Summary
Wir führen einen murinen orthotopen Brust Krebs Modell und radikale Mastektomie Modell mit Biolumineszenz-Technologie, die Tumorlast um menschliche Muttermilch Tumorprogression imitieren zu quantifizieren.
Abstract
In-vivo Mausmodellen Brust Krebs Fortschreiten zu beurteilen sind unerlässlich für die Krebsforschung, einschließlich der präklinischen Medikament Entwicklungen. Der Großteil der praktischen und technischen Daten entfallen jedoch häufig in veröffentlichten Manuskripte, die daher, macht es schwierig, um die Modelle zu reproduzieren, besonders wenn es um chirurgische Techniken geht. Biolumineszenz Technologie ermöglicht die Auswertung von geringen Mengen von Krebszellen auch wenn ein Tumor nicht greifbar ist. Verwendung von Krebszellen Luciferase-zum Ausdruck zu bringen, schaffen wir eine Brust Krebs orthotopen Inokulation Technik mit einer hohen Tumorgenese. Lungenkrebs Metastasen ist ein ex-Vivo -Technik bewertet. Wir etablieren dann eine Mastektomie-Modell mit einer niedrigen lokale Rezidivrate der metastatischen Tumorlast zu beurteilen. Hierin beschrieben, detailliert, die Operationstechniken der orthotopen Implantation und Brustamputation für Brustkrebs mit einer hohen Tumorgenese und niedrigen lokalen Rezidivraten bzw. zur Verbesserung der Brust Krebs Modell Effizienz.
Introduction
Tiermodelle spielen eine Schlüsselrolle in der Krebsforschung. Wenn eine Hypothese in vitro nachgewiesen ist, sollte es in-vivo auszuwertende ihre klinische Relevanz geprüft werden. Tumorprogression und Metastasierung sind oft besser von Tiermodellen im Vergleich zu in-vitro-Modelle erfasst, und es ist wichtig, ein neues Medikament testen in einem Tiermodell als einer präklinischen Studie für Droge-Entwicklung1,2. Die technischen Details von Tierversuchen sind jedoch oft nicht gut beschrieben in veröffentlichten Artikeln, so dass es eine Herausforderung, das Modell erfolgreich zu reproduzieren. In der Tat ging die Autoren, die diese orthotopen Inokulation und Mastektomie Modelle hergestellt durch langen und strengen Prozesse von Versuch und Irrtum. Die Erfolgsquote bei der Tumorgenese nach Krebs Zelle Impfung ist einer der wichtigsten Faktoren für den Erfolg und die Effizienz eines Tieres studieren3. Die Zell-Linie und die Anzahl der Zellen zu impfen, die Impfung-Website und die Belastung der Mäuse sind alle wichtigen Faktoren. Es ist bekannt, dass es große Unterschiede in den Ergebnissen von Tierversuchen durch individuelle Unterschiede im Vergleich zu in-vitro-Techniken gibt. Daher ist es wichtig, stabile Ergebnisse zur Verbesserung der Effizienz von Tierversuchen und irreführende Ergebnisse zu vermeiden, mit einem etablierten Modell mit einem standard-Technik.
Dieses Dokument enthält etablierte Techniken4 um Brust Krebs orthotopen und Mastektomie Mausmodellen zu generieren. Die Ziele dieser Methoden sind 1) menschliche Muttermilch Tumorprogression und Behandlungszyklen zu imitieren, und (2) in vivo Experimente mit mehr Effizienz und höhere Erfolgsraten im Vergleich zu anderen Brust-Krebs-Impfung oder Mastektomie Techniken. Im orthotopen Krebs Zelle Inokulation um menschliche Muttermilch Tumorprogression, imitieren wählen wir #2 Mamma Fettpolster als Impfung Website, befindet sich in der Brust. In den meisten Studien, Brustkrebs-Zellen werden subkutan geimpft5. Diese Technik erfordert keine Operation, und so ist es einfach und unkompliziert. Die subkutane Mikroumgebung unterscheidet sich jedoch von der Brustdrüse Mikroumgebung, die Ergebnisse in verschiedenen Tumorprogression und auch molekularer Profile6,7. Einige Studien verwenden #4 Brustdrüse, die sich in der Bauchhöhle befindet, als eine Impfung Seite6. Da jedoch #4 Milchdrüsen in der Bauchhöhle befinden, ist die häufigste metastasierendem Muster peritonealen Carcinomatosis7, die mit weniger als 10 % von metastasierendem Brustkrebs Krebs8auftritt. Generiert durch die Technik in der Brustdrüse #2 das hier vorgestellte Brustkrebs metastasiert in die Lunge, die eines der häufigsten Brust Krebs metastasiertem Websites9ist.
Mit dieser Technik soll auch eine höhere Tumorgenese mit minimalen Tumor Größe Variabilität im Vergleich zu anderen Brust Krebs Impfung zu erzielen. Hierzu sind Krebszellen, die in eine gallertartige Proteinmischung ausgesetzt unter direkter Sicht durch einen medianen vorderen Brust Wand Schnitt geimpft. Diese Technik sorgt für eine hohe Tumorgenese Rate mit weniger Variabilität in der Größe des Tumors und Form im Vergleich zur subkutanen oder nicht-chirurgische Injektion, wie bereits berichtet3,7.
Wir führen auch eine Maus radikale Mastektomie Technik in der orthotopen Brusttumor mit dem umliegenden Gewebe und axillären Lymphknoten reseziert wird. In der klinischen Einstellung ist die Standardtherapie für Patientinnen mit Brustkrebs ohne Fernmetastasen Krankheit Mastektomie10,11. Bevor eine Mastektomie wird axillären Lymphknoten-Metastasen von Bildgebung und Sentinel-Lymphknoten-Biopsie befragt. Wenn es keinen Beweis der axillären Lymphknoten-Metastasen gibt, ist der Patient dann mit eine vollständige oder partielle Mastektomie, behandelt in der axillären Lymphknoten-Resektion weggelassen wird. Totale Mastektomie ist eine Technik, um Brustkrebs mit das ganze Brustgewebe en bloc zu resezieren, während partielle Mastektomie Brustkrebs mit einer Marge von umgebenden normalen Brustgewebe, resezieren somit Erhaltung der verbliebenen normalen Brustgewebe in der Patienten. Patienten, die Erhaltung normalen Brustgewebe nach einer partiellen Mastektomie verbleibende erfordern jedoch postoperative Strahlentherapie Lokalrezidiv10zu vermeiden. Patienen mit axillären Lymphknoten-Metastasen, die radikale Mastektomie verpflichten sich, wodurch das Brustkrebs mit allen normalen Brust-Gewebe und axillären Lymphknoten und marschierte in Geweben En Bloc10,11. Im Mausmodell ist die Überwachung für axillären Lymphknoten Metastasen und/oder postoperative Bestrahlung nicht sinnvoll oder machbar. So nutzen wir die radikale Mastektomie-Technik zur Vermeidung von lokalen oder axillären Lymphknoten-Metastasen.
Krebs Zelle Beimpfen über die Rute Vene ist die am weitesten verbreitete Lunge Metastasen Maus Modell12, die so genannte "experimentelle Metastase". Dieses Modell ist leicht zu generieren und erfordert keine Operation; jedoch ist es nicht menschliche Muttermilch Tumorprogression imitieren die verschiedenen Metastasen Verhalten führen können. Um die menschliche Brust Krebs Behandlung natürlich imitieren wo Metastasierung häufig nach Mastektomie tritt, ist nach der orthotopen Krebs Zelle Inokulation der Primärtumor entfernt. Diese Technik erzeugt weniger Lokalrezidiven im Vergleich zu einfachen Tumor-Resektion, wie bereits berichtet13, und eignet sich für neuer Therapeutika, präklinische Studien und für metastasierendem Brustkrebs Krebs Forschungsstudien. Die hier beschriebenen Techniken sind für die meisten Brust Krebs orthotopen Modellversuche. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass die gallertartige Proteinmischung die Mikroumgebung beeinflussen und Operation Stress/Immune Antwort14 beeinflussen. Daher sollten Forscher studieren die Mikroumgebung und/oder Stress/Immunantwort Potenzial Störfaktoren berücksichtigen.
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Protocol
Die Genehmigung vom Roswell Park umfassende Cancer Center institutionelle Animal Care und Use Committee war für alle Experimente.
Hinweis: Neun bis zwölf Wochen alten weiblichen BALB/c Mäusen stammen. 4T1-luc2 Zellen, eine Maus Mamma Adenokarzinom Zelllinie von BALB/c Mäusen abgeleitet, die auf ausdrücklichen Luciferase entwickelt, hat dienen. Diese Zellen sind in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) kultiviert.
1. Vorbereitung der Instrumente
- Tauen Sie eine gefrorene gallertartige Proteinmischung (z. B. Matrigel) auf dem Eis in einer Gewebekultur-Haube.
- Reinigen und Autoklav zwei Sätze von chirurgischen Instrumenten (Mikrodissektion Schere, Adson Pinzette und einem Nadelhalter) vor der Operation. Bereiten Sie sterilisiert 5-0 Seide Nähte und trocknen Sie Sterilisationsmittel (wenn serielle Operationen geplant sind).
- Schneiden Sie die Mitte der Brusthaare der Mäuse mit einer Haarschneidemaschine und markieren Sie die Mäuse für die Identifizierung durch Stanzen das Ohr vor dem Zeitpunkt der Operation.
-
Bereiten Sie die Prozedurentabelle, die für den Betrieb sofort verwendet werden kann.
- Verbreiten Sie eine saugfähige Unterlage zu und fixieren Sie die Ecken mit Klebeband, beheben Sie Narkose Nase Kegel mit Klebeband, Sterilisations- und Desinfektionsmittel (Chlorhexidin, Jod, und 75 % Ethanol) setzen neben Betätigungsraum zu, und die Mäuse in Betrieb Reihenfolge.
2. Vorbereitung der Zellen (für 10 Mäuse)
Hinweis: Die Zellen sollten innerhalb 1 h nach losgelöst aus der Schale zu vermeiden verminderte Zellviabilität geimpft werden. Insbesondere sollten die Zellsuspension in die gallertartige Proteinmischung innerhalb von 15 Minuten gemischt werden, nach Abnehmen der Zellen aus der Schale um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten.
- 4T1-luc2 Kulturzellen, eine Maus Mamma Adenokarzinom Zell-Linie mit dem Ausdruck Luciferase in RPMI 1640 Medien mit 10 % FBS in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C in 5 % CO2.
- Waschen Sie die anhaftenden 4T1-luc2 Zellen in einer 10 cm Petrischale mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einer serologischen 10 mL-Pipette. Fügen Sie 1 mL von 0,25 % Trypsin mit einer Pipette P1000 und dann inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C für 5 min. Fügen Sie 4 mL Wachstumsmedien (RPMI-1640 mit 10 % FBS) mit einer serologischen 5 mL pipette und übertragen die Zellsuspension auf eine 15 mL konische Rohr in einer Gewebekultur-Haube. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 180 X g für 5 min.
- Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zellen in 2 mL PBS; dann zählen Sie die Zellen unter Verwendung der Hemocytometer.
- 2 x 106 4T1-luc2 Zellen in 40 μl von kaltem PBS (pH 7.4, 4 ° C) in der Gewebekultur Haube auszusetzen.
- Mischen Sie die 40 μl Zellsuspension mit 360 μL der gallertartigen Proteinmischung in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auf Eis in der Gewebekultur-Haube.
Hinweis: Die Endkonzentration wird 1 x 10520 μl (1:9 PBS: gallertartige Proteinmischung). Für das orthotopen Modell (keine Mastektomie) war 1 x 10420 μL der endgültige Konzentration verwendet, um zu vermeiden, Euthanasie Kriterien (Tumor Größe > 2 cm) innerhalb von zwei Wochen zu erreichen.
3. Krebs Zelle Inokulation
- Setzen die Mäuse in der Anästhesie-Induktion-Kammer mit 2-4 % Isofluran und 0,2 L/min Sauerstoff-Fluss, bis die Mäuse ruhig atmen (2 – 3 min.).
- Fassen Sie die Maus und injizieren Sie 0,05 mg/kg Buprenorphin in seiner Schulter subkutan zu.
- Bestätigen Sie ausreichende Anästhesie durch den Mangel an Reaktion auf eine Zehe Prise. Legen Sie die Maus Nase in das Loch der Maske Maus, wodurch inhalativer Anästhesie mit 2-4 % Isofluran und 2 L/min Sauerstoff fließen zu einer Einheit Kohle Behälter befestigt.
- Die Maus Gliedmaßen mit Lab Klebeband zurückhalten und seine Haut mit Chlorhexidin, Jod und 75 % Ethanol, mit Wattestäbchen zu sterilisieren.
- Machen Sie einen 5 mm Hautschnitt in der Mitte der vorderen Brustwand Verwendung steril Mikrodissektion Schere, Aufzug die rechten Seite neben der Schnitt der Haut und die Haut von der Brustwand mit der Schere zu trennen und dann invertieren die Haut um das Recht #2 verfügbar zu machen Mamma Fettlappen.
- 20 μl Zellsuspension Krebs mit einer Spritze 1 mL Insulin mit einer 28,5 G-Nadel in Fettpolster unter direkter Sicht durch die Wunde sorgfältig zu injizieren.
Hinweis: Die Nadel geht durch die Wunde, nicht die Haut. Halten Sie die Nadel in die Fettpolster für 5 s vor zu ziehen, die Zeit für die gallertartige Proteinmischung zu erstarren lässt. - Schließen Sie die Hautschnitte durch Nähte, mit nicht resorbierbaren Fäden steril 5-0.
- Nach der Operation, die Tiere wieder einen sauberen Käfig und überwachen sie, bis sie sich erholt haben und sind frei bewegen (nach ~ 1 – 2 min.). Wenn ein Tier nicht angezeigt wird, um bei guter Gesundheit innerhalb von 24 Stunden nach der Operation sein, verwalten Sie Buprenorphin (0,2 mg/kg).
- Die Nähte in Narkose zu entfernen (siehe Punkt 3.1) 7 d nach der Operation.
(4) Mastektomie
Hinweis: Das Timing der Mastektomie ist sehr wichtig. Wenn sie zu früh erfolgt, tritt Lungenkrebs Metastasen nicht. Wenn sie zu spät erfolgt, eingedrungen der Primärtumor großen Blutgefäße, die eine komplette onkologische Resektion schwierig machen. So wurden mehrere Zeitpunkte für Mastektomie zu bestimmen, welcher Zeitpunkt produziert das richtige Gleichgewicht in der Wartezeit für Metastasen vor Resektion zu schwierig wurde geprüft. Nach dabei in mehr als 50 Maus-Experimente, es zeigte sich, dass Mastektomie 8 Tage nach der Inokulation Krebs Zelle (oder wenn die Größe des Tumors, 5 mm erreicht) die ideale war Zeit Punkt zu erreichen, die13Bilanz.
- Eine Maus mit 2-4 % inhaliert Isofluran zu betäuben und injizieren Buprenorphin (siehe Schritte 3.1 und 3.2).
- Die Maus zurückhalten und seine Haut zu sterilisieren (siehe Punkt 3.4).
- Machen Sie einen 5 mm Hautschnitt 2 mm auf der linken Seite aus die Operationsnarbe, die bei der ursprünglichen Krebs Zelle Inokulation mit der Schere Mikrodissektion erfolgte. Verlängern den Schnitt in Richtung der Wurzel der Vordergliedmaße, den Tumor zu entfernen, die Haut unter anderem die Operationsnarbe und die Läsion in Kontakt mit den Tumor sowie der axillären Lymphknoten-Becken, in dem meiste Zeit keine sichtbaren Lymphknoten existiert zum Zeitpunkt der mastect Konjunktur-13. Achten Sie darauf, nicht die axillaris Vene zu beschädigen.
- Schließen Sie die Hautdefekte durch Nähte, mit nicht resorbierbaren Fäden steril 5-0 in der Form eines "Y".
- Das gleiche wie in Schritt 3,8, zurück die Maus zu einem sauberen Käfig und Monitor, bis sie sich erholt haben.
- Die Nähte in Narkose zu entfernen (siehe Punkt 3.1) 7 Tage nach der Operation.
5. Biolumineszenz Quantifizierung des Primärtumors (Orthotopic Impfung ohne Mastektomie) oder Lunge Metastasen (Mastektomie Modell)
Hinweis: Die Biolumineszenz ist für Primärtumor Belastung Quantifizierung gemessenen 2 x pro Woche ab dem Tag nach der Inokulation orthotopen. Für die Lunge Metastasen Quantifizierung ist die Biolumineszenz gemessenen 2 x pro Woche ab dem Tag nach der Mastektomie.
- D-Luciferin in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS), eine Endkonzentration von 15 mg/mL in einer Gewebekultur Kapuze auflösen. Aliquoten Röhren in 1,5 mL Licht abgeschirmt Microcentrifuge. Speichern Sie die verdünnte Lösung bei-80 ° C.
Hinweis: Für eine 20 g-Maus ist 200 µL verdünnter D-Luciferin erforderlich. - Öffnen Sie die imaging-Software, und klicken Sie auf zu initialisieren.
Hinweis: Es dauert ca. 15 min. abkühlen – Coupled Ladegerät (CCD). Wenn der CCD die eingestellte Temperatur erreicht, wechselt die Farbe des Balkens Temperatur von rot auf grün. - Die Mäuse mit 2-4 % Isofluran in einer dedizierten Induktion Kammer vor Bildgebung zu betäuben (siehe Punkt 3.1).
- Wiegen Sie die Mäuse.
- 150 mg/kg D-Luciferin intraperitoneal zum Zeitpunkt der Mitte des Bauches, mit Hilfe einer Nadel 28,5 G zu injizieren.
- Passen Sie jede Maus mit einer Nase Kegel innerhalb der imaging-System in der Rückenlage (Platz maximal fünf Mäuse zur gleichen Zeit). Anästhesie bei 1 % - 3 % Isofluran (in 100 % Sauerstoff) durch die Nase Kegel während der Bildgebung zu erhalten.
-
Erfassen Sie ein Bild alle 5 min um die Gipfel Biolumineszenz für 50 min (oder bis die bestätigten Peak Biolumineszenz) zu erkennen.
- Wählen Sie Auto, Binning , als Mediumund Sichtfeld als D Lumineszenz .
- Klicken Sie auf erfassen um das Bild aufzunehmen.
- Zurückkehren Sie die Mäuse zu ihren Referenzdrehzahl und überwachen sie, bis sie sich erholt haben (siehe Punkt 3.8).
(6) Lunge Metastasen Tumor Belastung Quantifizierung von Ex-Vivo Bildgebung
Hinweis: Lungenkrebs Metastasen Quantifizierung ist für orthotopen Inokulation mit und ohne Mastektomie Modelle anwendbar. Im Modell Mastektomie ist ex-Vivo Bildgebung oder Überleben Beobachtung gewählt, je nach Verwendungszweck. Im orthotopen Inokulation (ohne Mastektomie) Modell produzieren meist Primärtumor Euthanasie Größenkriterien (> 2 cm) ca. 21 Tage nach der Inokulation.
- 21 Tage nach der Krebs Zelle Inokulation von ex-Vivo Bildgebung Lunge metastatischen Läsionen zu quantifizieren.
- Die Mäuse mit 2-4 % Isofluran in einer dedizierten Induktion Kammer zu betäuben (siehe Punkt 3.1).
- Wiegen Sie die Mäuse.
- 150 mg/kg D-Luciferin intraperitoneale Injektion (siehe Punkt 5.6).
- Die Mäuse durch zervikale Dislokation, 15 min nach der Injektion einschläfern.
- Öffnen Sie den Bauch durch Schneiden der Haut und Bauchfell in der Mitte des Bauches, mit Mayo Schere gebogen. Den Schnitt auf der rechten und der linken zu verlängern. Herausziehen der Leberzellkrebs mit der Pinzette, bis das Zwerchfell visualisiert wird; dann schneiden Sie die Membran.
- Mit der gebogenen Mayo Schere schneiden die bilateralen Rippen aus kaudale (12. Rippen), kopfwärts (1. Rippen), die Lunge aussetzen durch Umklappen der vorderen Thorax-Wand.
- Identifizieren der thorakalen Ösophagus, die aussieht wie eine Schnur verbindet die Lunge an der Wirbelsäule durch Anheben der Lunge mit Pinzette und dann schneiden mit der Schere Mikrodissektion Speiseröhre.
- Heben Sie die bilateralen Lunge und Herz mit Zange (Anwendung Traktion herunterziehen, in Richtung der kopfwärts zu kaudale) und dann schneiden Sie die Luftröhre und die großen Schiffe an die Spitze der Lunge bei der kopfwärts, Mikrodissektion Schere verwenden.
Hinweis: Dies ermöglicht für die Isolierung von Lunge und Herz aus dem Körper. - Entfernen Sie das Herz aus der Lunge mit Mikrodissektion Schere.
- Legen Sie die Lungen in einer 10 cm Petrischale.
- Erfassen Sie das Abbild der Biolumineszenz (siehe Schritte 5.7.1 und 5.7.2) 5 min nach Euthanasie (20 min nach der Injektion von Luciferin).
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Representative Results
Orthotopen Modell soll imitieren menschlichen Krebs Fortschreiten (d. h., das Wachstum des Primärtumors gefolgt von Lymphknoten-Metastasen und dann entfernte Lunge Metastasen)15. Nach Krebs Zelle Inokulation, die Biolumineszenz wird quantifiziert, regelmäßig (zwei-bis dreimal / Woche) (Abbildung 1A). Die Biolumineszenz in der Lunge ist tiefer und kleiner als die primäre Läsion. Die Biolumineszenz spiegelt vor allem die primären Tumorlast in live Mäuse3 (Abbildung 1 b und 1 C). Die Größe des Tumors wurde ebenfalls durch Bremssattel Messung gemessen. Das Tumorvolumen wurde anhand der folgenden Gleichung geschätzt: Volumen = (Länge) x (Breite)22 (Abbildung 1). Quantifizierung der Tumorlast von Biolumineszenz und Bremssattel Messung zeigte ähnliche Tendenzen in die repräsentativen Ergebnisse (Abbildung 1 b und 1D); Allerdings stießen wir manchmal Diskrepanzen. Wir davon ausgehen, dass die Quantifizierung der primären Tumorlast nutzen Biolumineszenz genauer ist im Vergleich zu messen die Größe des Tumors durch Bremssattel, wenn die Größe des Tumors weniger als 1,5 cm ist. Weil es tragfähige reflektiert können Krebszellen, sogar, die eine kleine Anzahl von Zellen durch Biolumineszenz, erkannt werden kann, und nur Krebszellen innerhalb des Tumors, nicht einschließlich Immunzellen zu infiltrieren oder Umgebung Stromazellen Zellen3erkannt werden. Dieses Modell ist nützlich bei der Bewertung der Wirksamkeit der Tumor-Regression vermittelt durch Anti-Krebs-Medikament und Immunreaktionen3,7,16. Die Tumorlast von den Lungenmetastasen kann auch mit ex-Vivo imaging in diesem Modell (Abbildung 1E); quantifiziert werden die Einschränkung ist jedoch, dass die Mäuse eingeschläfert werden müssen, um die metastatische Tumorlast zu quantifizieren.
Die Mastektomie Modell soll (1) den Standard der Behandlung von menschlichen Brustkrebs, ist die chirurgische Entfernung des Primärtumors17, reproduzieren und (2) die serielle Quantifizierung von metastasierendem Tumorlast in-vivo ermöglichen. Dieses Modell eignet sich besonders in der präklinischen Studie der Entwicklung neuer Therapeutika13. Wie zuvor veröffentlicht, zeigte ein Src-Inhibitor, AZD0530, die Wirksamkeit in der präklinischen Mäuse-Modell zeigte aber konnte in einer klinischen Studie zur Behandlung von Brustkrebs, Wirksamkeit in der primären Läsion orthotopen Impfung ohne Mastektomie Nutzung aber nicht in der Lunge Metastasen unter Verwendung der Mastektomie-Modell vorgestellt. Obwohl Anti-Krebs-Medikamente (z. B. Anthrazykline) manchmal beim Menschen als neoadjuvante Therapie zur Behandlung von primären Brusttumoren verwendet werden, die überwiegende Mehrheit der Drogen als adjuvante Therapie dienen dem Medikamente nach der Operation gegeben werden um das Risiko eines erneuten Auftretens von Behandlung von klinisch nicht nachweisbar Krebs oder als palliative Behandlung von metastasierendem Krebs1,7,18. So entstand dieses Modell Mastektomie, die imitiert menschliche Behandlung Prozess11.
Acht Tage nach der Inokulation Krebs Zelle ist der primäre Tumor chirurgisch entfernt (Abbildung 2). Um die Droge Wirksamkeiten für metastatischen Läsionen zu testen, sollte es nach der Mastektomie administriert werden. Dieses Modell ermöglicht Lunge metastatischen Läsion Quantifizierung sowie Ganzkörper-metastatischen Läsion Quantifizierung, solange der metastatischen Tumorlast einen nachweisbaren Biolumineszenz, die Verwendung von in-vivo Bildgebung hat. Die vordere Brust Wand lokale Rezidivrate ist ziemlich niedrig. Unsere Erfahrung war die lokale Rezidivrate weniger als 5 % in mehr als 50 Mäuse Experimente. Allerdings übersteigt die postoperativen Tag 1 Biolumineszenz 1.00E + 06 Photonen (10 X größer als andere Personen), gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit von einem lokalen residual Tumor13. Wenn es Überbleibsel Krebszellen vorhanden, erscheint ein tastbarer Tumor innerhalb von zwei Wochen. Wann gibt es ein lokalen residualer Tumor, spiegelt die Biolumineszenz vor allem das Lokalrezidiv anstatt einer metastatischen Läsionen. Lokalen residuale Tumoren sind dafür bekannt, sehr anders als Fernmetastasen19Verhalten; Also, diese Tiere mit Lokalrezidiv (< 5 % unserer Erfahrung) sollte von einer weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Dieses Modell der Mastektomie ermöglicht auch serielle metastasiertem Tumor Belastung Überwachung ohne die Tiere einschläfern. Darüber hinaus kann diese Biolumineszenz Überwachung von ex Vivo Lunge Metastasen Quantifizierung bestätigt werden. Anstelle von Lungenmetastasen von ex-Vivo Bildgebung, so dass die Tiere einschläfern zu quantifizieren kann Mäuse Überleben nach der operativen Behandlung auch als übersetzbar klinischen Endpunkt (Abb. 2D) überwacht werden. Da gibt es keine primäre Läsion, Mäuse nicht erfüllen Euthanasie Tumor Kriterien in der Regel als einer Tumorgröße von definiert sind > 2 cm oder Ulzeration des Primärtumors. In diesem 4T1 Mastektomie Modell starben alle Mäuse innerhalb von 60 Tagen nach der Krebs Zelle Inokulation aufgrund von Metastasen.
Abbildung 1: Überblick über das orthotopen Modell ohne Mastektomie. (A) dieses Panel zeigt ein zeitlichen Verlauf der orthotopen Modell unter Verwendung der 4T1 Phänomen Modell. (B) dieses Panel zeigt die Ganzkörper-Biolumineszenz eines orthotopen Modells, vor allem der Primärtumor widerspiegelt. Der Fehlerbalken zeigt den Standardfehler des Mittelwerts (n = 10). (C) dieses Panel zeigt serielle Bilder von Ganzkörper-Biolumineszenz (der gleichen Maus). Der Maßstab zeigt 1 cm. (D) zeigt dieses Fenster die tatsächliche Tumorgröße zentrale B, Bremssättel gemessen. Der Fehlerbalken zeigt den Standardfehler des Mittelwerts (n = 10). (E) dieses Panel zeigt Lunge ex Vivo Biolumineszenz Bilder von 10 orthotopen Modellmäuse (n = 10). Der Maßstab zeigt 1 cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Übersicht über die Mastektomie Modell. (A) dieses Panel zeigt ein zeitlichen Verlauf der Mastektomie Modell nach 4T1 orthotopen Phänomen Implantation. Der Maßstab gibt an, dass 1 cm. (B) dieses Panel die Ganzkörper-Biolumineszenz des Modells Mastektomie zeigt vor allem metastatischen Läsion widerspiegelt. Der Fehlerbalken zeigt den Standardfehler des Mittelwerts (n = 10). (C) dieses Panel zeigt serielle Bilder von Ganzkörper-Biolumineszenz (der gleichen Maus). Verwendung von ex-Vivo Imaging, bestätigte, dass die Signale von Lungenkrebs Metastasen, und kein lokales Rezidiv durch Ganzkörper-Bildgebung nach Lunge entfernen bestätigt wurde. Maßstabsleiste = 1 cm. (D) dieses Panel zeigt die Kaplan-Meier überleben Kurve des Modells Mastektomie ohne keine medikamentöse Behandlung. Mäuse wurden eingeschläfert, wenn sie Euthanasie Kriterien bei jedem krankhaften Zustand erreicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Für das letzte Jahrzehnt etablieren wir mehrere murinen Krebs-Modelle, einschließlich Brust Krebs Modelle3,7,13,16,20,21. Bisher haben wir gezeigt, dass Brustkrebs Krebs Zelle orthotopen Inokulation in das Brustdrüsengewebe unter direkter Sicht einen größeren Tumor mit weniger Größe Variabilität im Vergleich zu injizierenden Zellen um die Brustwarze ohne einen chirurgischen Eingriff7 hergestellt . Dieses Modell wurde durch den Einsatz einer Zellsuspension in einer gallertartigen Proteinmischung auf verbessert. Die Formen des Tumors durch die gallertartige Protein Mischung suspendiert-Zellen erzeugt wurden rund mit weniger Variabilität, während diejenigen von PBS suspendiert Zellen erzeugt wurden in der Brustdrüse3verstreut.
Wir bestätigt weiter, dass die Tumoren durch hoch hier vorgestellte chirurgische orthotopen-Implantation-Methode erzeugt die Gene exprimiert, deren Interaktion Netze bei der Krebsentwicklung im Vergleich zu denen von nicht-chirurgische oder subkutane erzeugt wichtig sind Injektion-7. Diese Ergebnisse bedeuten, dass dieses Modell menschlichen Brustkrebs besser im Vergleich zu nicht-chirurgische Orthotopic oder subkutane Implantation7imitiert. Wir zeigen auch, dass dieses Modell geeignet, die immun-vermittelte Regression von Brustkrebs mit allogenen Ablehnung3zu bewerten ist. Hautschnitt kann jedoch auch Entzündung um den Tumor14führen. Daher je nach der Hypothese durch den Prüfer getestet, ist es wichtig, die Entzündung als mögliche verwirrende Faktor zu betrachten.
Als die neoadjuvante festlegen sind nach der primären Brusttumor chirurgisch entfernt11ist die überwiegende Mehrheit der systemische Therapien verabreicht. Heute bewerten die Mehrheit der präklinischen Studien zur Entwicklung neuer Arzneimittel Medikament Reaktion in den primären Tumor, aber nicht in der metastatischen Läsionen1,18. Diese Diskrepanz zwischen Tiermodelle und menschliche Behandlung ist wichtig, weil das Gen Profil der metastatischen Läsionen ist erheblich von denen der primären Läsion22hat wichtige Implikationen für Krebsbiologie und Behandlung , vor allem im Zeitalter der gezielten Therapie22. Daher sollte die Wirksamkeit des Medikaments für die adjuvante Therapie in der metastatischen Läsionen, nicht nur in der Primärtumor ausgewertet werden. Wir überprüft das Timing der Lymphknoten und Lunge Metastasenbildung nach orthotopen Inokulation erfolgt unter Verwendung der 4T1 Brust Krebs orthotopen Modell16. Wir zeigten auch, dass eine Resektion des Primärtumors überleben in der metastasierendem Brustkrebs unter Verwendung der Mastektomie Modell23verbessert. Dadurch versuchten wir, eine Mastektomie-Modell nach der orthotopen Krebs Zelle Implantation zu etablieren. Jedoch war eine lange Zeit aufgewendet, um diese niedrigen Lokalrezidiv Modell aufzubauen. Da Krebszellen durch chirurgischen Eingriff injiziert werden, Wandern Krebszellen leicht in die Wunde. Darüber hinaus dringen Krebszellen Gewebe in direktem Kontakt mit den Tumor, wie die umgebende Wand Brustmuskel und die Haut. Die Krebszellen metastasieren auch in axillären Lymphknoten ohne Bildung einer sichtbaren axillären Mass zum Zeitpunkt der Mastektomie. Während den Tumor entfernen ein einfacher Technik sein kann, ist dies also nicht übersetzbar, Mastektomie in der Behandlung von Brustkrebs als Lokalrezidiv13verursacht. So wurde dieses "radikalen Mastektomie Modell" gegründet, um alle Krebszellen entfernen der vorderen Brustwand und axillären Lymphknoten-Becken, wie in Abbildung 2beschrieben. Wir bestätigt Lunge Metastasen durch Histologie und Lunge ex Vivo Bildgebung und gab es keine glänzenden Läsion vorhanden ist durch Ganzkörper-Bildgebung nach Lunge entfernen. In diesem 4T1 orthotopen Modell metastasieren Krebszellen schließlich zu den Lungen, in allen Fällen innerhalb von 21 Tagen. Das Timing der Metastasierung hängt jedoch von der Größe des Primärtumors; so weniger Primärtumor Größe ist Variabilität wichtig für die Überwachung nicht nur der Primärtumor, sondern auch der metastatischen Tumorlast. Mithilfe der gallertartigen Proteinmischung kann Tumor Größe Variabilität minimiert werden. Die gallertartige Proteinmischung kann jedoch auch der Tumor Mikroumgebung beeinflussen. Daher sollte das Potenzial Störfaktoren gallertartige Protein Mischung Verwendung zugeordnet, abhängig von der Hypothese des Prüfers betrachtet werden.
Mit Hilfe dieser Techniken und Luciferase exprimierenden Krebszellen Tumor Belastung Quantifizierung mit weniger Messfehler, auch in nicht-tastbaren Tumoren ermöglichen. Es gibt zwei Reporter Systeme, Biolumineszenz und Leuchtstofflampen, die Signale mit lebenden Tieren zu visualisieren. Während berichtet wurde, dass das Signal der Biolumineszenz und Fluoreszenz hell genug für die Quantifizierung, sein kann, wenn das Ziel-Signal sehr niedrig ist, ist das Hintergrundsignal der Fluoreszenz höher, wodurch die Genauigkeit des Tests. Im Gegensatz dazu wird Biolumineszenz mit größerer Genauigkeit an einem niedrigeren Signal mit weniger Hintergrund Störungen24erkannt. Entsprechend den meisten Ermittler Biolumineszenz Reporter Systeme Live verwenden möchten Tierversuche24,25. Tumor Belastung Quantifizierung von Biolumineszenz hat jedoch ihre Grenzen. Luciferase exprimierenden Zellen leuchten wenn Luciferin der Krebszellen durch kardiovaskuläre Perfusion26erreicht. Wenn die Läsion eine Fläche von Hypoxie und/oder Hypoperfusion hat, Luciferin ist nicht an die Zellen geliefert und der Biolumineszenz-Wert könnte, dann niedriger als die tatsächliche Tumorlast zu gemessen werden. In der Tat haben wir unangemessen Biolumineszenz Quantifizierung erlebt, wenn die Größe des Tumors mehr als 1,5 cm erreicht. Wir gehen davon aus, dass es aufgrund der beschriebenen hypoxischen und/oder Hypoperfused Zustand. Also, wenn der Tumor eine tastbare Größe erreicht, wird die Tumorlast durch Biolumineszenz und Bremssattel Messung quantifiziert. Eine wichtige Einschränkung der Biolumineszenz Quantifizierung zu prüfen ist das schwarze Fell der Mäuse. Selbst wenn das Fell entfernt wird, gibt es Pigmentflecken auf der Haut-27. Während Biolumineszenz detektiert und bei Mäusen mit schwarzem Fell quantifiziert, es sinkt, und daher ist es wichtig, Mäuse Fell gleichfarbige miteinander zu vergleichen, um die verwirrende Auswirkungen der Fellfarbe auf Biolumineszenz Quantifizierung zu reduzieren. Die Verwendung von Luciferase exprimierenden Zellen bietet einige einzigartige Modalitäten für die Studie. Zum Beispiel kann secretable Luciferase Tumor Belastung Quantifizierung durch Messung Blut oder Urin Biolumineszenz28zur Verfügung. In das vorgestellte Modell hier direkte Tumor Belastung Quantifizierung von lebensfähigen Krebszellen mit lebenden Tieren mit nicht secretable Luciferase ist einfach und unkompliziert, das ist nicht erforderlich, Blut oder Urin Proben.
Ähnlich wie die Modelle, die hier, die Produktion von mehr vorgestellt effiziente Tierversuch durch die Herstellung einer höhere Erfolgsquote bei der Tumorgenese mit weniger Variabilität ist Schlüssel für die Funde beweisen. Des gegenwärtigen Modells sobald ein Ermittler die Technik erlernt hat, ist es leicht zu eine Rate von 100 % Tumorgenese zu erreichen. Wir erreichten auch Tumorgenese höher als die Modelle, die wir eingeführt haben; Darüber hinaus haben wir ein Doppelpunkt Krebs orthotopen Modell Nutzung Zellsuspension in einer gallertartigen Proteinmischung, zusammen mit Biolumineszenz-Technologie, der Tumor Belastung21zu quantifizieren. Zusammenfassend bietet hier vorgestellten Tiermodell eine geeignete Mausmodell um Krebs-Studie durchzuführen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NIH Grant R01CA160688 und Susan G. Komen Foundation Investigator initiierten Research Grant (IIR12222224), k.t. Mäuse unterstützt, die Biolumineszenz Bilder von freigegebenen Ressource Translational Imaging freigegebene Ressource am Roswell Park erworben wurden Comprehensive Cancer Center, das von der Cancer Center Support Grant (P30CA01656) und Shared Instrumentierung Grant (S10OD016450) unterstützt wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissection Scissors | Roboz | RS-5983 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Adson Forceps | Roboz | RS-5233 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Needle Holder | Roboz | RS-7830 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Mayo | Roboz | RS-6873 | For ex vivo |
| 5-0 silk sutures | Look | 774B | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Dry sterilant (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Clipper | Wahl | 9908-717 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Matrigel | Corning | 354234 | For cancer cell inoculation |
| D-Luciferin, potassium salt | GOLD-Bio | LUCK-1K | For bioluminescence quantification |
| Roswell Park Memorial Insitute 1640 | Gibco | 11875093 | For cell culture |
| Fetal Bovine Serub | Gibco | 10437028 | For cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | For cell culture |
References
- Rashid, O. M., Takabe, K. Animal models for exploring the pharmacokinetics of breast cancer therapies. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 11 (2), 221-230 (2015).
- Schuh, J. C. Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice. Toxicologic Pathology. 32, 53-66 (2004).
- Katsuta, E., et al. Modified breast cancer model for preclinical immunotherapy studies. Journal of Surgical Research. 204 (2), 467-474 (2016).
- Sidell, D. R., et al. Composite mandibulectomy: a novel animal model. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 146 (6), 932-937 (2012).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Research. 25, 3905-3915 (2005).
- Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Rashid, O. M., et al. An improved syngeneic orthotopic murine model of human breast cancer progression. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (3), 501-512 (2014).
- Bertozzi, S., et al. Prevalence, risk factors, and prognosis of peritoneal metastasis from breast cancer. SpringerPlus. 4, 688 (2015).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Valero, M. G., Golshan, M. Management of the Axilla in Early Breast Cancer. Cancer Treatment and Research. 173, 39-52 (2018).
- National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf (2018).
- Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
- Katsuta, E., Rashid, O. M., Takabe, K. Murine breast cancer mastectomy model that predicts patient outcomes for drug development. Journal of Surgical Research. 219, 310-318 (2017).
- Veenhof, A. A., et al. Surgical stress response and postoperative immune function after laparoscopy or open surgery with fast track or standard perioperative care: a randomized trial. Annals of Surgery. 255 (2), 216-221 (2012).
- Wei, S., Siegal, G. P. Surviving at a distant site: The organotropism of metastatic breast cancer. Seminars in Diagnostic Pathology. 35 (2), 108-111 (2018).
- Nagahashi, M., et al. Sphingosine-1-phosphate produced by sphingosine kinase 1 promotes breast cancer progression by stimulating angiogenesis and lymphangiogenesis. Cancer Research. 72 (3), 726-735 (2012).
- Jones, C., Lancaster, R. Evolution of Operative Technique for Mastectomy. Surgical Clinics of North America. 98 (4), 835-844 (2018).
- Rashid, O. M., Maurente, D., Takabe, K. A Systematic Approach to Preclinical Trials in Metastatic Breast Cancer. Chemotherapy (Los Angeles). 5 (3), (2016).
- Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nature Genetics. 33 (1), 49-54 (2003).
- Aoki, H., et al. Murine model of long-term obstructive jaundice. Journal of Surgical Research. 206 (1), 118-125 (2016).
- Terracina, K. P., et al. Development of a metastatic murine colon cancer model. Journal of Surgical Research. 199 (1), 106-114 (2015).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Rashid, O. M., et al. Resection of the primary tumor improves survival in metastatic breast cancer by reducing overall tumor burden. Surgery. 153 (6), 771-778 (2013).
- Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
- Adams, S. T. Jr, Miller, S. C. Beyond D-luciferin: expanding the scope of bioluminescence imaging in vivo. Current Opinion in Chemical Biology. 21, 112-120 (2014).
- Close, D. M., Xu, T., Sayler, G. S., Ripp, S. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors (Basel). 11 (1), 180-206 (2011).
- Chen, H., Thorne, S. H. Practical Methods for Molecular In Vivo Optical Imaging. Current Protocols in Cytometry. 59 (1224), (2012).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Aoki, H., et al. Host sphingosine kinase 1 worsens pancreatic cancer peritoneal carcinomatosis. Journal of Surgical Research. 205 (2), 510-517 (2016).
