Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Eencellige Multiplex omgekeerde transcriptie Polymerase-kettingreactie na Patch-clamp

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57627
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft de kritische stappen en voorzorgsmaatregelen moeten uitvoeren van eencellige multiplex omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie na patch-clamp. Deze techniek is een eenvoudige en effectieve methode voor het analyseren van het profiel van de expressie van een vooraf vastgesteld samenstel van genen van een enkele cel gekenmerkt door patch-clamp recordings.

Abstract

De cerebrale cortex bestaat uit vele celtypes verschillende morfologische, fysiologische en moleculaire kenmerken vertonen. Deze diversiteit belemmert gemakkelijke identificatie en karakterisering van deze soorten cellen, vereisten voor het bestuderen van hun specifieke taken. Dit artikel beschrijft het multiplex eencellige omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) protocol, waardoor, na patch-clamp opnemen in plakjes, de expressie van tientallen genen in één cel tegelijk te detecteren. Deze eenvoudige methode kan worden geïmplementeerd met morfologische karakterisering en is breed inzetbaar voor het bepalen van de fenotypische kenmerken van verschillende celtypes en hun bijzondere cellulaire omgeving, zoals in de nabijheid van bloedvaten. Het principe van dit protocol is graag een cel met de patch-clamp techniek, oogst en reverse transcriberen cytoplasmatische inhoudelijk en kwalitatief detecteren de uitdrukking van een vooraf gedefinieerde set genen door multiplex PCR. Het vereist een zorgvuldige ontwerp van PCR inleidingen en intracellulaire patch-clamp oplossing compatibel met RT-PCR. Om ervoor te zorgen een selectieve en betrouwbare transcript vereist detectie, deze techniek ook adequate controle van het cytoplasma oogsten naar versterking stappen. Hoewel voorzorgsmaatregelen hier besproken moeten strikt worden gevolgd, kan vrijwel elke elektrofysiologische laboratorium de multiplex eencellige RT-PCR-techniek gebruiken.

Introduction

De cerebrale cortex bestaat uit vele celtypes die betrokken zijn bij verschillende fysiologische processen. Hun identificatie en karakterisering, een voorwaarde is voor het begrip van hun specifieke functies, kunnen zeer uitdagend gelet op de grote morfologische, fysiologische en moleculaire diversiteit die kenmerkend corticale cel typen1 ,2,3,4.

Eencellige multiplex RT-PCR is gebaseerd op de combinatie van patch-clamp en RT-PCR technieken. Het kan tegelijkertijd de expressie van meer dan 30 vooraf gedefinieerde genen in electrophysiologically geïdentificeerde cellen5sonde. De opname van een neuronale tracer in de opname pipet verder kan de morfologische karakterisering van de opgenomen cellen na histochemische openbaring6,7,8,9, 10. het is een zeer nuttige techniek voor de indeling van neuronale typen op basis van multivariate analyse van hun fenotypische eigenschappen5,9,10,11,12 ,13,14. Eencellige multiplex RT-PCR is ook geschikt voor de karakterisatie van de non-neuronale cellen zoals astrocyten15,16,17, en vrijwel kan worden toegepast op elke hersenen structuur18, 19,20,21,22,23 en cel type, ervan uitgaande dat ze kunnen worden opgenomen in de configuratie van de gehele-cel.

Deze techniek is erg handig voor de identificatie van de cellulaire bronnen en/of doelstellingen van transmissie systemen7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, vooral wanneer specifieke antilichamen ontbreken. Het steunt op patch-clamp opnames van visueel geïdentificeerde cellen29, en dus maakt het ook mogelijk de doelgerichtheid van cellen in een specifieke cellulaire omgeving8,15,16. Aangezien de cytoarchitecture van hersenweefsel bewaard in de hersenen segmenten gebleven is, maakt deze aanpak ook bovendien studie van de anatomische relaties van de gekarakteriseerd cellen met neuronale en non-neuronale elements7,8 , 18.

Omdat deze techniek beperkt door de hoeveelheid geoogste cytoplasma en de efficiëntie van de RT is, kan de detectie van mRNA uitgedrukt op lage exemplaaraantal moeilijk zijn. Hoewel andere benaderingen gebaseerd op RNaseq technologie toestaan om te analyseren de hele transcriptome van afzonderlijke cellen3,4,30,31, ze nodig hebben high-throughput dure sequencers niet noodzakelijkerwijs beschikbaar voor elk laboratorium. Aangezien de eencellige multiplex RT-PCR techniek eindpunt PCR gebruikt, vereist het alleen verkrijgbaar thermocyclers. Het kan gemakkelijk worden ontwikkeld in laboratoria die toegerust zijn met elektrofysiologische set-ups en vereist geen dure apparatuur. Het kan bieden, binnen een dag, een kwalitatieve analyse van de uitdrukking van een vooraf gedefinieerde set genen. Dus, deze aanpak biedt een gemakkelijke toegang tot de moleculaire karakterisering van afzonderlijke cellen op een snelle manier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele procedures waarbij dieren werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Franse regelgeving (Code Rural R214/87 naar R214/130) en gelijkvormig aan de ethische richtlijnen van de Europese Economische Gemeenschap (86/609/EEG) én de Franse nationale Handvest over de ethiek van dierproeven. Alle protocollen werden goedgekeurd door de ethische commissie van Charles Darwin en voorgelegd aan het Franse Ministerie van onderwijs en onderzoek (goedkeuring 2015 061011367540). De IBPS dier faciliteit is geaccrediteerd door de Franse autoriteiten (A75-05-24).

1. voorlopige overwegingen

Opmerking: Om te voorkomen dat verontreinigingen, voldoen aan de volgende aanbevelingen vóór onderneming eencellige RT-PCR na patch-clamp.

  1. Gebruik geen plasmiden waarop genen van belang in het laboratorium als ze een potentiële bron van besmetting.
  2. Reserveren van een lab-Bank uit de buurt van de kamer van de Elektroforese van het gel te bereiden PCRs.
  3. Een set van pipetten en resistente aërosol filter tips voor het manipuleren van DNA en RNA bij concentraties lager dan 1 ng/µL wijden. Gebruik nooit deze te analyseren van PCR producten.
  4. Gebruik RNase - en DNase-vrije producten altijd op en draag handschoenen.
  5. Gebruik speciale chemische stoffen voor het opstellen van interne patch-clamp oplossingen. Gebruik nooit een spatel maar eerder met een gewicht van papier om wegen van poeders.
  6. Gebruik een speciale pH elektrode en pH-standaardoplossingen, als ze kunnen een bron van verontreiniging (b.v., RNase).
  7. Winkel borosilicaatglas haarvaten; 20 µL lang, fijn en flexibel tips; een 20 µL micropipet; een zelfgemaakte lijnzaadkoek (patch-clamp Pipetteer houder gekoppeld aan een 10 mL spuit); 500 µL PCR buizen; 10 µL aërosol resistente filter tips; en dun permanente markeringen in een speciale doos (Figuur 1).

2. primer Design

Opmerking: Multiplex RT-PCR berust op twee stappen van de versterking. Tijdens de eerste PCR, zijn alle van de genen van belang mede versterkt door mengen samen alle PCR inleidingen. U wilt opsporen betrouwbaar afschriften van afzonderlijke cellen, is het essentieel om efficiënte en selectieve PCR inleidingen ontwerpen. Het gebruik van genestelde inleidingen van de (interne) voor de tweede ronde van PCR verbetert zowel de specificiteit en de efficiency van de versterking.

  1. Ophalen van de curator mRNA opeenvolgingen van de genen van belang in de NCBI reeks referentiedatabank32 , alsmede die van verwante familieleden (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. Typ de naam van de gene(s) en de soorten van belang als een query en klik op de opgehaalde relevante volgorde.
    2. Ter beperking van de analyse in de codering reeks van de gene(s), klik op verzenden (rechter bovenhoek) en selecteer codering sequenties en FASTA Nucleotide als formaat. Vervolgens klikt u op Bestand maken en opslaan van de volgorde van de FASTA met extensie ".nt".
  2. MACAW software33 (meerdere uitlijning bouw & analyse Workbench) of andere meerdere uitlijning software gebruiken om te bepalen van de regio's van de homologie.
    1. Klik op bestand | Nieuw Project... en selecteer DNA als het type van de reeks. Als u wilt importeren het gensequenties, selecteer volgorde | Importeren van reeks... en een ".nt"-bestand laden. Herhaal de procedure voor alle verwante sequenties.
    2. Klik en sleep alle sequenties in de schematische venster te selecteren van de hele sequenties.
    3. Zoeken van de regio's van de homologie door te selecteren uitlijning | Zoek blokken... (CTRL + S). Selecteer Segment paar overlappen in Zoekmethode. Passen de Pairwise score cutoff op een relatief hoge waarde (bijvoorbeeld1.000) en de Min. seqs. per blok aan het totaal aantal sequenties uitlijnen en klik op starten.
    4. In het opkomende venster Zoekresultaat , selecteer de resultaten met de hoogste MP-score en klik op de Link. Als er geen resultaat is gevonden, verminderen de Pairwise score cutoff en/of de Min. seqs. per blok.
    5. Om te vergemakkelijken de visualisatie van homologe gebieden, selecteer uitlijning | Arcering | Score betekent.
    6. Selecteer niet-gekoppelde onderdelen van de sequenties en herhaalt u de stappen 2.2.3–2.2.4 om te kunnen bepalen andere regio's van de homologie met een lagere MP-score.
    7. Voor het verkrijgen van de meest specifieke primers, selecteer de regio's met de minste reeks homologie.
  3. Halen van de sequenties van alle splice varianten en herhaalt u stappen 2.2.1–2.2.6. Selecteer hun gemeenschappelijke gebieden voor een algemene detectie. Overweeg alternatieve cassettes voor speciale splice varianten analyses20,34,35,,36.
  4. Hiermee lijnt u de mRNA opeenvolgingen in het genoom van de diermodel BLAST37 genoom (Basic Local Alignment Search Tool) gebruiken om te bepalen van de intron-exon-structuur van de genen (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. Het genoom van de muis BLAST selecteren door te klikken op de muis en het uploaden van de volgorde van de opgehaalde FASTA in de sectie van de Query-reeks invoeren . In de Programma selectie, selecteer optimaliseren voor zeer soortgelijk sequenties (megablast)en klik op de knop BLAST .
    2. Selecteer in de sectie beschrijvingen de uitlijning met de hoogste identiteit (tot 100%). Zorg ervoor dat het overeenkomt met het gen van belang zoals aangegeven in Eigenschappen van de sectie uitlijning .
    3. De uitlijning door Query beginpositie in dezelfde sectie te verkrijgen van de exons opeenvolging van de codering volgorde sorteren. Opmerking de begin- en eindposities van alle hits die ruwweg met de positie van de introns op de query-reeks (figuur 2A corresponderen).
  5. Selecteer twee verschillende exons voor de betekenis en antisense inleidingen te onderscheiden gemakkelijk cDNA van versterking van de genomic DNA (gDNA) op basis van een groottecriterium (Figuur 2).
    Opmerking: De amplificatie van gDNA kan optreden bij een lage frequentie wanneer de kern wordt geoogst met het cytoplasma. Het is dus essentieel voor het ontwerpen van intron overspanning primerparen (figuur 2A). In het geval van intron-minder genen is de collectie van de kern problematisch aangezien het tot potentieel verstorende resultaten kan leiden. Om dit probleem te verhelpen, omvatten een reeks inleidingen gericht op het sturen van een intronic reeks sonde voor de aanwezigheid van gDNA25. Wanneer de genomic controle positief is, moeten de resultaten voor alle intron-minder genen worden verwijderd.
  6. Selecteer om een efficiënte versterking, inleidingen waarbij genereren met een lengte ideaal bestaat tussen 200 en 400 basenparen (Figuur 2).
  7. Om te vullen gelijktijdig verschillende cDNAs tijdens de multiplex PCR stap, inleidingen met een lengte tussen de 18 en 24 nucleotiden en een smelttemperatuur (Tm) ontwerpen tussen 55 en 60 ° C.
  8. Selecteer om te minimaliseren van de vorming van secondaire structuren, die de opbrengst amplificatie verminderen, verstand en anti-zin inleidingen met minimale haarspeld en dubbelzijdig lengtes (figuur 2B).
  9. Interne inleidingen met behulp van dezelfde criteria (in stappen van 2,5-2,8) te ontwerpen.
  10. Controleer of de specificiteit van de PCR inleidingen door aanpassing van de inleidingen op de referentiedatabank voor het opeenvolging van RNA van het organisme van belang met behulp van een nucleotide BLAST.
    1. In BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), klik op nucleotide BLAST. Plak de volgorde van een primer in de Query-reeks invoeren.
    2. In de sectie Kies Search Set Klik op anderen (nr etc.), selecteer referentie RNA-sequenties (refseq_rna) in de Database optie en geef het organisme (bijvoorbeeld Mus musculus (taxid:10090) ) om de analyse te beperken tot de gewenste soorten.
    3. Selecteer optimaliseren voor enigszins vergelijkbaar sequenties (blastn)in Programma selectie . In de sectie parameters van het algoritme het woord grootte tot 7 te verhogen de kans om het verkrijgen van de treffers te verkleinen.
  11. Om selectieve inleidingen ontwerpen, houden alleen die waarvan reeks heeft ten minste 3 incongruenties met ongewenste cDNAs indien mogelijk.
  12. Bestel ontzout inleidingen op een relatief hoge concentratie (b.v., 200 µM) om ervoor te zorgen dat alle externe inleidingen kunnen met elkaar vermengd worden op een eindconcentratie van 1 µM.

3. voorbereiding van de RT reagentia

  1. 5 x RT-mix: bereiden in RNase-gratis water 400 µL van de werkoplossing RT mix (5 x) met willekeurige primers op 25 µM en dNTPs bij elke 2.5 mM. Deze mix van werken als 20 µL aliquots in 500 µL buizen worden opgeslagen.
  2. 20 x Dithiothreitol (DTT): 1 mL 0,2 M DTT in RNase-vrij water bereiden en op te slaan als 50 µL aliquots.
  3. 2.500 U van RNase remmer (40 U/µL) en 10.000 U van reverse-transcriptase (RTase, 200 U/µL) opslaan als 5 µL aliquots.
  4. Om te zorgen voor een optimale kwaliteit van de RT-reagentia, slaan de aliquots bij-80 ° C. Gebruik ze voor maximaal 10 cellen en alleen voor één dag.

4. PCR validatie

  1. CDNAs voor te bereiden door het doen van een omgekeerde transcriptie van een relatief grote hoeveelheid totaal RNA (meestal 1 µg) geëxtraheerd38 uit de structuur van belang.
    1. Gebruik niet de pipetten gewijd aan single cell RT-PCR voor deze voorbereidende stappen maar gebruiken de pipetten RNase-gratis. Verdun totaal RNA naar 1 µg/µL.
    2. In een 500 µL PCR buis, voeg 1 µL van verdunde totaal RNA en 8 µL van RNase-gratis water. Denatureren bij 95 ° C gedurende 1 min en afkoelen de buis op ijs.
    3. 4 µL van RT 5 x buffer geleverd door de fabrikant, 4 µL van RT mix oplossing, 1 µL van RTase, 1 µL van RNase remmer en 1 µL van 200 mM DTT toevoegen (zie paragraaf 3).
    4. Flick van de buis, toeren, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
    5. Bewaar de cDNAs bij-80 ° C gedurende maximaal enkele jaren. Bereiden een aliquoot gedeelte van het cDNAs wordt verdund tot 1 ng/µL van totale RNAs equivalenten.
  2. Mengen en verdunnen van elk paar primer op 1 µM met de pipetten gewijd aan eencellige RT-PCR. Gebruik 20 µL van elke primer mix voor 100 µL PCRs.
  3. Op het ijs, bereiden voor elk paar primer een premix met: water (q.s., 80 µL), 10 µL van 10 X buffer, 1 µL van 100 x dNTPs (50 µM elk), 500 – 1000 pg van cDNA verdund op 1 ng/µL en 0,5 µL (2.5 U, 5 U/µL) van Taq polymerase.
  4. Het gebruik van PCR-buizen die strak de putten van de PCR-machine voor een optimale temperatuurregeling passen. Voeg 2 druppels (~ 100 µL) van minerale olie aan de premix zonder aan te raken van de muur of het GLB van de PCR-buis.
  5. Een warme start uitvoeren door het plaatsen van de PCR te minimaliseren van de vorming van inleidingsdimeer buizen in de thermocycler pre-water verwarmd bij 95 ° C. Na 30 s, 20 µL van het mengsel van de primer op de top van de olie snel te verdrijven.
  6. Na 3 min bij 95 ° C, 40 cycli worden uitgevoerd (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) gevolgd door een definitieve rek stap bij 72 ° C gedurende 5 minuten.
  7. Analyseren 10 µL van elke PCR producten door agarose gel elektroforese (2%, gewicht/volume)39. Als sommige PCR producten niet de verwachte grootte, andere inleidingen hoeft (zie sectie 2) opnieuw te ontwerpen.
    Let op: Ethidiumbromide is een intercalating chemische stof die DNA mutaties kan veroorzaken. Raadpleeg de lokale veiligheid kantoor alvorens het te gebruiken. Draag altijd handschoenen wanneer het manipuleren. Gebruik een commercieel beschikbare oplossing van ethidium bromide (10 mg/mL) oplossing in plaats van poeder om te minimaliseren van het risico van inademing. Ook kan UV-licht schadelijk zijn, dus zorg ervoor dat UV bescherming veiligheidsbril of een masker dragen. Trekken bevuilde gels, tips, handschoenen en buffer in containers gewijd aan ethidium afval.
  8. Zodra alle primerparen individueel zijn gevalideerd, test het multiplex protocol (Figuur 3).
    1. Mengen en verdunnen van alle externe inleidingen samen in 1 µM. winkel de multiplex inleidingen Meng bij-20 ° C voor maximaal enkele weken.
    2. Op het ijs, bereiden een premix met: water (q.s., 80 µL), 10 µL van 10 X buffer, 1 µL van 100 x dNTPs (50 µM van elk), 500 – 1000 pg van cDNAs verdund 1 ng/µL, en 0,5 µL (2.5 U, 5 U/µL) van Taq polymerase.
    3. Flick van de PCR-buis, draai het en Voeg twee druppels (~ 100 µL) van minerale olie.
    4. Voert een warme start, zoals beschreven in stap 4.5 met 20 µL van multiplex primer mix. Na 3 min bij 95 ° C, 20 PCR cycli identiek aan die van stap 4.6 worden uitgevoerd.
    5. Bereiden een aantal PCR buizen identiek is aan het aantal genen te analyseren. Bereiden een premix zoals in stap 4.8.2, maar 1 µL van het eerste PCR product per gen als sjabloon gebruiken. Pas alle volumes volgens het aantal genen te analyseren en te overwegen om 10% van extra volume te compenseren pipetting fouten.
    6. Schud voorzichtig, draai de buis 80 µL van het voormengsel in elke buis PCR verzending en Voeg twee druppels (~ 100 µL) van minerale olie per buis zonder aan te raken van de muur of het plafond van de buizen.
    7. Uitvoeren van een warme start (zie stap 4.5) door uitzetting 20 µL van interne primer mix bereid in stap 4.2. 35 PCR cycli identiek aan stap 4.6 uitvoeren
    8. Het analyseren van de tweede PCR producten door agarose gelelektroforese. Zorg ervoor dat elke tweede PCR een amplicon van de verwachte grootte genereert. In het geval van inefficiënte of niet-specifieke amplifications, nieuwe inleidingen (in stappen van 2,5 – 2.12) opnieuw te ontwerpen en valideer hen (stappen 4.2 – 4.8).

5. voorbereiding en validatie van intracellulaire Patch-clamp oplossing

Opmerking: Het volgende protocol beschrijft de voorbereiding en validatie van een /gluconate K+gebaseerde interne oplossing, maar vrijwel elk type van patch-clamp oplossing kan worden gebruikt, zolang het geen belemmering voor de doelmatigheid van de RT-PCR vormt. Het dragen van handschoenen is verplicht om een RNase-vrije interne oplossing.

  1. Voorbereiden voor 60 mL interne patch-clamp opnameoplossing, gebruik 10 mL 0,1 M KOH.
  2. Los 11.4 mg EGTA (0.5 mM definitieve) in 0,9 mL 0,1 M KOH.
  3. Voeg 40 mL RNase-gratis water en los 2.02 g K-gluconaat (144 mM definitieve), 143 mg HEPES (10 mM laatste), en 180 µL van 1 M MgCl2 (laatste 3 mM).
  4. Breng de pH op 7,2 door toevoeging van ~ 6 mL 0,1 M KOH.
  5. Aanpassen van de osmolariteit tot 295 mOsm met ~ 13 mL RNase-gratis water.
  6. Aangezien de interne oplossing het ook als een buffer voor de omgekeerde transcriptie gebruikt wordt, zorgvuldig controleren Mg2 + concentratie. Een lagere Mg2 + concentratie in de oplossing van interne compenseren door MgCl2 daarna te bereiken van een definitieve concentratie van 2 mM in de RT-reactie toe te voegen.
  7. Toevoegen als u het label van de geoogste cel na patch-clamp opnemen, 2-5 mg/mL RNase-vrije biocytin aan de interne oplossing hierboven (stappen 5.1-5.5) beschreven.
  8. Filtreer (0,22 µm poriegrootte) de interne oplossing en opslaan bij-80 ° C als 100 – 250 µL aliquots.
  9. Voor het valideren van het gebruik van de interne oplossing voor eencellige RT-PCR, Voeg 0,5 µL van totale RNAs verdund op 1 ng/µL aan 6 µL van patch-clamp oplossing en laat het op de Bank voor ongeveer 30 min.
  10. Met een micropipet van 2 µL, voeg 2 µL van 5 x RT-mix, 0,5 µL van 20 x DDT, 0,5 µL RNase Inhibitor van de omwenteling en 0,5 µL RTase, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
  11. Draai de buis. Voeg water (q.s., 80 µL), 10 µL van 10 X buffer en 0,5 µL (2.5 U, 5 U/µL) van Taq polymerase op ijs.
  12. 40 cycli van PCR met behulp van een reeks gevalideerde inleidingen (stap 4.4 – 4.6) uit te voeren.
  13. Analyseren van de PCR producten door agarose gelelektroforese (zie stap 4.7) en controleer of dat ze de verwachte grootte hebben.
    Opmerking: De 0,5 µL van totale RNA weglaten en vervangen door 0,5 µL RNase-gratis water zal ervoor zorgen dat de interne oplossing vrij van RNA en/of DNA verontreinigingen is.

6. acute segment voorbereiding

Opmerking: Dit protocol beschrijft de segmenteringshulplijnen methode voor jeugdige (dat wil zeggenminder dan 28 postnatale dagen) mannelijke en vrouwelijke muizen. Andere oplossingen van snijden, zoals sucrose gebaseerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) zijn ook bruikbaar40.

  1. Bereiden van 2 L van aCSF met (in mM) 125 NaCl, 2,5 KCl 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO,3, 10 Glucose, en 15 Sucrose. Verklein glutamaterge activiteit tijdens de voorbereiding van het segment en bereid een snijden-oplossing door het toevoegen van 1 mM kynurenic zuur.
  2. Voordat hij snijden, stelt u een dissectie kit met chirurgische scharen, fijn iris schaar, twee spatels, pincet, een schijf van papieren filter en Cyanoacrylaat lijm.
  3. Gebruik ijskoud snijden oplossing verzadigd met O2/CO2 (95% / 5%) en koel neer het snijden kamer bij-20 ° C.
  4. Anesthetize de muis met een kleine papieren handdoek gedrenkt met Isofluraan. Na ~ 2 min, door ervoor te zorgen dat de muis onder diepe verdoving is door controle op de afwezigheid van reactie op paw snuifje.
  5. Decapitate snel de muis. Verwijderen van de hoofdhuid en de schedel te openen. Pak de hersenen zorgvuldig en plaatst u deze in een klein bekerglas gevuld met ijskoud (~ 4 ° C) snijden oplossing zuurstof met O2/CO2.
  6. Verwijder de snijden kamer van-20 ° C voorwaarden en vocht met een papieren handdoek.
  7. Zorgvuldig ontleden de hersenen te isoleren van de regio van belang, lijm deze op het snijden kamer en ijskoude snijden oplossing voor zuurstof met O2/CO2toevoegt.
  8. Snij 300 µm dikke sneden met behulp van een vibratome. Breng ze bij kamertemperatuur in een rust kamer gevuld met zuurstofrijk snijden oplossing en laten herstellen voor ten minste 0.5 uur.

7. eencellige RT-PCR na de opname van de Patch-clamp

  1. Reinigen van het systeem van de perfusie regelmatig met ~ 100 mL van 30% H2O2 oplossing en spoel uitgebreid met ~ 500 mL gedestilleerd water om te voorkomen dat bacteriën groei, want het is een over het hoofd gezien bron van RNase besmetting.
  2. Chlorine de gloeidraad met een patch pipet gevuld met geconcentreerd bleekmiddel dagelijks oogsten. Gebruik niet een micropipet te vullen de patch pipet maar eerder een 20 µL lange, fijne, flexibele tip gekoppeld aan een 1 mL spuit. Vervolgens spoel het uitgebreid met RNase gratis water en droog het met een stofdoek gas.
  3. Een kleine doos met 5 x RT-mix en 20 x DTT aliquots ijs bereiden. Bewaar de RTase en RNase remmer aliquots bij-20 ° C in een benchtop koeler.
  4. Pipetteer een segment in de zaal van de opname geperfundeerd op 1-2 mL/min met zuurstofrijk aCSF.
  5. Trek patch pipetten (1 – 2 µm open tip diameter, 3-5 MΩ) van borosilicaatglas terwijl het dragen van handschoenen en Vul één van hen met 8 μL van interne oplossing. Houd er rekening mee dat de knoppen van de trekker van de pipet een bron van verontreiniging zijn RNase zijn.
  6. Plaats de pipet in de pipet houder terwijl nieuwe handschoenen en niet aanraken van de gloeidraad met vingers.
  7. Aanpak van de patch-pipet met een positieve druk en het uitvoeren van geheel-cel opname karakteriseren de gerichte cel (Figuur 4).
  8. Om te bewaren de mRNAs, het beperken van de tijd in geheel-cel configuratie op 20 min.41.
  9. Aan het einde van de opname, bereiden een 500 µL PCR buis gevuld met 2 µL van 5 x RT Mix en 0,5 µL van 20 x DTT, draai het en sla het op ijs.
  10. Oogst het cytoplasma van de cel door toepassing van een zachte onderdruk (Figuur 4). Visueel besturingselement waarmee de inhoud van de cel binnen de pipet komt terwijl het handhaven van een goede afdichting.
    1. Vermijd zoveel mogelijk het verzamelen van de kern als sommige intron-minder genen worden geacht. In een dergelijk geval omvat altijd een reeks inleidingen gericht op het versterken van de gDNA sonde voor genomic besmetting.
    2. Als de kern dicht bij het uiteinde van de pipet komt, release de negatieve druk en verplaatst u het pipet uit de buurt van de kern. Zorgen dat de goede afdichting wordt bewaard en opnieuw opstarten om te verzamelen van het cytoplasma op de nieuwe locatie van de pipet.
  11. Stop het verzamelen wanneer geen meer materiaal komt en/of voor het verlies van de goede afdichting.
  12. Trekken de pipet zachtjes om te vormen van een buiten-out patch te beperken van verontreiniging door de extracellulaire puin (Figuur 4) en om de gunst van de sluiting van de celmembraan voor latere histochemische analyse.
  13. Houd er rekening mee dat knoppen, micromanipulators, computertoetsenbord of computermuis zijn potentiële bronnen van verontreiniging van de RNase. Als ze al aangeraakt tijdens de opname, wijzigen handschoenen.
  14. De pipet hechten aan de sojabonenkoeken en verdrijven de inhoud ervan in de PCR-buis door het toepassen van een positieve druk (Figuur 1).
  15. Het breken van het uiteinde van de pipet in de PCR-buis om te helpen de collectie van de inhoud.
  16. Kort centrifugeren van de buis, Voeg 0,5 µL van RNase remmer en 0,5 µL van RTase, meng voorzichtig, nogmaals centrifugeren en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
  17. Draai de buis en sla het op-80 ° C voor tot enkele maanden tot PCR analyse.
  18. De eerste amplificatie stap direct uitvoeren in de buis met de ~ 10 µL van RT producten door toevoeging van water (q.s., 80 µL), 10 µL van 10 x buffer en 0,5 µL (2.5 U) van Taq polymerase. Volg de instructies beschreven in stappen 4.8.2–4.8.8.

8. histochemische kleuring van de opgenomen cel (optioneel)

  1. Na het elektrofysiologische opnamen, het segment voor 20 min in zuurstofrijk aCSF om de verspreiding van biocytin in de boom axonale en dendritische te handhaven.
  2. Plaats het segment in een put van een 24-well plaat en de moeilijke situatie het overnachting bij 4 ° C met 1 mL 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer.
  3. Wassen van de segmenten 4 keer, 5 minuten elk, met 1 mL Phosphate Buffered Saline (PBS).
  4. In hetzelfde goed, permeabilize en het segment gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te verzadigen met 1 mL PBS aangevuld met 0,25% Triton X-100 en 0,2% gelatine van koud water vissen huid (PBS-GT).
  5. Na een nacht bebroeden met de een fluorescently geëtiketteerde avidin verdund 1/400 in 250-500 µL van PBS-GT.
  6. Wassen van 5 keer, 5 minuten elk, met 1 mL PBS en monteer de segmenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een representatieve validatie van multiplex RT-PCR is afgebeeld in Figuur 3. Het protocol is ontworpen om de sonde gelijktijdig de expressie van 12 verschillende genen. De vesiculaire glutamaat transporter vGluT1 werd opgevat als een positieve controle voor glutamaterge neuronen42. Het GABA synthese enzymen (GAD65 en GAD 67), Neuropeptide Y (NPY) en Somatostatine (SOM) werden gebruikt als markers van GABAergic interneuronen3,5,11. Het enzym cyclooxygenase-2 (COX-2) werd gebruikt als een marker van de piramidale cel subpopulatie3,16.

De ATP1α1-3 subeenheden van de nb+/K+ ATPase en de subeenheden van het Kir6.2 en SUR1 van de ATP-gevoelige K+ -kanalen werden gekozen om te evalueren van de relatie tussen Neuronale activiteit en valt bestuurlijk gezien onder metabole43. Aangezien Kir6.2 een gen intron-minder is, werd de SOM intron opgenomen als een genomic besturingselement. Het protocol is getest op 1 ng van omgekeerde getranscribeerde totaal RNA geëxtraheerd uit het hele brein muis, hetgeen overeenkomt met ongeveer de transcripties van 20 cellen44. De multiplex PCR geproduceerd 12 waarbij van de verwachte grootte (afbeelding 3 en tabel 1) aantonen van de gevoeligheid en de efficiëntie van het protocol. De negatieve controle uitgevoerd zonder RNA geproduceerd geen amplicon (gegevens niet worden weergegeven).

Een laag V piramidale neuron was visueel geïdentificeerd door zijn grote soma en een prominente apicale dendriet (figuur 5A, inzet). Opname van de hele cel geopenbaard typische elektrofysiologische eigenschappen van laag V regelmatige stekelige neuronen5,45,46 , met name, een lage input weerstand, langdurige actie potentials en uitgesproken spike frequentie aanpassing (figuur 5A). De moleculaire analyse van deze neuron bleek de expressie van het vGluT1 (figuur 5B), bevestiging van haar glutamaterge fenotype42,46. Deze neuron ook uitgedrukt SOM, ATP1α1 en 3 subeenheden van de nb+/K+ ATPase. Biocytin labeling van de opgenomen neuronen bevestigd een piramidale morfologie (figuur 5D).

Zoals verwacht van glutamaterge neuronen, bleek de moleculaire analyse van 26 laag V piramidale cellen uitdrukking van VGluT1, maar geen van de twee GADs (figuur 5C). Markers van interneuronen werden zelden waargenomen4642,5,. COX-2, voornamelijk uitgedrukt door laag II-III piramidale cellen3,16, is niet gevonden in laag V piramidale cellen. De ATP1α1 en 3 subeenheden waren vaker waargenomen dan de ATP1α2 subeenheid3. De Kir6.2 en SUR1 subeenheden werden zelden ontdekt in laag V piramidale neuronen, die strookt met hun preferentiële uitdrukking in de bovenste lagen3,43. Zorg werd genomen om nog maar niet te oogsten van de kernen, resulterend in een zeldzame detectie van SOM introns (3 uit 26 cellen, dat wil zeggen12%).

Figure 1
Figuur 1: speciale box voor eencellige RT-PCR. Lijst van materialen die zijn gereserveerd voor RT-PCR na patch-clamp. (1) borosilicaatglas haarvaten, (2) 20 µL lange, fijne, flexibele tips, (3) 20 µL micropipet, (4) huisgemaakte zonnebloemkoek, (5) 500 µL PCR buizen, (6) 10 µL aërosol resistente filter tips en (7) permanente markers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: PCR primer design strategie. (A) Schematische weergave van de codering opeenvolging van COX-2 cDNA uitgelijnd met de muis chromosoom 2 opeenvolging met de COX 2-gen. Exons worden vertegenwoordigd door de zwarte dozen en introns op gDNA door witte dozen. Opmerking de lacunes in de cDNA overeenkomt met de intronic sequenties op de gDNA. Representatieve voorbeelden van goede en slechte oligonucleotides vertegenwoordigd als rode en groene pijlen, respectievelijk. Links en rechts pijlen duiden voorwaartse en omgekeerde inleidingen. (B) sequenties en secondaire structuren van de oligonucleotides weergegeven in (A). Links en rechts panelen geven haarspeld zelf-complementariteit en zelf-dimeer vorming, respectievelijk. De B1 oligonucleotide geeft zowel een sterke haarspeld zelf-complementariteit en dimeer vorming terwijl de B2 oligonucleotide alleen dimeer vorming toont. Zowel B3 en B4 oligonucleotides hebben geen haarspeld zelf-complementariteit en geen dimeer vorming; ze zijn intron overspanning (A) en zijn geselecteerd als potentiële PCR inleidingen (Zie tabel 1). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: validatie van multiplex PCR. 1 ng van totaal RNA van muis hele hersenen werd onderworpen aan een omgekeerde transcriptie, gevolgd door twee rondes van PCR versterking. De 12 PCR producten waren opgelost in gescheiden doorgangen door agarose de Elektroforese van het gel in parallel met de Φx174 verteerd door HaeIII. De tweede PCR producten had voorspeld door de sequenties van de formaten (in bp): 153 (vGluT1), 248 (GAD65), 255 (GAD67), 181 (COX-2), 220 (NPY), 146 (SOM), 183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2), 128 (ATP1a3), 342 (Kir6.2), 211 (SUR1) en 182 (SOMint). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Patch-clamp oogsten in hersenen plakjes. Zodra een cel is visueel geïdentificeerd, wordt de opname-pipet benaderd met een positieve druk om te voorkomen dat besmetting van de cellulaire puin aan het uiteinde van de pipet. Opmerking het kuiltje op het membraan van deze neuron. Positieve druk wordt dan onderbroken om te vormen van een cel-ingeschrevenen configuratie met een goede afdichting van Gigaohm. Korte zuigpijpen worden toegepast om over te schakelen naar geheel-cel configuratie. Aan het einde van de opname, wordt het cytoplasma geoogst door een zachte onderdruk in de pipet met behoud van de goede afdichting toe te passen. Opmerking de krimp van de cel lichaam tijdens de oogst procedure. De opname-Pipet is dan zachtjes te vormen van een buiten-out patch, die celmembraan sluiting voor latere biocytin openbaring, en behoud van oogstmateriaal in de patch pipet gunsten ingetrokken. Cauli en Lambolez €47 gereproduceerd met toestemming van de Royal Society of Chemistry. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: karakterisering van laag V neocortical piramidale cellen. (A) membraan mogelijke reactie van een laag V piramidale cel geïnduceerd door huidige pulsen van-100, -40 -10, + 60, +120 en + 500 pA (bodem sporen). Het neuron geeft een zwakke potentiële uitwijking na de eerste hyperpolarizing reactie (bovenste sporen). In antwoord op een supraliminal depolarisatie, het neuron geloosd langdurige actie potentials met langzaam ontwikkelen na-hyperpolarisatie (bovenste trace). In de buurt van verzadiging, het neuron geloosd op een lage frequentie en een uitgesproken aanpassing (bovenste grijze trace) tentoongesteld. Inzet: infrarood foto's van de opgenomen laag V piramidale neuron. Het pial oppervlak is omhoog. Schaal bar: 20 µm. (B) Multiplex RT-PCR analyse onthullen uitdrukking van vGluT1, SOM, ATP1α1 en ATP1α3. (C) genexpressie profiel in een monster van 26 laag V piramidale cellen. vGluT1 kwam tot uitdrukking in alle neuronen terwijl GAD65, GAD67 en COX2 werden nooit ontdekt. NPY, SOM, Kir6.2, SUR1 en SOMint werden zelden waargenomen. Piramidale cellen uitgedrukt ATP1α3, 1 subeenheid van de nb++ ATPase /K en ATP1α2 in mindere mate. (D) maximale intensiteit projectie van de confocal afbeeldingen tonen biocytin labeling van het neuron opgenomen in (A). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Gen / GenBank nummer Externe inleidingen Grootte (bp) Interne inleidingen Grootte (bp)
vGlut1
NM_182993		 Zin,-113 259 Zin,-54 153
GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC ATTCGCAGCCAACAGGGTCT
Anti-gevoel, 126 Anti-gevoel, 79
CCAGCCGACTCCGTTCTAAG TGGCAAGCAGGGTATGTGAC
GAD65
NM_008078		 Zin, 99 375 Zin, 219 248
CCAAAAGTTCACGGGCGG CACCTGCGACCAAAAACCCT
Anti-gevoel, 454 Anti-gevoel, 447
TCCTCCAGATTTTGCGGTTG GATTTTGCGGTTGGTCTGCC
GAD67
NM_008077		 Zin, 529 598 Zin, 801 255
TACGGGGTTCGCACAGGTC CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC
Anti-gevoel, 1109 Anti-gevoel, 1034
CCCAGGCAGCATCCACAT AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC
COX 2
NM_011198		 Zin, 199 268 Zin, 265 181
CTGAAGCCCACCCCAAACAC AACAACATCCCCTTCCTGCG
Anti-gevoel, 445 Anti-gevoel, 426
CCTTATTTCCCTTCACACCCAT TGGGAGTTGGGCAGTCATCT
NPY
NM_023456		 Zin, 16 294 Zin, 38 220
CGAATGGGGCTGTGTGGA CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT
Anti-gevoel, 286 Anti-gevoel, 236
AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA
SOM
NM_009215		 Zin, 43 208 Zin, 75 146
ATCGTCCTGGCTTTGGGC GCCCTCGGACCCCAGACT
Anti-gevoel, 231 Anti-gevoel, 203
GCCTCATCTCGTCCTGCTCA GCAAATCCTCGGGCTCCA
ATP1Α1
NM_144900 		Zin, 1287 288 Zin, 1329 183
CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA TAAGCGGGCAGTAGCGGG
Anti-gevoel, 1556 Anti-gevoel, 1492
CCGTGGAGAAGGATGGAGC AGGTGTTTGGGCTCAGATGC
ATP1Α2
NM_178405		 Zin, 1392 268 Zin, 1430 213
AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG AAATCCCCTTCAACTCCACCA
Anti-gevoel, 1640 Anti-gevoel, 1623
ACAGAAGCCCAGCACTCGTT GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC
ATP1Α3
NM_144921		 Zin, 127 216 Zin, 158 128
CGGAAATACAATACTGACTGCGTG TGACACACAGTAAAGCCCAGGA
Anti-gevoel, 324 Anti-gevoel, 264
GTCATCCTCCGTCCCTGCC CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA
Kir6.2
NM_010602		 Zin, 306 431 Zin, 339 342
CGGAGAGGGCACCAATGT CATCCACTCCTTTTCATCTGCC
Anti-gevoel, 719 Anti-gevoel, 663
CACCCACGCCATTCTCCA TCGGGGCTGGTGGTCTTG
SUR1
NM_011510		 Zin, 1867 385 Zin, 2041 211
CAGTGTGCCCCCCGAGAG ATCATCGGAGGCTTCTTCACC
Anti-gevoel, 2231 Anti-gevoel, 2231
GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG
SOMint
X51468		 Zin, 8 240 Zin, 16 182
CTGTCCCCCTTACGAATCCC CTTACGAATCCCCCAGCCTT
Anti-gevoel, 228 Anti-gevoel, 178
CCAGCACCAGGGATAGAGCC TTGAAAGCCAGGGAGGAACT

Tabel 1. Sequenties van eerste en tweede PCR inleidingen. De positie van elke PCR primers en hun reeksen zijn gegeven van 5' naar 3'. Met uitzondering van de Somatostatine-intron, positie 1 komt overeen met het eerste honk voor de start codon van elk gen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Single cell multiplex RT-PCR nadat patch-clamp kan gelijktijdig en betrouwbaar sonde de expressie van meer dan 30 genen in electrophysiologically geïdentificeerde cellen5. Analyse van genexpressie eencellige niveau vereist hoogefficiënte PCR inleidingen. Een van de meest beperkende maatregelen is de verzameling van de cel inhoud. Doeltreffendheid ervan is afhankelijk van de diameter van de patch Pipetteer tip, die zo groot mogelijk moet terwijl overeenkomen met de grootte van de cel. Pipetten met een diameter van 1-2 µm open uiteinde waren bewezen geschikt voor meest neuronale typen. Het is ook essentieel om ervoor te zorgen dat alleen de cellulaire inhoud wordt verzameld, en niet het omringende weefsel. Dit wordt bereikt door het behoud van een goede afdichting tijdens de oogst electrophysiologically te beheren. De vorming van een buiten-out patch configuratie tijdens Pipetteer terugtrekking verder beschermt het geoogste cytoplasma tegen cellulaire puin. Het slagingspercentage van de eencellige die multiplex RT-PCR hangt ook af van mRNAs overvloed van de onderzochte celtype. Bijvoorbeeld, de opbrengst verkregen met astrocyten, die mRNAs in relatief lage bedragen3 uitdrukken, is over het algemeen lager is dan de verkregen met neuronen en vereist dus een verhoging van15,16van de grootte van de steekproef. Omgekeerde transcriptie, die een laag rendement in buizen48 heeft, is de beperkende reactie van single cell multiplex RT-PCR. Het is daarom cruciaal te gebruiken topkwaliteit reagentia, op te slaan als aliquots bij-80 ° C, en ze slechts voor één dag. Tot slot, de activiteit van de polymerase van DNA van de RTase is vaak een overzien bron van primer-dimeer vorming. Om aan te pakken dit probleem, het uitvoeren van een warme start met inleidingen is cruciaal voor de verhoging van de efficiëntie van de versterking. Bovendien zal hierdoor het remmende effect van RTase op het DNA van Taq polymerase activiteit49.

De eencellige multiplex RT-PCR techniek is zeer veelzijdig. Het is uitgebreid gebruikt in knaagdieren10,11,13,19,20,34,50,51,52 ,53,,54 maar kan worden aangepast aan vrijwel alle dierlijke modellen en genen ervan uitgaande dat weefsel en gen-sequenties zijn beschikbaar. Verschillende patch-clamp oplossingen kunnen worden gebruikt, zolang zij niet met de RT-PCR op cel gratis testen interfereren. Bijvoorbeeld interne oplossingen gebaseerd op K+ Cs+ caties, Cl- of gluconaat geweest met succes gebruikte6,36,,41,55.

Klassieke vals-negatieve resultaten vloeien voort uit RNase besmetting van de patch Pipetteer gloeidraad en/of interne patch-clamp oplossing. Dit probleem wordt opgelost door zorgvuldig chloreren van de gloeidraad en valideren van de interne oplossing in het algemeen. Vals-negatieve resultaten kunnen ook optreden wanneer een gen wordt uitgedrukt op het niveau van een lage eencellige, aangezien slechts een deel van het cytoplasma wordt geoogst. De oogsten kwaliteit kan worden verhoogd met behulp van grotere pipetten en/of door het verminderen van de tijd van de opname geheel-cel. Oogsten van kwaliteit kan worden beoordeeld door een gen bekend tot uitdrukking worden gebracht op een laag niveau in afzonderlijke cellen20. Vals-positieve resultaten kunnen optreden met weefsel van slechte kwaliteit, waarin de hoeveelheid verontreiniging van cellulaire puin hoog is. Testen van de aanwezigheid van puin wordt gedaan door het invoegen van een patch pipet in het segment zonder het uitvoeren van elke zegel en het vrijgeven van de overdruk voorafgaand aan de verwijdering van de pipet. De aanwezigheid van amplifiable materialen wordt vervolgens onderzocht door multiplex RT-PCR42. Silaneren de patch Pipet is ook gebruikt om de collectie van extracellulaire contaminanten56. Eencellige PCR is een zeer gevoelige techniek die kan zo weinig als een enkel exemplaar van dubbele gestrande DNA57detecteren. In het geval van intron-minder genen, kan de gDNA die zijn opgenomen in de kern tevens produceren valse positieven. Het vermijden van de collectie van gDNA door het plaatsen van de pipet uit de buurt van de kern tijdens de oogst helpt bij het oplossen van dit probleem. De aanwezigheid van gDNA kan betrouwbaar worden bestudeerd door het sturen van een intronic reeks25.

De detectie van mRNA moleculen door RT-PCR wordt onbetrouwbaar op 10 exemplaren44, vermoedelijk vanwege de geringe efficiëntie van de RTase48, en kan leiden tot een onder detectie van lage-overvloed afschriften26,42. Dit kan problematisch zijn in het geval van intron-minder genen. Inderdaad, het vermijden van de oogst van de kern vermindert de hoeveelheid cytoplasma die kan worden verzameld en dus de detectie-gevoeligheid. De combinatie van eencellige RT-PCR nadat patch-clamp met biocytin labeling vereist dat de vorm van de cel zoveel mogelijk wordt gehandhaafd (Figuur 3). Onvermijdelijk, vermindert dit de hoeveelheid materiaal die kan worden verzameld, waardoor het slagingspercentage. Een compromis tussen cytoplasma inzameling en behoud van de morfologie van de cel is verplicht.

Multiplex eencellige RT-PCR zijn geen gegevens kwantitatieve aangezien zij alleen informatie geven over de vraag of cDNAs aanwezig of afwezig in het verzamelde materiaal. Echter vanwege de detectiegrenzen hierboven beschreven, kan het vóórkomen van detectie op het bevolkingsniveau weerspiegelen de overvloed van genen op het niveau van één cel. Alternatieve benaderingen toestaan de generatie van meer kwantitatieve gegevens, maar de technische beperkingen opgelegd door hun specifieke versterking strategieën (d.w.z.relatieve kwantificering van homologe genen of RT-qPCR) grotendeels beperken het aantal genen die gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd41,53,,55,58,59,60,,61,62,63 ,64,,65,66. De recente combinatie van patch-clamp opnamen en eencellige RNaseq, Patch-seq30,31, hierna zorgt ervoor dat kwantitatieve transcriptomic analyse van electrophysiologically-gekenmerkt cellen. Het is een nieuwe en veelbelovende benadering, maar het vereist toegang tot high-throughput sequencers en de gegenereerde gegevens tijdrovend analyse vereist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Dr. Alexandre Mourot voor zijn opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd gesteund door subsidies van het Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 en ANR-17-CE37-0010-03), BLG wordt ondersteund door de fellowship van de Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Wij danken het dier faciliteit van de IBPS (Parijs, Frankrijk).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series - 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series - 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series - 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13 (2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 136 genexpressie profiel neuronen astrocyten hersenen segmenten geheel-cel configuratie geneste polymerase-kettingreactie (PCR)
Eencellige Multiplex omgekeerde transcriptie Polymerase-kettingreactie na Patch-clamp
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet,… More

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter