Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

יצירת מודל של סרטן שד גרורתי Orthotopic מאתר וביצוע מאתר כריתה רדיקלית

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57849
Automatic Translation
1, 1, 2,3,4,5, 1,6,7,8,9,10
1Breast Surgery, Department of Surgical Oncology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, 2Holy Cross Hospital Michael and Dianne Bienes Comprehensive Cancer Center, 3Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 4Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Nova Southeastern University School of Medicine, 6Department of Surgery, University at Buffalo Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, 7Department of Breast Surgery and Oncology, Tokyo Medical University, 8Department of Surgery, Yokohama City University, 9Department of Surgery, Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences, 10Department of Surgery, Fukushima Medical University

Summary

אנחנו מציגים את orthotopic מאתר השד סרטן ומודל כריתה רדיקלית בטכנולוגיה ביולומינסנציה לכמת את נטל הגידול לחקות התקדמות סרטן השד אנושי.

Abstract

מודלים העכבר in vivo כדי להעריך את התקדמות סרטן השד חיוניים לחקר הסרטן, כולל פיתוחים סמים פרה. עם זאת, הרוב המכריע של פרטים טכניים מעשיים מושמטים נפוץ ב לאור כתבי יד מה, לכן, שהופך את זה מאתגר לשחזר את הדגמים, במיוחד כשזה כרוך טכניקות ניתוחיות. ביולומינסנציה הטכנולוגיה מאפשרת על ההערכה של כמויות קטנות של תאים סרטניים גם כאשר הגידול הוא לא מוחשי. ניצול לבטא לוציפראז תאים סרטניים, אנחנו לבסס טכניקה חיסון orthotopic של סרטן השד, בקצב גבוה tumorigenesis. גרורות בריאה שקובעת ניצול של שמחוץ טכניקה. ואז, להקים מודל כריתה עם שיעור הישנות מקומית נמוכה כדי להעריך את נטל גידול גרורתי. במסמך זה, אנו מתארים, בפירוט, טכניקות כירורגיות של orthotopic-השרשה ו כריתה לסרטן השד עם שיעור גבוה tumorigenesis ו שיעורי הישנות מקומית נמוכה, בהתאמה, כדי לשפר את יעילות מודל של סרטן השד.

Introduction

מודלים בעלי חיים לשחק תפקיד מפתח בחקר הסרטן. כאשר השערה זה הוכח במבחנה, זה צריך להיבדק ויוו להערכת הרלוונטיות הקלינית שלה. התקדמות סרטן, גרורות לעיתים קרובות יותר בשבי על ידי מודלים בעלי חיים לעומת מודלים במבחנה, זה חיוני כדי לבדוק תרופה חדשה במודל חיה כמו מחקר קליני סמים פיתוח1,2. עם זאת, הפרטים הטכניים של ניסויים בבעלי חיים מתוארים לעתים קרובות לא טוב המאמרים שפורסמו, שהופך אותו מאתגר לשחזר את המודל בהצלחה. אכן, המחברים שהקים חיסון ו כריתה מודלים אלה orthotopic עברה תהליכים ארוכים קפדני של ניסוי וטעייה. שיעור ההצלחה של tumorigenesis לאחר חיסון תאי סרטן הוא אחד הגורמים מפתח כדי לקבוע את ההצלחה ואת היעילות של חיים לומדים3. את שורת התאים את מספר התאים כדי לחסן חיסון באתר, את המתח של העכברים גורמים חשובים כל בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. זה ידוע כי ישנם וריאציות ענקי בתוצאות של ניסויים בבעלי חיים בשל הבדלים אישיים, לעומת טכניקות הפרייה. לכן, באמצעות מודל ומבוססת עם טכניקה סטנדרטית היא חשובה להשיג תוצאות יציב, כדי לשפר את היעילות של ניסויים בבעלי חיים, וכדי למנוע תוצאות מטעות.

מאמר זה מספק טכניקות ומבוססת4 להפקת השד סרטן orthotopic ו כריתה העכבר מודלים. המטרות של שיטות אלה הן 1) כדי לחקות התקדמות סרטן השד אנושי וקורסי טיפול ו- 2) כדי לערוך ניסויים ויוו עם שיעור הצלחה גבוה יותר לעומת אחרים חיסון סרטן השד או כריתת שד טכניקות ויעילות רבה יותר. Orthotopic סרטן תאי חיסון, כדי לחקות את התקדמות סרטן השד אנושי, אנחנו לבחור כרית שומן החלב #2 כאתר חיסון, אשר ממוקם באזור החזה. ברוב המחקרים, תאים סרטניים בשד מחוסנים subcutaneously5. טכניקה זו אינה דורשת ניתוח, לפיכך, הוא פשוט וברור. עם זאת, microenvironment תת עורית שונה לגמרי microenvironment בלוטת חלב, שתוצאתה התקדמות סרטן שונים ופרופילים אפילו מולקולרית6,7. מספר מחקרים להשתמש בלוטת החלב #4, הממוקמת בחלל הבטן, כמו האתר חיסון6. אולם, מאז #4 עטין נמצאים בחלל הבטן, הדפוס גרורתי השכיח ביותר הוא גרורות בחלל הצפק7, אשר מתרחשת עם פחות מ- 10% של סרטן שד גרורתי8. סרטן השד שנוצר על ידי הטכניקה המובאת כאן, בבלוטת החלב #2, מתפשט אל הריאות, אשר הוא אחד הנפוצים ביותר השד סרטן גרורתי אתרי9.

בטכניקה זו, המטרה היא גם להשיג שיעור גבוה יותר של tumorigenesis עם השתנות גודל הגידול מינימלי לעומת טכניקות חיסון אחרות סרטן השד. כדי לעשות זאת, תאים סרטניים מושעה בתערובת חלבון ז'לטין מחוסנים תחת חזון ישירה דרך חתך קיר החזה הקדמי החציוני. טכניקה זו מפיקה קצב tumorigenesis גבוהה עם פחות השתנות גידול בגודל וצורה לעומת הזרקה תת עורית או ניתוחי, כפי שדווחה בעבר3,7.

אנחנו מוסיפים גם טכניקה כריתה רדיקלית העכבר שבו הגידול השד orthotopic הוא resected עם הרקמות הסובבות ואת בלוטות הלימפה בבית השחי. בהגדרה קלינית, רמת הטיפול לחולי סרטן השד ללא גרורות רחוקות המחלה הוא כריתה10,11. לפני כריתת שד, לנתיחה הלימפה בבית השחי הצומת גרורות הוא שנסקרו על ידי הדמיה ו בלוטת הזקיף ביופסיה. אם אין עדות לנתיחה הלימפה בבית השחי הצומת גרורות, החולה ואז מטופל עם כריתה מוחלט או חלקי, שבו ההסרה לנתיחה הלימפה בבית השחי הצומת מושמט. סך כריתה היא טכניקה לכרות את סרטן השד עם רקמת השד כולו en bloc, בעוד כריתה חלקית היא לכרות את סרטן השד עם שוליים של סביב רקמת השד רגיל בלבד, ובכך שימור רקמת השד רגיל הנותר אצל החולה. עם זאת, חולים אשר לשמר שנותרו רקמת השד רגיל לאחר כריתה חלקית לדרוש הקרנות לאחר הניתוח כדי למנוע הישנות מקומית10. מטופלים עם לנתיחה הלימפה בבית השחי הצומת גרורות מתחייב כריתה רדיקלית אשר מסיר את סרטן השד עם נורמלי כל השד רקמות, בבית השחי הלימפה, פלש לרקמות en גוש10,11. במודל עכבר, מעקב לנתיחה הלימפה בבית השחי הצומת גרורות ו/או שלאחר קרינה אינה סבירה או ריאלי. לפיכך, אנו מנצלים את הטכניקה כריתה רדיקלית כדי למנוע גרורות הצומת לימפה מקומיות או בבית השחי.

חיסון תאי סרטן דרך הווריד הזנב של הוא הנפוץ ביותר ריאות גרורות העכבר מודל12, מה שנקרא "גרורות ניסיוני". מודל זה קל ליצור, ללא צורך בניתוח; עם זאת, זה לא לחקות התקדמות סרטן השד אנושי והתוצאה עשויה להיות התנהגות שונים במחלה גרורתית. כדי לחקות את הקורס לטיפול סרטן השד אנושי שבו גרורות מתרחש לעיתים קרובות לאחר כריתת שד, הגידול העיקרי הוא הוסר לאחר חיסון תאי סרטן orthotopic. טכניקה זו מייצרת פחות המקומיים הישנות לעומת כריתה הגידול פשוטה, כפי שדווחה בעבר13, והיא שימושית על הריפוי, מחקרים פרה, ועל מחקרים סרטן שד גרורתי. מהטכניקות שתוארו כאן חלים עבור רוב השד סרטן orthotopic דגם הניסויים. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון כי התערובת חלבון כמו ג'לי יכול להשפיע על microenvironment, ניתוח יכול להשפיע על התגובה החיסוניתמתח/14. לכן, החוקרים ללמוד את microenvironment ו/או מתח/מערכת החיסון צריך להיות מודע של פוטנציאל משתנה מתערב גורמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אישור מן רוזוול פארק מקיף סרטן מרכז מוסדי חיה אכפת לי להשתמש ועדת הושג עבור כל הניסויים.

הערה: תשע שנים עשר שבועות בת נקבה BALB/c לעכברים מתקבלים. תאים 4T1-luc2, העכבר החלב אדנוקרצינומה תא קו נגזר BALB/c עכברים תוכנן כדי לוציפראז אקספרס, משמשים. תאים אלה מתורבתים במדיום 1640 המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) עם 10% סרום שור עוברית (FBS).

1. הכנת כלי נגינה

  1. הפשרת תערובת חלבונים כמו ג'לי קפוא (למשל, Matrigel) על הקרח בשכונה תרביות רקמה.
  2. ונקי אוטוקלב שני סטים של כלי ניתוח (מספריים microdissection לאדאמסון מלקחיים, בעל מחט) לפני הניתוח. להכין 5-0 סטיריליים התפרים משי ויבש sterilant (כאשר טורי ניתוחים מתוכננים).
  3. קליפ על שיער החזה האמצעי של העכברים שימוש בטלוויזיה ולסמן העכברים לזיהוי על ידי ניקוב האוזן לשעת הניתוח.
  4. להכין את השולחן בהליך, אשר יכול לשמש באופן מיידי עבור הפעולה.
    1. להפיץ את רכיב pad סופג, לתקן את הפינות עם הקלטת, לתקן את הקונוסים האף הרדמה עם הקלטת, את sterilant ואת חיטוי (chlorhexidine יוד, 75% אתנול) לצד המרחב, ולמקם העכברים הסדר מבצע.

2. הכנה של תאים (עכברים 10)

הערה: התאים צריכים לקבל חיסון בתוך 1 h לאחר ניתוק מן המנה כדי למנוע ירידה תא הכדאיות. באופן ספציפי, התליה תא צריך להיות מעורב לתוך התערובת חלבון ז'לטין בתוך 15 דקות לאחר ניתוק תאים מן המנה כדי לשמור על יכולת הקיום שלהם.

  1. התרבות התאים 4T1-luc2, קו תא החלב אדנוקרצינומה העכבר לבטא לוציפראז, בתקשורת RPMI 1640 עם 10% FBS ב חממה humidified ב 37 ° C 5% CO2.
  2. לשטוף את התאים 4T1 חסיד-luc2 בצלחת ס מ-10 עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ. להוסיף 1 מ"ל של טריפסין 0.25% באמצעות פיפטה P1000, ואז, דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. לאחר מכן, הוסף 4 מ"ל של צמיחה מדיה (RPMI-1640 עם 10% FBS) באמצעות סרולוגית 5 מ ל פיפטה ולהעביר התליה תא צינור חרוטי 15-mL בשכונה תרביות רקמה. Centrifuge התליה תא ב x 180 גרם במשך 5 דקות.
  3. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend תאי 2 מ של PBS; ואז, לספור את התאים באמצעות את hemocytometer.
  4. להשעות 2 x 106 תאים 4T1-luc2 μL 40 ל- PBS קר (pH 7.4, 4 ° C) בשכונה תרביות רקמה.
  5. מערבבים התליה תא 40-μL עם μL 360 של תערובת חלבונים כמו ג'לי בצינור microcentrifuge 1.5 mL על הקרח בשכונה תרביות רקמה.
    הערה: הריכוז הסופי הוא עונה 1 פרק 105/20 μL (1:9 PBS: תערובת החלבון כמו ג'לי). עבור המודל orthotopic (ללא כריתת שד), שימש μL4/20 1 פרק 10 של הריכוז הסופי, כדי להימנע להגיע קריטריונים המתת חסד (גידול בגודל > 2 ס מ) תוך שבועיים.

3. סרטן תאי חיסון

  1. את העכברים בבית הבליעה אינדוקציה הרדמה עם 2-4% איזופלוריין ו- 0.2 L/min זרימת חמצן עד העכברים לנשום בשקט (2-3 דקות).
  2. לתפוס את העכבר, להזריק 0.05 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין לתוך כתפו subcutaneously.
  3. לאשר הרדמה נאותה על ידי חוסר תגובה קמצוץ הבוהן. הכנס את האף של העכבר לתוך החור של המסכה העכבר, המאפשר הרדמה inhalational עם איזופלוריין 2-4%, 2 ל'/min זרימת חמצן המצורפת יחידה מיכל פחם.
  4. לרסן את הגפיים של העכבר באמצעות הקלטת למעבדה, לחטא את העור באמצעות chlorhexidine יוד, 75% אתנול, באמצעות ספוגיות כותנה.
  5. עושים חתך בעור 5 מ מ באמצע קיר החזה הקדמי ניצול microdissection סטרילי מספריים, להרים צד ימין העור ליד החתך לנתק את העור מן הקיר החזה בעזרת המספריים ואני, להפוך את העור כדי לחשוף את הזכות #2 כרית שומן החלב.
  6. בזהירות להזריק μL 20 של השעיה התא סרטן באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט 28.5 G אל תוך כרית שומן תחת חזון ישירה דרך הפצע.
    הערה: המחט עובר את הפצע, לא על העור. תמשיך להחזיק את המחט בלוח השמן לפני s 5 מושכת אותו החוצה, המאפשר זמן התערובת חלבון ז'לטין לגבש.
  7. לסגור את החתכים העור על ידי תפרים, בעזרת תפרים נספגים סטרילי 5-0.
  8. לאחר הניתוח, להחזיר את החיות כלוב נקי, לפקח עליהם עד שהם התאוששו עוברים באופן חופשי (לאחר ~ 1-2 דקות). אם חיים אינו מופיע להיות במצב בריאותי טוב בתוך 24 שעות של ניתוח, לנהל הבופרנורפין (0.2 מ ג/ק ג).
  9. להסיר את התפרים בהרדמה (ראה שלב 3.1) d 7 לאחר הניתוח.

4. כריתה

הערה: העיתוי של שיווי משקל חשוב מאוד. אם עושים את זה מוקדם מדי, גרורות ריאה לא יתרחש. אם זה נעשה מאוחר מדי, הגידול העיקרי פלש כלי הדם הגדולים, אשר עושים כריתה oncologic מלאה מאתגרת. לפיכך, מספר נקודות זמן נבדקו עבור כריתה לקבוע באיזו נקודת זמן המיוצר על האיזון המתאים מחכה גרורות לפני כריתה הפכה גם מאתגר. לאחר שתעשה זאת בניסויים העכבר מעל 50, הוכח כי כריתה-8 ימים לאחר חיסון תאי הסרטן (או כאשר גודל הגידול מגיע ל- 5 מ מ) היה האידיאל זמן המצביעים על מנת להשיג איזון13.

  1. עזים ומתנגד עכבר עם 2-4% בשאיפה איזופלוריין ולהזריק. הבופרנורפין (ראה שלבים 3.1 ו- 3.2).
  2. לרסן את העכבר או לחטא את העור שלה (ראה שלב 3.4).
  3. עושים חתך בעור 5 מ מ 2 מ מ שמאלה לפי הצלקת כירורגי שבוצע ב חיסון תאי סרטן ראשוני בעזרת המספריים microdissection. להרחיב את החתך לכיוון הבסיס של forelimb כדי להסיר את הגידול, העור כולל את הצלקת כירורגי הנגע בקשר עם הגידול, כמו גם את אגן לנתיחה הלימפה בבית השחי הצומת שבה רוב הזמן אין הצומת לימפה גלוי קיים בזמנו של mastect מקורקעת13. ודא שלא יגרמו נזק את הווריד בבית השחי.
  4. לסגור את הליקויים העור על ידי תפרים, בעזרת תפרים נספגים סטרילי 5-0 בצורה של "Y".
  5. כמו שלב 3.8, להחזיר את העכבר כלוב נקי, צג, עד הם התאוששו.
  6. להסיר את התפרים בהרדמה (ראה שלב 3.1) 7 ימים לאחר הניתוח.

5. ביולומנאסן כימות של הגידול העיקרי (Orthotopic חיסון ללא כריתה) או גרורות ריאה (כריתה מודל)

הערה: על כימות נטל הגידול העיקרי, ביולומינסנציה הוא נמדד 2 x שבוע מיום לאחר חיסון orthotopic. על כימות גרורות ריאה, ביולומינסנציה הוא נמדד 2 x שבוע מיום לאחר כריתת שד.

  1. להמיס D-luciferin באגירה פוספט תמיסת מלח של Dulbecco (DPBS) כדי ריכוז סופי של 15 מ"ג/מ"ל בשכונה תרביות רקמה. Aliquot זה לתוך הצינור מוגן אור mL 1.5 microcentrifuge צינורות. חנות הפתרון מדולל ב-80 מעלות צלזיוס.
    הערה: עבור עכבר 20 גרם, נדרש µL 200 של D מדולל-luciferin.
  2. פתח את תוכנת הדמיה ולחץ לאתחל.
    הערה: זה לוקח בערך 15 דקות לצנן את תשלום מצמידים מכשיר (CCD). כאשר ה-CCD מגיע לטמפרטורה להגדיר, הצבע של שורת הטמפרטורה משתנה מאדום לירוק.
  3. עזים ומתנגד העכברים עם 2-4% איזופלוריין בתוך תא ייעודי אינדוקציה לפני הדמיה (ראה שלב 3.1).
  4. שוקלים העכברים.
  5. להזריק 150 מ"ג/ק"ג של D-luciferin intraperitoneally בנקודת אמצע הבטן, באמצעות מחט 28.5 G.
  6. התאם כל עכבר עם קונוס האף בתוך המערכת הדמיה במצב פרקדן (מקום מקסימלית של עכברים חמש באותו זמן). לשמור על הרדמה בבית איזופלוריין 1% - 3% (ב 100% חמצן) דרך הקונוסים האף במהלך דימות.
  7. לכידת תמונה כל 5 דקות כדי לזהות את ביולומינסנציה שיא למשך 50 דקות (או עד ביולומינסנציה את שיא מאושרות).
    1. בחר הארה אוטומטי, Binning כמו בינוני, שדה ראייה D.
    2. לחץ על ייבוא כדי ללכוד את התמונה.
  8. העכברים לשוב cage(s) שלהם, לפקח עליהם עד שהם התאוששו (ראה שלב 3.8).

6. ריאות גרורות הגידול נטל כמת על ידי הדמיה Vivo לשעבר

הערה: כימות גרורות ריאה ישימה עבור חיסון orthotopic גם עם וגם בלי מודלים כריתה. במודל כריתה, נבחר שמחוץ לדימות או הישרדות תצפית, בהתאם למטרה. במודל חיסון (ללא כריתה) orthotopic, ברוב המקרים לייצר קריטריונים המתת חסד גודל הגידול העיקרי (> 2 ס מ) כ 21 ימים לאחר חיסון.

  1. לכמת ריאות גרורתי נגעים 21 ימים לאחר חיסון תאי סרטן על ידי ex-vivo הדמיה.
  2. עזים ומתנגד העכברים עם 2-4% איזופלוריין בתוך תא ייעודי אינדוקציה (ראה שלב 3.1).
  3. שוקלים העכברים.
  4. להזריק 150 מ"ג/ק"ג D-luciferin intraperitoneally (ראה שלב 5.6).
  5. המתת חסד העכברים מאת נקע בצוואר הרחם, 15 דקות לאחר הזריקות.
  6. לפתוח את הבטן על ידי גזירה את העור ואת צפק בבטן באמצע, באמצעות מספריים מאיו מעוקל. להרחיב את החתך גם ימינה וגם שמאלה. משוך החוצה את הכבד עם מלקחיים עד הסרעפת הוא מדמיין; . תעצור את הסרעפת.
  7. בעזרת המספריים מאיו מעוקל, לחתוך לצלעות בילטראליים מ caudad (12 צלעות) כדי cephalad (צלעות 1) לחשוף את הריאות על ידי flipping לקיר בית החזה הקדמי.
  8. לזהות את הוושט בית החזה, אשר נראה כמו חוט מתחבר בריאות עמוד השדרה, על ידי הרמת הריאות באמצעות מלקחיים וחותכים, ואז, הוושט באמצעות מספריים microdissection.
  9. הרם את הדו-צדדיים הריאות והלב באמצעות מלקחיים (החלת המתיחה מושך למטה, לכיוון של cephalad עד caudad), ואז לחתוך את קנה הנשימה וכלי מרכזי אל השיא ריאות ב cephalad, באמצעות מספריים microdissection.
    הערה: דבר זה מאפשר ניתוקה של הריאה והלב מן הגוף.
  10. הסר את הלב של הריאה באמצעות מספריים microdissection.
  11. הכניסו את הריאות 10 ס מ פטרי.
  12. ללכוד את התמונה ביולומינסנציה (ראה שלבים 5.7.1 ו 5.7.2) 5 דקות לאחר המתת חסד (20 דקות אחרי הזריקה luciferin).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מטרת המודל orthotopic היא לחקות את התקדמות סרטן אנושי (קרי, את צמיחת הגידול העיקרי ואחריו גרורות הצומת לימפה, גרורות ריאה אז רחוקים)15. לאחר חיסון תאי סרטן, ביולומינסנציה לכמת באופן קבוע (שתיים עד שלוש פעמים / שבוע) (איור 1 א'). ביולומינסנציה הריאות הוא עמוק יותר, קטן יותר הנגע העיקרי. ביולומינסנציה משקפת בעיקר את נטל הגידול העיקרי עכברים חיים3 (איור 1B וג 1). גודל הגידול נמדדה גם על ידי מדידה caliper. אמצעי האחסון הגידול הוערך באמצעות המשוואה הבאה: נפח = (אורך) x (רוחב)2/2 (איור 1D). כימות נטל הגידול על ידי ביולומינסנציה ומדידה caliper הראה מגמות דומות בתוצאות נציג (איור 1B וד' 1); עם זאת, לפעמים נתקלנו באי התאמות. אנחנו מניחים לכימות את נטל הגידול העיקרי ניצול ביולומינסנציה היא מדויקת יותר בהשוואה למדידת גודל הגידול על ידי caliper כאשר גודל הגידול הוא פחות מ- 1.5 ס מ. בגלל שהיא משקפת קיימא תאים סרטניים, אפילו שמספר קטן של תאים ניתן להבחין ביולומינסנציה, ולא רק תאים סרטניים יכולים להתגלות בתוך הגידול, לא כולל שחדר תאים חיסוניים או סביב תאי סטרומה3. המודל הזה הוא שימושי בהערכת יעילותם של רגרסיה הגידול מתווכת על-ידי תרופות נגד סרטן ו תגובות חיסוניות3,7,16. גם ניתן לכמת את נטל הגידול של הגרורה הריאה על ידי ex-vivo הדמיה במודל זה (איור 1E); עם זאת, המגבלה היא כי העכברים חייב להיות מורדמים לכמת את נטל גידול גרורתי.

מטרת המודל כריתת שד הוא 1) לשחזר את הסטנדרט של טיפול לטיפול בסרטן השד אנושי, אשר הינו הליך כירורגי של הגידול העיקרי17, ולאפשר 2) כימות סדרתי את נטל גידול גרורתי ויוו. מודל זה שימושי במיוחד במחקר קליני של ההתפתחות של הריפוי13. כפי שפורסמו בעבר, מעכב Src, AZD0530, אשר הראה יעילות במודל של עכברים פרה אבל נכשל בניסוי קליני לטיפול בסרטן השד, הראו יעילות ניצול orthotopic חיסון ללא כריתת הנגע העיקרי, אבל לא גרורות בריאה ניצול המודל כריתה הציג כאן. למרות תרופות נוגדות סרטן (למשל, anthracyclines) משמשים לפעמים בבני כטיפול neoadjuvant לטיפול גידולים בשד העיקרי, הרוב המכריע של סמים משמשים כטיפול אדג'וונט איפה סמים ניתנות לאחר הניתוח כדי להפחית את הסיכון להישנות על ידי בטיפול קליני לגילוי סרטן או כטיפול פליאטיבי עבור סרטן גרורתי1,7,18. לכן, מודל זה כריתה הוקמה, אשר מחקה את תהליך טיפול אנושי11.

שמונה ימים לאחר חיסון תאי סרטן הגידול העיקרי הוא בניתוח הסרת (איור 2). כדי לבדוק כל אחד efficacies סמים לחבלות גרורתי, זה צריך יהיה לנהל לאחר כריתת שד. דגם זה מאפשר ריאות גרורתי הנגע כמת, וכן כימות הנגע גרורות לכל הגוף, כל עוד נטל גידול גרורתי יש ביולומינסנציה לזיהוי של ניצול הדמיה ויוו. שיעור הישנות מקומית של קיר החזה הקדמי הוא די נמוך. מניסיוננו, שיעור הישנות מקומית היה פחות מ- 5% בניסויים עכברים מעל 50. עם זאת, אם ביולומינסנציה יום לאחר הניתוח 1 חורג 1.00E + 06 פוטונים (10 x גדול יותר מאשר אנשים אחרים), יש אפשרות גבוהה של הגידול המקומי שיורית13. אם ישנם תאים סרטניים שריד הנוכחי, גידול מוחשי מופיע בתוך שבועיים. כאשר יש גידול שיורית המקומי, ביולומינסנציה משקף בעיקר את המקומיים הישנות יותר מאשר כל נגעים גרורתי. גידולים שיורית מקומיים ידועים להתנהג באופן שונה מאוד מאשר גרורות מרוחקות19; לפיכך, החיות האלו עם המקומיים הישנות (< 5% מניסיוננו) לא להיות כלולים כל ניתוח נוסף. דגם כריתה זה גם מאפשר גידול גרורתי טורי נטל ניטור מבלי להרוג את החיות. יתר על כן, ניטור זוהרים כאלה יכולים להיות מאושרות על ידי ex-vivo ריאות גרורות כמת. במקום לכימות גרורות בריאה על ידי ex-vivo הדמיה, וכך יש לצורך המתת חסד של בעלי החיים, הישרדות העכברים לאחר טיפול כירורגי יכול גם להיות במעקב בתור נקודת קצה של קלינית לתרגום (איור דו-ממדי). מכיוון שאין שום הנגע העיקרי, עכברים לא יכול לעמוד בקריטריונים של הגידול המתת חסד אשר מוגדרות בדרך כלל כ גודל הגידול של > 2 ס מ או כיבת של הגידול העיקרי. במודל כריתת שד זה 4T1 ', עכברים כל מת בתוך 60 ימים לאחר חיסון תאי סרטן עקב גרורות.

Figure 1
איור 1: סקירה של המודל orthotopic ללא כריתת שד. (א) לוח זה מציג קורס זמן של orthotopic מודל ניצול המודל syngeneic 4T1. (B) לוח זה מראה את ביולומינסנציה לכל הגוף מודל orthotopic אשר משקף בעיקר את הגידול העיקרי. שורת שגיאה מציינת שגיאת התקן של הממוצע (n = 10). (ג) לוח זה מציג תמונות טורי של ביולומינסנציה לכל הגוף (של העכבר זהה). סרגל קנה מידה מציין 1 ס מ. (D) לוח זה מראה את גודל הגידול בפועל של פאנל B, נמדדת מחוגה. שורת שגיאה מציינת שגיאת התקן של הממוצע (n = 10). (E) לוח זה מציג ריאות שמחוץ ביולומינסנציה תמונות של עכברים דגם orthotopic 10 (n = 10). סרגל קנה מידה מציין 1 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: סקירה של המודל כריתת שד. (א) לוח זה מציג קורס זמן של כריתת שד דגם לאחר ההשתלה syngeneic orthotopic 4T1. סרגל קנה מידה מציין 1 ס מ. (B) לוח זה מראה את ביולומינסנציה לכל הגוף של המודל כריתה, אשר משקף בעיקר את הנגע גרורתי. שורת שגיאה מציינת שגיאת התקן של הממוצע (n = 10). (ג) לוח זה מציג תמונות טורי של ביולומינסנציה לכל הגוף (של העכבר זהה). ניצול ex-vivo הדמיה, הוא אישר כי האותות היו גרורות ריאה, המקומיים הישנות לא אושר ע י הדמיה לכל הגוף לאחר הסרת הריאה. סרגל קנה מידה = 1 ס מ. (D) עקום זה לוח מראה קפלן-מאייר הישרדות של המודל כריתה ללא כל טיפול סמים. עכברים היו מורדמים כאשר הגיעו קריטריונים המתת חסד עם כל מצב חולני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעשור האחרון, אנו יש כבר הקמת מספר דגמים מאתר סרטן, כולל השד סרטן מודלים3,7,13,16,20,21. בעבר, הפגנו כי השד סרטן תא orthotopic חיסון לתוך הרקמה בלוטת חלב תחת חזון ישירה מיוצר גידול גדול יותר עם פחות השתנות גודל בהשוואה הזרקת תאים סביב הפטמה ללא חתך כירורגי7 . מודל זה שופרה על ידי ניצול השעיה תא בתערובת חלבון כמו ג'לי. הצורות של הגידול שנוצר על ידי התאים חלבון ז'לטין תערובת-הושעתה היו עגולות עם השתנות פחות, ואילו אלה שנוצרו על ידי PBS-הושעתה התאים היו מפוזרים של בלוטת חלב3.

אנחנו עוד יותר לאמת כי הגידולים שנוצרו על-ידי בשיטת ההשתלה orthotopic כירורגית המובאת כאן מאוד הביע את הגנים של מי רשתות אינטרקציה חשובים התקדמות סרטן בהשוואה לאלו שנוצרו על-ידי ניתוחי או תת עורית הזרקת7. ממצאים אלה לרמוז כי מודל זה מחקה סרטן השד אנושי יותר טוב לעומת ניתוחי orthotopic-השרשה תת עורית7. אנחנו גם הפגינו מודל זה מתאים להעריך את הרגרסיה בתיווך החיסונית של סרטן השד באמצעות דחייה allogenic3. עם זאת, מבצעים חתך יכול גם לגרום לדלקת סביב הגידול14. לפיכך, בהתאם ההשערה נבדק על ידי החוקר, חשוב לשקול דלקת כגורם מבלבלים אפשריים.

מלבד neoadjuvant הגדרת, הרוב המכריע של טיפולים מערכתית ניתנת לאחר הגידול השד העיקרי הוא הוסר בניתוח11. נכון להיום, הרוב המכריע של פרה ללימודי פיתוח תרופות חדשות להעריך סמים תגובת הגידול העיקרי, אך לא גרורתי נגעים1,18. זו סתירה בין מודלים בעלי חיים וטיפול אנושי חשוב כי הפרופיל גנים של נגעים גרורתי אינו שונה באופן מהותי מזו של הנגע העיקרי22, אשר יש השלכות חשובות על ביולוגיה סרטן וטיפול , במיוחד בעידן של טיפול ממוקד22. לכן, צריך להעריך את היעילות של התרופה לטיפול אדג'וונט של הנגעים גרורתי, לא רק בתוך הגידול העיקרי. נוכל לאמת את העיתוי של היווצרות גרורות הצומת לימפה, ריאות לאחר חיסון orthotopic, ניצול של 4T1 השד סרטן orthotopic דגם16. אנחנו גם הפגינו כריתה של הגידול העיקרי שיפור ההישרדות סרטן שד גרורתי ניצול מודל כריתה23. לכן, ניסינו להקים מודל כריתת שד לאחר orthotopic סרטן התא ההשתלה. עם זאת, זמן רב בוזבז להקים מודל זה נמוך המקומיים הישנות. כי התאים הסרטניים מוזרקים דרך חתך כירורגי, תאים סרטניים הגירו בקלות לתוך הפצע. בנוסף, תאים סרטניים לפלוש לרקמות במגע ישיר עם הגידול, כגון שריר קיר החזה שמסביב, העור. התאים הסרטניים גם גרורות לבלוטות הלימפה בבית השחי בלי ויוצרים גוש בבית השחי גלוי בזמנו של כריתת שד. בעוד הסרת הגידול עשוי להיות טכניקה קלה יותר, בעשותו כן הוא לא לתרגום כדי כריתת שד בטיפול בסרטן השד כפי שזה גורם המקומיים הישנות13. לכן, זה "מודל כריתה רדיקלית" הוקמה כדי להסיר את כל התאים הסרטניים מן החזה הקדמי לנתיחה הלימפה בבית השחי הצומת אגן, כמתואר באיור2. אישרנו זאת גרורות בריאה על ידי מגוון של הריאה ex-vivo הדמיה, והיה שם אין הנגע השיא הנוכחי על ידי הדמיה לכל הגוף לאחר הסרת הריאה. במודל זה orthotopic 4T1, תאים סרטניים בסופו של דבר גרורות לריאות, בכל המקרים תוך 21 יום. עם זאת, העיתוי של גרורות תלויה בגודל הגידול העיקרי; לכן, פחות גודל הגידול העיקרי ההשתנות חשוב לניטור לא רק את הגידול העיקרי, אלא גם את נטל גידול גרורתי. באמצעות תערובת חלבונים כמו ג'לי, השתנות גודל הגידול יכול להיות ממוזער. עם זאת, תערובת חלבונים כמו ג'לי יכול להשפיע גם microenvironment את הגידול. לכן, פוטנציאל משתנה מתערב גורמים הקשורים לשימוש תערובת חלבונים כמו ג'לי להתייחס, בהתאם ההשערה של החוקר.

ניצול לבטא לוציפראז תאים סרטניים וטכניקות אלה מאפשרים גידול כימות הנטל עם פחות שגיאות מדידה, אפילו בגידולים הלא מוחשי. ישנן שתי מערכות כתב, זוהרים, פלורסנט, כדי להמחיש את האותות בבעלי חיים. עוד דווח כי האות הן של ביולומינסנציה של קרינה פלואורסצנטית יכול להיות מספיק פיקח על כימות, כאשר האות היעד הוא נמוך מאוד, רקע האות של קרינה פלואורסצנטית הוא גבוה יותר, אשר מפחית את הדיוק של וזמינותו. לעומת זאת, ביולומינסנציה מזוהה עם דיוק רב יותר-אות נמוכה יותר עם פחות הפרעה רקע24. בהתאם לכך, רוב החוקרים מעדיפים להשתמש ביולומינסנציה כתב מערכות שידור חי חיים ניסויים24,25. עם זאת, כימות נטל הגידול על ידי ביולומינסנציה יש המגבלות. התאים לבטא לוציפראז ברק luciferin מגיע ל התאים הסרטניים על ידי הלב וכלי הדם זלוף26. אם הנגע יש אזור של היפוקסיה ו/או זילוח, luciferin לא נמסר על התאים, הערך ביולומינסנציה, לאחר מכן, ניתן למדוד יהיו נמוכים יותר מאשר נטל הגידול בפועל. אכן, שחווינו כימות ביולומינסנציה לא הולם גודל הגידול הגיעו יותר מ- 1.5 ס מ. אנו מניחים כי זה בשל המתואר ובשפתיים ו/או תנאי hypoperfused. לכן, כאשר הגידול מגיע בגודל מוחשי, נטל הגידול לכמת על ידי ביולומינסנציה והן caliper מדידה. הגבלת חשוב כמת ביולומינסנציה לשקול הוא הפרווה שחור של עכברים. גם לאחר הסרת הפרווה, יש פיגמנטציה העור27. בעוד ביולומינסנציה ועוזרת לכמת בעכברים עם פרווה שחור, אותו הוא ירד, לכן, חשוב להשוות בין עכברים מאותו צבע פרווה אחד לשני על מנת להפחית את ההשפעות מבלבלים של צבע פרווה על כימות זוהרים. השימוש של תאים המבטאים לוציפראז מספק כמה שיטות ייחודיות ללימוד. לדוגמה, ניתן להשתמש secretable לוציפראז על כימות נטל הגידול על ידי מדידה דם או שתן ביולומינסנציה28. המודל המוצג כאן, כימות נטל גידול ישיר של תאים סרטניים קיימא בבעלי חיים עם לוציפראז הלא-secretable היא פשוטה, פשוטה, אשר אינו דורש איסוף דגימות דם או שתן.

בדומה לדגמי אשר הציג כאן, הייצור של יותר יעיל ניסויים בבעלי חיים על ידי ייצור שיעור הצלחה גבוה יותר של tumorigenesis עם השתנות פחות הוא מפתח כדי להוכיח את הממצאים. במודל הנוכחי, ברגע חוקר למד את הטכניקה, קל להשיג שיעור tumorigenesis 100%. השגנו גם שיעור גבוה יותר tumorigenesis מלבד הדגמים שיש לנו הציג; בנוסף, הקמנו דגם orthotopic סרטן המעי הגס ניצול תא ההשעיה בתערובת חלבון כמו ג'לי, יחד עם הטכנולוגיה ביולומינסנציה לכמת את נטל הגידול21. לסיכום, המודל בעלי חיים המובאים כאן מספק מודל מאתר מתאימים לנהל מחקר הסרטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמך על ידי מענק-NIH גרנט R01CA160688, סוזן ג קרן Komen החוקר יזמה מחקר (IIR12222224) K.T. לעכברים ביולומינסנציה תמונות נרכשו על-ידי המשאב המשותף Translational הדמיה משאב משותף בפארק רוזוול מקיף במרכז לחקר הסרטן, אשר נתמך על ידי סרטן מרכז תמיכה גרנט (P30CA01656) ועל מכשור משותפים גרנט (S10OD016450).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Dissection Scissors Roboz RS-5983 For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps Roboz RS-5233 For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder Roboz RS-7830 For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo Roboz RS-6873 For ex vivo
5-0 silk sutures Look 774B For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500) Braintree Scientific GER 5287-120V For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper Wahl 9908-717 For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel Corning 354234 For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt GOLD-Bio LUCK-1K For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640 Gibco 11875093 For cell culture
Fetal Bovine Serub Gibco 10437028 For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 For cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rashid, O. M., Takabe, K. Animal models for exploring the pharmacokinetics of breast cancer therapies. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 11 (2), 221-230 (2015).
  2. Schuh, J. C. Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice. Toxicologic Pathology. 32, 53-66 (2004).
  3. Katsuta, E., et al. Modified breast cancer model for preclinical immunotherapy studies. Journal of Surgical Research. 204 (2), 467-474 (2016).
  4. Sidell, D. R., et al. Composite mandibulectomy: a novel animal model. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 146 (6), 932-937 (2012).
  5. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Research. 25, 3905-3915 (2005).
  6. Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
  7. Rashid, O. M., et al. An improved syngeneic orthotopic murine model of human breast cancer progression. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (3), 501-512 (2014).
  8. Bertozzi, S., et al. Prevalence, risk factors, and prognosis of peritoneal metastasis from breast cancer. SpringerPlus. 4, 688 (2015).
  9. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  10. Valero, M. G., Golshan, M. Management of the Axilla in Early Breast Cancer. Cancer Treatment and Research. 173, 39-52 (2018).
  11. National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf (2018).
  12. Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
  13. Katsuta, E., Rashid, O. M., Takabe, K. Murine breast cancer mastectomy model that predicts patient outcomes for drug development. Journal of Surgical Research. 219, 310-318 (2017).
  14. Veenhof, A. A., et al. Surgical stress response and postoperative immune function after laparoscopy or open surgery with fast track or standard perioperative care: a randomized trial. Annals of Surgery. 255 (2), 216-221 (2012).
  15. Wei, S., Siegal, G. P. Surviving at a distant site: The organotropism of metastatic breast cancer. Seminars in Diagnostic Pathology. 35 (2), 108-111 (2018).
  16. Nagahashi, M., et al. Sphingosine-1-phosphate produced by sphingosine kinase 1 promotes breast cancer progression by stimulating angiogenesis and lymphangiogenesis. Cancer Research. 72 (3), 726-735 (2012).
  17. Jones, C., Lancaster, R. Evolution of Operative Technique for Mastectomy. Surgical Clinics of North America. 98 (4), 835-844 (2018).
  18. Rashid, O. M., Maurente, D., Takabe, K. A Systematic Approach to Preclinical Trials in Metastatic Breast Cancer. Chemotherapy (Los Angeles). 5 (3), (2016).
  19. Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nature Genetics. 33 (1), 49-54 (2003).
  20. Aoki, H., et al. Murine model of long-term obstructive jaundice. Journal of Surgical Research. 206 (1), 118-125 (2016).
  21. Terracina, K. P., et al. Development of a metastatic murine colon cancer model. Journal of Surgical Research. 199 (1), 106-114 (2015).
  22. Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
  23. Rashid, O. M., et al. Resection of the primary tumor improves survival in metastatic breast cancer by reducing overall tumor burden. Surgery. 153 (6), 771-778 (2013).
  24. Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
  25. Adams, S. T. Jr, Miller, S. C. Beyond D-luciferin: expanding the scope of bioluminescence imaging in vivo. Current Opinion in Chemical Biology. 21, 112-120 (2014).
  26. Close, D. M., Xu, T., Sayler, G. S., Ripp, S. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors (Basel). 11 (1), 180-206 (2011).
  27. Chen, H., Thorne, S. H. Practical Methods for Molecular In Vivo Optical Imaging. Current Protocols in Cytometry. 59 (1224), (2012).
  28. Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
  29. Aoki, H., et al. Host sphingosine kinase 1 worsens pancreatic cancer peritoneal carcinomatosis. Journal of Surgical Research. 205 (2), 510-517 (2016).

Tags

רפואה גיליון 141 עכבר השד סרטן מודל orthotopic syngeneic כריתת שד גרורות מאיר; IVIS
יצירת מודל של סרטן שד גרורתי Orthotopic מאתר וביצוע מאתר כריתה רדיקלית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O.… More

Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. J. Vis. Exp. (141), e57849, doi:10.3791/57849 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter