-80 °c 100–250µL 整除数。
  9. 为了验证单细胞 rt-pcr 的内部溶液的使用, 添加0.5 µL 的总 rna 稀释 1 ng/µL 到6µL 的补丁钳解决方案, 并留在板凳上约30分钟。
  10. 与2µL 微, 添加2µL 的 RT 混合, 0.5 µL 的20x 滴滴涕, 0.5 µL RNase 抑制剂, 0.5 µL RTase, 并在37°c 隔夜孵化。
  11. 旋转管子。冰上加水 (q.s., 80 µL), 10 µL 10X 缓冲器, 0.5 µL (2.5 u, 5 u/µL) 的 Taq 聚合酶。
  12. 使用一组经过验证的底漆 (步骤 4.4–4.6) 执行40周期的 PCR。
  13. 用琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产品 (见步骤 4.7), 验证其是否具有预期的大小。
    注: 省略了总 RNA 的0.5 µL, 并用0.5 µL RNase 的水代替它, 将确保内部解决方案不含 rna 和/或 DNA 污染物。

6. 急性切片制备

注: 本议定书描述了青少年 (即不到28天后) 雄性和雌性小鼠的切片程序。其他切割解决方案, 如蔗糖为基础的人工脑脊液 (aCSF) 也可用40。

  1. 准备2升的 aCSF 含 (毫米) 125 氯化钠, 2.5 氯化钾, 2 CaCl2, 1 氯化镁2, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 葡萄糖, 和15蔗糖。为减少谷氨酸在切片制备过程中的活性, 通过添加1毫米的 kynurenic 酸来制备切削液。
  2. 切片前, 准备一个解剖套件, 包括手术剪刀, 细虹膜剪刀, 两个铲子, 镊子, 一盘纸过滤器, 和氰胶水。
  3. 使用2/CO2 (95%/5%) 饱和的冰冷切削液, 并在-20 摄氏度冷却切割室。
  4. 麻醉老鼠用一条小纸巾浸泡在异氟醚上。2分钟后, 确保鼠标在深度麻醉下, 通过验证没有对爪捏的反应。
  5. 快速斩首鼠标。取出头皮, 打开头骨。仔细提取大脑, 把它放进一个小烧杯里, 里面装满了冰冷 (~ 4 °c), 用 O2/CO2进行了含氧的切割溶液。
  6. 从-20 °c 的条件下取出切割室, 用纸巾除去湿气。
  7. 仔细解剖大脑以隔离感兴趣的区域, 将其粘附在切割室中, 并加入 O2/CO2加氧的冰冷切割溶液。
  8. 用 vibratome 切割300µm 厚片。在室温下将其转移到充满氧切割溶液的静止腔内, 并允许它们至少恢复0.5 小时。

7. 单细胞 RT PCR 后贴片钳记录

  1. 定期清洗灌注系统与〜100毫升30% 小时2O2溶液, 并广泛冲洗与〜500毫升蒸馏水, 以避免细菌的增长, 因为它是被忽视的来源的 RNase 污染。
  2. 氯化的纤维, 每收获一天, 用一个充满浓缩漂白剂的补丁吸管。不要使用微填充的补丁吸管, 而是一个20µL 长, 罚款, 灵活的提示附加到一个1毫升注射器。然后, 用 RNase 水冲洗, 用气体除尘器将其烘干。
  3. 准备一小盒冰包含 5x RT 混合和20x 整除数。在台式冷却器中存储 RTase 和 RNase 抑制剂整除数-20 摄氏度。
  4. 将切片转移到记录室, 并在 aCSF 中灌注。
  5. 拉补丁吸管 (µm 开尖直径, 3–5 MΩ) 从硼硅酸盐玻璃戴手套, 并填补其中一个与 8 ul 内部解决方案。请记住, 吸管拉拔器的旋钮是 RNase 污染的源头。
  6. 戴上新手套时, 把吸管放进吸管夹, 不要用手指接触灯丝。
  7. 用正压接近贴片吸管, 并执行全细胞记录来表征目标细胞 (图 4)。
  8. 为了保留基因, 将整个单元格配置中的时间限制为20分钟41.
  9. 在录音的末尾, 准备一个500µL PCR 管填充2µL 5x RT 混合和0.5 µL 的20x 数字电视, 旋转它, 并储存在冰上。
  10. 应用温和的负压来收获细胞胞浆 (图 4)。视觉控制细胞的内容进入吸管, 同时保持密封紧密。
    1. 如果考虑一些内含子较少的基因, 尽量避免收集细胞核。在这种情况下, 总要包括一组引物, 目的是放大 gDNA 以探测基因组污染。
    2. 如果原子核靠近吸管尖端, 释放负压并将吸管移离细胞核。确保在新的吸管位置保存紧密封并重新启动以收集细胞质。
  11. 停止收割时, 没有更多的材料来和/或在失去紧密封。
  12. 轻轻地取出吸管, 形成外出斑块, 以限制细胞外碎片的污染 (图 4), 并有利于细胞膜的闭合, 随后进行组织化学分析。
  13. 请记住, 旋钮, 并联, 电脑键盘, 或电脑鼠标是潜在的 RNase 污染的来源。如果他们在录音中被触摸, 更换手套。
  14. 将吸管附着在推出器上, 并应用正压将其内容排出 PCR 管 (图 1)。
  15. 将吸管的尖端分解成 PCR 管, 以帮助收集其内容。
  16. 简要离心管, 添加0.5 µL 的 RNase 抑制剂和0.5 µL 的 RTase, 轻轻搅拌, 离心机, 并孵化过夜37摄氏度。
  17. 旋转管和存储它在-80 °c 长达几个月, 直到 PCR 分析。
  18. 通过添加水 (q.s.、80µL)、10µL 10x 缓冲器和0.5 µL (2.5 U) 的 Taq 聚合酶, 直接在含有10µL 的 RT 产品的管中执行第一放大步骤。然后, 按照步骤4.8 中描述的说明进行操作. 2–4.8. 8。

8. 记录细胞的组织化学染色 (可选)

  1. 在电生理记录下, 维持20分钟的氧 aCSF, 使 biocytin 在轴突和树枝状树中扩散。
  2. 将切片放在一个24井板井中, 并将其固定在4摄氏度, 在0.1 米磷酸缓冲液中用1毫升4% 多聚甲醛。
  3. 清洗切片4次, 每5分钟, 1 毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。
  4. 在同样的井中, permeabilize 和饱和的切片在1小时的室温与1毫升的 PBS 补充0.25% 海卫 X-100 和0.2% 明胶从冷水鱼皮肤 (PBS-GT)。
  5. 一夜间孵化与荧光标记亲和稀释在 1/400 250–500µL PBS GT。
  6. 清洗5次, 每5分钟, 与1毫升 PBS 和安装切片。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

图 3显示了多路 rt-pcr 的代表性验证。该协议旨在同时探索12种不同基因的表达。水泡谷氨酸转运 vGluT1 被作为一个积极的控制谷氨酸神经元42。以 GABA 合成酶 (GAD65 和 67)、神经肽 Y (NPY) 和生长抑素 (SOM) 为 GABAergic 中间神经元3、5、11的标记物。cyclooxygenase-2 酶 (COX-2) 被用作锥体细胞亚群3,16的标记。

选择了 Na+/K+ atp 酶的 ATP1α1-3 亚基和 ATP 敏感性钾离子通道的 Kir6.2 和 SUR1 亚基, 以评价神经元活性与代谢状态的关系43。由于 Kir6.2 是一个内含子较少的基因, SOM 内含子被包括作为基因组控制。该协议已经测试了 1 ng 从小鼠全脑提取的反向转录总 RNA, 这相当于20细胞44的转录。多重 PCR 产生了预期尺寸的 12 amplicons (图 3和表 1), 表明了该协议的灵敏度和效率。没有 RNA 执行的负控制没有产生扩增子 (数据未显示)。

一层 V 锥体神经元由它的大躯体和突出的顶端枝晶 (图 5A, 嵌入) 视觉地辨认。全细胞记录显示 V 型正常峰值神经元的典型电生理特性5,45,46 , 特别是低输入电阻, 持久的动作电位, 和发音尖峰频率适应 (图 5A)。该神经元的分子分析揭示了 vGluT1 的表达 (图 5B), 证实了其谷氨酸表型 42,46。这个神经元也表达了 SOM, ATP1α1, 和3亚基的 Na+/K+ atp 酶。Biocytin 标记的记录神经元证实了锥体形态学 (图 5D)。

从谷氨酸神经元的预测, 26 层 V 锥体细胞的分子分析揭示了 VGluT1 的表达, 但两个到处游荡都没有 (图 5C).中间神经元的标记很少被观察5,42,46。COX-2, 主要表达的第二层锥体细胞3,16, 没有发现在 V 层锥体细胞。ATP1α1和3亚基更频繁地被观察比 ATP1α2亚单位3。Kir6.2 和 SUR1 亚基在 V 层锥体神经元中很少被发现, 这与它们在上层3、43中的优先表达一致。注意不要获得细胞核, 导致罕见的检测 SOM 内含子 (3 26 细胞,即12%)。

Figure 1
图 1: 单细胞 rt-pcr 专用盒.贴片钳后为 RT PCR 保留的材料清单。(1) 硼硅酸盐玻璃毛细血管, (2) 20 µL 长, 细, 弹性小贴士, (3) 20 µL 微, (4) 国产推出器, (5) 500 µL PCR 管, (6) 10 µL 耐气溶胶过滤器提示, (7) 永久标记。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: PCR 底漆设计策略.(A) 将 cox 2 cDNA 编码序列与含有 COX 2 基因的小鼠染色体2序列对齐的示意图表示。外显子是由黑盒和内含子在 gDNA 由白色框表示。注意与 gDNA 内含子序列对应的 cDNA 中的空白。典型的坏和好的寡核苷酸代表的例子分别代表红色和绿色箭头。左右箭头表示正向和反向引物。(B) (a) 所示寡核苷酸的序列和次级结构。左、右面板分别表示发夹的自互补和自二聚体的形成。B1寡核苷酸既显示强发夹自互补和二聚体形成, 而B2寡核苷酸只显示二聚体形成。B3和B4寡核苷酸均无发夹自互补, 无二聚体形成;它们是内含子 overspanning (A), 被选为潜在的 PCR 引物 (见表 1)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 多重 pcr 的验证.从小鼠全脑中提取的总 RNA 1, 经过反向转录后再进行两轮 PCR 扩增。用琼脂糖凝胶电泳法分别在Φx174 消化 iii. 的 12 PCR 产物. 第二个 PCR 产品的大小 (bp) 预测的序列: 153 (vGluT1), 248 (GAD65)、255 (GAD67)、181 (COX 2)、220 (NPY)、146 (SOM)、183 (ATP1a1)、213 (ATP1a2)、128 (ATP1a3)、342 (Kir6.2)、211 (SUR1) 和 182 (SOMint)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 脑切片中的膜片钳捕获.一旦细胞被视觉识别, 记录吸管就会以正压接近, 以避免在吸管尖端的细胞碎片污染。注意这个神经元膜上的酒窝。正面压力然后被中断, 为了形成一个细胞连接的配置与 Gigaohm 紧的封印。简要吸力用于切换到全单元格配置。在记录结束时, 细胞质通过对吸管施加温和的负压, 同时保持紧密的密封。注意在收割过程中细胞体的收缩。记录吸管然后轻轻地撤回, 形成一个外出补丁, 这有利于细胞膜关闭后 biocytin 的启示, 并保存收获的材料在补丁吸管。从 Cauli 和 Lambolez47转载, 获得皇家化学学会的许可。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 层 V 皮层锥体细胞的特征.(a) 由100、-40、10、+ 60、+ 120 和 +500 pA (底迹) 引起的 V 型锥体细胞的膜电位反应。神经元在初始极化反应后显示弱电位偏转 (上部痕迹)。在对 supraliminal 退极化的反应中, 神经元释放出持久的动作电位, 缓慢发育后极化 (上痕)。接近饱和度时, 神经元以低频放电, 并表现出明显的适应 (上灰迹)。嵌入: 记录层 V 锥体神经元的红外图像。脑膜表面向上。刻度条:20 µm (B) 多路 rt-pcr 分析, 揭示 vGluT1、SOM、ATP1α1和 ATP1α3的表达。(C) 26 层 V 锥体细胞样本中的基因表达谱。vGluT1 在所有神经元中表达, 而 GAD65、GAD67 和 COX2 从未被检测到。很少观察到 NPY、som、Kir6.2、SUR1和 som。锥体细胞表达 ATP1α3, 1 亚基的 Na+/K+ atp 酶, 并 ATP1α2较小的程度。(D) 显示 (A) 中记录的神经元 biocytin 标记的共焦图像的最大强度投影。请单击此处查看此图的较大版本.

基因/基因库数 外底漆 大小 (bp) 内部底漆 大小 (bp)
vGlut1
NM_182993		 感觉,-113 259 感觉,-54 153
GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC ATTCGCAGCCAACAGGGTCT
反感, 126 反感, 79
CCAGCCGACTCCGTTCTAAG TGGCAAGCAGGGTATGTGAC
GAD65
NM_008078		 感觉, 99 375 感觉, 219 248
CCAAAAGTTCACGGGCGG CACCTGCGACCAAAAACCCT
反感, 454 反感, 447
TCCTCCAGATTTTGCGGTTG GATTTTGCGGTTGGTCTGCC
GAD67
NM_008077		 感觉, 529 598 感觉, 801 255
TACGGGGTTCGCACAGGTC CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC
反感, 1109 反感, 1034
CCCAGGCAGCATCCACAT AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC
考克斯2
NM_011198		 感觉, 199 268 感觉, 265 181
CTGAAGCCCACCCCAAACAC AACAACATCCCCTTCCTGCG
反感, 445 反感, 426
CCTTATTTCCCTTCACACCCAT TGGGAGTTGGGCAGTCATCT
Npy
NM_023456		 感觉, 16 294 感觉, 38 220
CGAATGGGGCTGTGTGGA CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT
反感, 286 反感, 236
AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA
Som
NM_009215		 感觉, 43 208 感觉, 75 146
ATCGTCCTGGCTTTGGGC GCCCTCGGACCCCAGACT
反感, 231 反感, 203
GCCTCATCTCGTCCTGCTCA GCAAATCCTCGGGCTCCA
ATP1α1
NM_144900 		感觉, 1287 288 感觉, 1329 183
CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA TAAGCGGGCAGTAGCGGG
反感, 1556 反感, 1492
CCGTGGAGAAGGATGGAGC AGGTGTTTGGGCTCAGATGC
ATP1α2
NM_178405		 感觉, 1392 268 感觉, 1430 213
AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG AAATCCCCTTCAACTCCACCA
反感, 1640 反感, 1623
ACAGAAGCCCAGCACTCGTT GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC
ATP1α3
NM_144921		 感觉, 127 216 感觉, 158 128
CGGAAATACAATACTGACTGCGTG TGACACACAGTAAAGCCCAGGA
反感, 324 反感, 264
GTCATCCTCCGTCCCTGCC CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA
Kir6。2
NM_010602		 感觉, 306 431 感觉, 339 342
CGGAGAGGGCACCAATGT CATCCACTCCTTTTCATCTGCC
反感, 719 反感, 663
CACCCACGCCATTCTCCA TCGGGGCTGGTGGTCTTG
SUR1
NM_011510		 感觉, 1867 385 感觉, 2041 211
CAGTGTGCCCCCCGAGAG ATCATCGGAGGCTTCTTCACC
反感, 2231 反感, 2231
GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG
SOMint
X51468		 感觉, 8 240 感觉, 16 182
CTGTCCCCCTTACGAATCCC CTTACGAATCCCCCAGCCTT
反感, 228 反感, 178
CCAGCACCAGGGATAGAGCC TTGAAAGCCAGGGAGGAACT

表1。第一和第二 PCR 引物序列.每个 PCR 引物的位置和他们的序列从 5 ' 到 3 '。除了生长抑素内含子外, 位置1对应于每个基因的起始密码子的第一基。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

单细胞多重 rt-pcr 后贴片钳可以同时可靠地探测30多个基因在 electrophysiologically 识别细胞5的表达。在单细胞水平上分析基因表达需要高效的 PCR 引物。最限制的步骤之一是单元格内容的集合。其效率取决于贴片吸管尖端的直径, 它必须尽可能大, 同时匹配的细胞大小。吸管与1-2 µm 开尖直径被证明是适合大多数神经元类型。同样重要的是要确保只收集细胞的内容, 而不是周围的组织。这是通过控制 electrophysiologically 在收割过程中保持密封紧密而达到的。在吸管提取过程中形成外出斑块, 进一步保护从细胞碎片中收获的细胞质。单细胞多重 rt-pcr 的成功率也取决于所研究的细胞类型的基因丰度。例如, 用星形胶质细胞获得的收益率在相对较低的3基因, 通常比用神经元获得的结果要低, 因此需要增加样本大小15,16。在48管中效率低的反向转录是单细胞多重 rt-pcr 的限制性反应。因此, 重要的是使用优质的试剂, 储存他们作为整除数在-80 摄氏度, 并使用它们只在一天。最后, RTase 的 DNA 聚合酶活性往往是引物-二聚体形成的一个被忽视的来源。为了解决这个问题, 使用底漆进行热启动对提高放大效率至关重要。此外, 这将减少 RTase 对 Taq DNA 聚合酶活性的抑制作用49。

单细胞复合 rt-pcr 技术具有很强的通用性。已广泛应用于啮齿动物10、11、13、19、20、34、50、51、52 ,53,54 , 但可以适应几乎所有的动物模型和基因假设, 组织和基因序列是可用的。各种补丁钳解决方案可以使用, 只要它们不干扰 rt-pcr 的无细胞检测。例如, 基于 K+或 Cs+阳离子的内部解决方案已成功使用6、36、41、55。

经典的假阴性结果来源于 RNase 污染的贴片吸管灯丝和/或内部膜片钳解决方案。仔细氯化灯丝并验证内部解决方案通常解决这个问题。当基因在低单细胞水平上表达时, 也会出现假阴性结果, 因为只有一部分细胞质被收获。通过使用较大的吸管和/或减少全细胞记录的时间, 可以提高采收质量。收获质量可以评估, 包括一个已知的基因表达在低水平的单细胞20。假阳性结果可能发生与不良组织质量, 其中的数量污染细胞碎片是高。测试碎片的存在是通过在切片中插入一个贴片吸管而不进行任何密封, 并在去除吸管之前释放正压。然后通过多重 rt-pcr42对 amplifiable 材料的存在进行了探讨。烷化贴片吸管也被用来减少细胞外污染物的收集56。单细胞 PCR 是一种非常敏感的技术, 可以检测到几乎没有单拷贝的双链 DNA57。在无内含子基因的情况下, 细胞核中的 gDNA 也会产生假阳性。在收割过程中, 通过将吸管从细胞核中移开, 避免 gDNA 的收集有助于解决这个问题。通过放大内含子序列25, 可以可靠地探测到 gDNA 的存在。

通过 RT PCR 检测 mRNA 分子变得不可靠, 在10拷贝44, 大概是因为低效率的 RTase48, 并可能导致一个下检测低丰度成绩单26,42。这在无内含子基因的情况下可能会有问题。事实上, 避免核的收获减少了可以收集的细胞质的数量, 因此检测灵敏度。单细胞 rt-pcr 与 biocytin 标记结合后, 需要保持细胞的形状尽可能多 (图 3)。不可避免地, 这减少了可收集的材料量, 从而降低了成功率。细胞质的收集和细胞形态的保存之间的妥协是强制性的。

多路单细胞 rt-pcr 数据不是定量的, 因为他们只提供信息, 基因是否存在或没有在收集的材料。然而, 由于上述检测限制, 在种群水平上的检测量可以反映出单细胞水平的基因丰度。替代方法允许生成更多的定量数据, 但其特定放大策略 (即同源基因或 RT qPCR 的相对量化) 所施加的技术限制, 在很大程度上限制了可以同时分析的基因41,53,55,58,59,60,61,62,63 ,64,65,66。最近结合补丁钳录音和单细胞 RNaseq, 称为补丁序列30,31, 允许定量 transcriptomic 分析 electrophysiologically 特征的细胞。这是一种新的和有希望的方法, 但它需要访问高通量的音序器, 所生成的数据需要耗时的分析。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢亚历山大 Mourot 博士对手稿的评论。这项工作得到了 la 研究所 (2011 MALZ 003 01) 赠款的支持;ANR-15-CE16-0010 和 ANR-17-CE37-0010-03), 大人物是支持的奖学金从研究所阿尔茨海默氏症。我们感谢 IBPS 的动物设施 (巴黎, 法国)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series - 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series - 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series - 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13 (2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

Tags

神经科学 问题 136 基因表达谱 神经元 星形胶质细胞 脑切片 全细胞构型 嵌套聚合酶链反应 (PCR)
膜片钳后单细胞多重反转录聚合酶链反应
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet,… More

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter