Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Studere Ribonucleotide vedtægter: Strand-specifik påvisning af Ribonucleotides i gær genom og måling Ribonucleotide-induceret mutagenese

Published: July 26, 2018 doi: 10.3791/58020
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Genome Integrity and Structural Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, DHHS
* These authors contributed equally

Summary

Ribonucleotides er blandt de mest rigelige ikke-kanoniske nukleotider indarbejdet i genomet i eukaryote nukleare DNA-replikation. Hvis ikke ordentligt fjernes, kan ribonucleotides forårsage DNA-skader og mutagenese. Vi præsenterer her, to eksperimentelle metoder, der bruges til at vurdere overfloden af ribonucleotide indarbejdelse i DNA og dets mutagene virkninger.

Abstract

Tilstedeværelsen af ribonucleotides i nukleare DNA har vist sig at være en kilde til genomisk ustabilitet. Omfanget af ribonucleotide vedtægter kan vurderes af alkalisk hydrolyse og gel elektroforese som RNA er meget modtagelige for hydrolyse i basisk betingelser. Dette, kan i kombination med det sydlige skamplet analyse bruges til at bestemme placeringen og strand i som ribonucleotides er blevet indarbejdet. Men denne fremgangsmåde er kun semi-kvantitative og muligvis ikke følsomme nok til at opdage små ændringer i ribonucleotide indhold, selv om strand-specifikke sydlige skamplet sondering forbedrer følsomheden. Som en foranstaltning af en af de mest slående biologiske konsekvenser af ribonucleotides i DNA, kan spontane mutagenese analyseres ved hjælp af en fremadrettet mutation assay. Ved hjælp af passende reporter gener, sjældne mutationer, der resulterer i tab af funktion kan blive udvalgt og overordnede og specifikke mutation kan måles ved at kombinere data fra udsving eksperimenter med DNA-sekventering af reporter gen. Udsving assay er relevant at undersøge en lang række mutagene processer i særlige genetiske baggrund eller vækstbetingelser.

Introduction

Under eukaryote nukleare DNA replikation, er ribonucleotides indarbejdet i genomet af alle tre store DNA replicases, DNA polymeraser (Pols) α, ε og δ1,2. RNase H2-afhængige ribonucleotide excision reparation (RER3) fjerner fleste af disse indlejrede ribonucleotides.

En ribonucleotide i DNA er modtagelige for hydrolyse, da 2' hydroxylgruppe af sukker gruppe kan angribe de tilstødende phosphodiester bond, frigive ene ende med en 2' - 3' cyklisk fosfat og den anden med en 5'-OH4. Alkalisk betingelser kan høj grad fremskynde reaktionen. Således forårsager hydrolyse af integrerede ribonucleotides under inkubation i en basisløsning fragmentering af genomisk DNA, som kan visualiseres ved alkaline-Agarosen elektroforese5. Dette DNA kan overføres til en membran og probed af sydlige skamplet analyse ved hjælp af strand-specifikke sonder, der tillader identifikation af alkali-følsomme steder forårsaget af ribonucleotides indarbejdet i det spirende førende - eller halter-strenget DNA, henholdsvis.

I gærceller mangler RNase H2 aktivitet, kan fjernelse af ribonucleotides påbegyndes når topoisomerase jeg (Top1) nicks DNA på den integrerede ribonucleotide6,7. Men når Top1 kløver i 3' side af ribonucleotide, dette skaber 5'-OH og 2' - 3' cyklisk fosfat DNA ender der er refraktære over for religation. Manglende reparation eller afvigende behandling af disse beskidte ender kan føre til genomisk ustabilitet. Desuden, hvis snittet sker inden for en gentagelse DNA sekvens, kan reparationsprocessen føre til sletning mutationer. Dette er særligt problematisk for tandem gentager, hvor korte sletninger (af mellem to og fem basepar) er almindeligt observeret i RNase H2-mangelfuld celler. Top1-afhængige skadelige virkninger i mangel af gær RNase H2 aktivitet er forværret i en DNA polymerase ε mutant (pol2-M644G) promiskuøs til ribonucleotide indbygning under spirende førende strand syntese.

Behandling af ribonucleotides i DNA fører til spontane mutationer og denne mutagenese kan påvises ved hjælp af passende reporter gener og vælge for den ledsagende fænotypiske forandringer. Et udsving test eller Luria og Delbrück eksperiment er en af de mest almindeligt anvendte metoder til at måle spontan mutation satser bruger valgbar reporter gener8,9. I gær, kan URA3 og CAN1 gener bruges som journalister i et fremadrettet mutation assay, som giver mulighed for påvisning af alle mutation typer, der resulterer i tab af genfunktioner. Spontan mutation satsen er anslået median af der er konstateret for flere parallelle kulturer startede fra enkelt kolonier uden mutationer i target reporter gen. En gær RNase H2-mangelfuld stamme som rnh201Δ har en moderat forhøjede samlede spontan mutation sats, der er i høj grad forårsaget af en forhøjet forekomst af 2-5 bp sletninger i tandem gentage sekvenser. Således, at fuldt ud for at beskrive de mutagene virkninger af ribonucleotides i genomet, specifikke mutation satser skal bestemmes. I dette tilfælde, URA3 eller CAN1 reporter gener kan forstærkes og sekventeret Bestem typer og placeringen af mutationerne, og specifikke mutation priser kan beregnes. Udarbejdelse af mutationer i flere uafhængige URA3 eller CAN1 mutanter kan derefter bruges til at generere en mutation spektrum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. alkalisk hydrolyse og Strand-specifikke sydlige skamplet (figur 1)

  1. Cellevækst og genomisk DNA isolation
    1. Isolere gær genomisk DNA ved hjælp af en gær DNA rensning kit efter fabrikantens anvisninger. Bruge de kulturer, der er i den eksponentielle fase af vækst mellem (en optisk tæthed på 0,5) og 1. Resuspenderes endelige DNA i 35 mL 1 x TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM ethylendiamintetra syre (EDTA)).
    2. Der tilsættes 1 mL af 5 mg/mL RNase A til DNA og Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
    3. Udfældes DNA ved hjælp af 0,1 bind 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 2,5 mængder af 100% ethanol i 20 min. på is.
    4. Centrifuge på 16.000 x g i 20 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten ved hjælp af en pipette.
    5. Vask pellet to gange med 500 mL af 70% ethanol. Fjern supernatanten ved hjælp af en pipette.
    6. Tør pellet på bænken og resuspend i 35 ml 1 x TE buffer.
    7. Kvantificere DNA ved hjælp af en fluorimeter (Tabel af materialer) med dsDNA BR Assay kit.
    8. Bundfald 5 mg af DNA fra hver prøve ved hjælp af 0,1 bind 3 M natriumacetat, pH 5,2 og 2,5 mængder af 100% EtOH for en samlet maengde paa 200 mL (tilføje H2O hvis nødvendigt, yderligere 5 mg af DNA er nødvendig, hvis kontrolelementet neutral gel er nødvendigt). Der inkuberes i isbad i 20 min.
    9. Centrifuge på 16.000 x g i 20 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten ved hjælp af en pipette.
    10. Tørre pellet på bænken. Resuspend DNA i 14 mL H2O.
  2. Alkalisk hydrolyse og gel elektroforese
    1. Tilføj 6 mL 1 M KOH og inkuberes ved 55 ° C i 2 timer.
    2. Inkuber prøver på is i 5 min.
    3. Der tilsættes 4 mL af 6 x alkalisk DNA loading bufferen: 300 mM KOH, 6 mM EDTA, pH 8,0, 18% polysucrose (Table of Materials), 0,15% bromkresol grønne og 0,25% xylen cyanol FF.
    4. Støbt en alkalisk gel, der består af 1% agarosegelelektroforese, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8,0. Brug en kam, der giver mulighed for 24 mL af DNA-prøve, der skal lastes pr. vognbane.
    5. Kør gelen ved stuetemperatur i 1 x alkalisk elektroforese buffer: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8,0. Omfatte en passende DNA størrelse markør.
    6. Spin ned rørene kort og indlæse hele 24 mL prøve i den alkaliske agarosegel. Electrophorese for 30 min på 30 V, efterfulgt af 18-20 h 10 V.
    7. Neutralisere gel for 2 inkubationer af 45 min ved stuetemperatur med blid agitation i neutralisering Buffer I: 1 M Tris-HCl, 1,5 M NaCl.
    8. Pletten DNA af iblødsætning de neutraliseret gel i 200 mL vand, der indeholder en 1/10.000 fortynding af SYBR guld plet i 2 timer ved stuetemperatur med blid ryster.
    9. Visualisere DNA ved hjælp af en UV-transilluminator. Øget alkali-følsomhed forårsager udseendet af mindre DNA fragmenter, der angiver en højere tæthed af unrepaired ribonucleotides i DNA5.
  3. Sydlige overførsel
    1. Overføre DNA fra den alkaliske gel til positivt ladede nylon membran af kapillaritet10. Et eksempel på, hvordan denne overførsel kan sættes op er fastsat i Sambrook og Russells manuel10.
    2. Sættetid alkalisk gelen i 15 min. ved stuetemperatur i basisk overføre Buffer: 0,4 M NaOH, 1 M NaCl.
    3. Våd nylon membran (klip til størrelsen af gel) kort med vand, og derefter lægges i blød i 5 min i basisk overføre Buffer.
    4. Nedsat overførsel platform af invertere 3 glas bægre (100 mL) i et glas bagning parabol. Denne parabol bør være lidt større end størrelsen på agarosegel. Sætte en glasplade over toppen af dem.
    5. Drapere 2 store stykker af 3 MM CHR kromatografi papir (klippe til størrelse af bredden af gel plus længere sider, der kan drapere over kanterne i buffer reservoiret) over glasplade.
    6. Hæld alkalisk overføre Buffer over kromatografi papir og halv fyld glasfad. Glat ud boblerne ved hjælp af 5 mL glas pipette.
    7. Placer agarosegel på toppen, igen udglatte boblerne. Omgiv alle kanter af gel med parafilm. Hæld en lille mængde af alkalisk overføre Buffer på gelen.
    8. Sted pre gennemblødt nylon membran på toppen af gelen. Glat ud boblerne.
    9. Våd 2 stykker papir skåret til størrelsen af agarosegel. Placer dem oven på membranen, og glat ud nogen bobler.
    10. Placer en stor stak papir håndklæder (cut til en størrelse lidt større end agarosegel) på toppen af overførsel sandwichen. Omhyggeligt placere en glasplade på toppen af papirhåndklæder. Tilføje en vægtet objekt øverst (en bog med en masse på 400 g fungerer godt).
    11. Lad overførsel fortsætter natten over ved stuetemperatur.
    12. Omhyggeligt tage overførsel stak ud og suge membran i 15 min. ved stuetemperatur i neutralisering Buffer II: 0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, 1 M NaCl.
    13. Bitmapgenkendelse DNA til opladet nylon membranen ved hjælp af en UV-crosslinker. Placer membranen i tværs linker og brug indstillingen autocrosslink.
  4. Sydlige sonde forberedelse
    Bemærk: Metoden beskrevet her for at registrere alkali-følsomme steder i den spirende førende-versus halter-streng af DNA streng er baseret på en protokol offentliggjort tidligere11. Til vores eksperiment, er sondering udført på URA3 reporter gen, som er blevet indsat i en af to retninger (OR1 eller OR2) støder op til ARS306 replikering oprindelse på kromosom III (figur 3A). Tilstedeværelsen af alkali-følsomme steder i gær genomisk DNA er en indikator for ribonucleotide montering, der tillader anvendelse af ribonucleotides som biomarkører for DNA polymerase aktivitet12,13,14. Denne tilgang, ved hjælp af et target DNA sekvens støder op til replikering, effektiv ARS306 oprindelse bør være åbne over for andre genomisk lokationer og target gener så godt.
    1. PCR-forstærke en 520-base par segment af URA3 reporter gen ved hjælp af følgende primer parret: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) og URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).
    2. Udføre PCR reaktionen bruger 10-20 ng af gær genomisk DNA som en skabelon, 4 μL af hver primer (10 μM lager), 10 μl af 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 8 μL af dNTP blanding (2,5 mM), 0,5 μl af Ex Taq DNA Polymerase (5 U/μl) , og justere den endelige rumfang til 100 μL med H2O.
    3. Køre programmet følgende PCR: 95 ° C i 5 min; 30 cykler på 95 ° C i 1 minut, 55 ° C i 1 min., 72 ° C i 2 min. 72 ° C i 10 min og hold ved 4 ° C.
    4. Rense PCR produkt ved hjælp af en PCR rensning kit og elueres DNA med 50 mL H2O. Dette kan nu bruges som skabelon i den radiolabeling reaktion.
    5. Brug de følgende primere for strand-specifikke radiolabeling: Brug URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) til at visualisere DNA, der anneals at sonden A. Dette svarer til den spirende førende strand DNA, når URA3 er i OR2 og tnascent lagging strand DNA, når URA3 er i OR1. Brug URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) til at visualisere spirende DNA, der anneals at sonden B. Dette svarer til den spirende førende strand DNA, når URA3 er i OR1 og spirende lagging strand DNA, når URA3 er i OR2 (figur 3).
      1. Udføre den radiolabeling reaktion med 10-20 ng forstærket URA3 fragment som skabelon DNA, 2 μl af primer (10 μM lager), 5 μl af 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 4 μL af 2,5 mM dNTP'er (minus dCTP), 5 μl (50 μCi) af en -32P-dCTP , 0,5 μl af ExTaq DNA Polymerase (5 U/μL) og justere det endelige rumfang på 50 μL med H2O. køre følgende program for radiolabeling: 94 ° C i 5 min; 25 cyklusser af 94 ° C i 1 minut, 55 ° C til 30 s, 72 ° C i 1 min; 72 ° C i 5 min og hold ved 4 ° C.
    6. Brug en G-25 spin kolonne til at fjerne personlige radioaktivt mærket. Før tilføje radiolabeled prøven, der centrifugeres kolonnen for 1 min på 720 x g og removethe buffer af pipettering. Indlæse radiolabeled reaktionsprodukt og centrifugeres i 2 min på 720 x g at eluere mærket sonden.
    7. Der inkuberes ved 95 ° C i 5 min til at denaturere sonde umiddelbart før hybridisering. Cool kort på is.
  5. Sydlige hybridisering
    1. Rulle den fugtede membran ind i en hybridisering tube og der tilsættes 25 mL af frisklavede hybridisering buffer: 0,5 M natrium fosfat buffer, pH 7,2, 7% sodium dodecyl sulfat (SDS), 1% bovint serumalbumin (BSA). Der inkuberes ved 65 ° C i 1-2 h med rotation i et hybridisering ovn.
    2. Omhyggeligt hæld opløsningen og der tilsættes 25 mL hybridisering buffer plus radioaktive sonden. Der inkuberes ved 65 ° C i 16-18 h med rotation.
    3. Hæld opløsningen i et radioaktivt affald beholder. Udføre 5 vasker på 5 min. ved stuetemperatur med fosfat-SDS vask løsning I: 40 mM natrium fosfat buffer, pH 7,2, 5% SDS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, pH 8,0.
    4. Udføre 2 vasker i 15 min. ved 65 ° C med fosfat-SDS vask løsning II: 40 mM natrium fosfat buffer, pH 7,2, 1% SDS, 1 mM EDTA, pH 8,0.
    5. Fjerne membranen fra hybridisering røret ved hjælp af pincet og sted i en åbnede plast ærme protector. Dække og udsættes for en imaging plade. Prøv en række forskellige eksponering gange spænder fra 4 h-4 d.
    6. Hvis det er nødvendigt, fratage og re sonde skamplet ved hjælp af en anden sonde ca 3 - 4 gange. Til strip, Ruger membran i 2 timer ved 65 ° C i 25 mL af en 50% formamid, 2 x SSPE løsning.
      Bemærk: 20 x SSPE stamopløsning: 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4, 0,02 M EDTA, pH 7,4.
    7. Hæld opløsningen i et radioaktivt affald beholder. Udføre 2 vasker i 15 min. ved 65 ° C i fosfat-SDS vask løsning II.
    8. Kontroller membranen med en geigertæller og Gentag stripping protokollen, hvis signalet forbliver.
    9. Udføre pre hybridisering og hybridisering, som beskrevet ovenfor.

2. måling af Mutationshastighed og specificitet i S. cerevisiae stammer

  1. Forberede cellekultur
    1. Podes en enkelt koloni (raske gær celler tager 2-3 dage ved 30 ° C til formularen korrekt mellemstore kolonier) dyrkes på YPD agar suppleret med 100 mg/mL adenin til 5 mL af YPDA bouillon suppleret med 250 mg/mL adenin (tilskud af adenin er kun nødvendigt hvis den stamme, der anvendes er en adenin auxotroph). Vokse i en shaker inkubator eller på en rotator ved 30 ° C, indtil kulturen når mætning (36-48 h for en stamme uden en alvorlig vækst defekt).
    2. Spin ned celler ved ~ 2000 x g i 5 min.
    3. Supernatanten og cellerne vaskes med 5 mL sterilt vand.
    4. Resuspend celler i 500 mL sterilt vand.
  2. Fortynding af cellekultur og plating
    1. For ikke-udvælgelse kontrol, fortyndes celler i en 96-brønd plade med en faktor på 1,600,000 og plade 100 mL af hver kultur på en komplet (COM) tallerken.
    2. Du kan vælge for ura3 mutanter, plade 100 mL af ufortyndet celler på en 5-FOA tallerken for en wild-type (WT) stamme. Fortyndes cellerne i overensstemmelse hermed, hvis mutation satsen for stamme af interesse forventes at være højere end i en WT stamme.
    3. At vælge for can1 mutanter, fortyndes cellerne 5-fold og plade 100 mL på en canavanine-holdige tallerken (CAN) for en WT stamme. Fortyndingsfaktoren er 0,5.
    4. Inkuber plader ved 30 ° C indtil gær kolonier form. For stammer uden en vækst defekt, 2-3 dage er normalt tilstrækkelig til COM og kan plader og 3-5 dage til 5-FOA plader. For at sammenligne mutation priser mellem forskellige stammer, er det bedst at vælge den samme dag i vækst til at tælle kolonier. Gemme pladerne klar til at blive talt med i kølerum (~ 4 ° C).
  3. Beregningen af spontan mutation
    1. Tælle synlige kolonier på hver plade og tage noter af kolonien numre
    2. Beregne Mutationshastighed ved hjælp af Drakes formel: μ = f ÷ ln (μNt). f er den mutation frekvens beregnet efter antallet af mutanter divideret med antallet af celler i den endelige kultur. NT er antallet af celler i den endelige kultur og μ er mutation satsen. Denne ligning kan løses ved en iterativ metode som Newton-Raphson metode. Der er andre estimator metoder, herunder Lea og Coulson testen for at beregne mutation satsen15.
    3. Beregnes konfidensintervallet antager log normalfordelingen utation satser af enkelte isolater. 95% konfidensinterval benyttes oftest.
  4. Analyse af mutation spektrum
    1. Vælge en enkelt koloni fra hver 5-FOA eller kan plade og opdatere på en YPDA plade.
    2. Udføre koloni PCR til at forstærke URA3 eller CAN1 gen og sekvens for at påvise mutationer ved hjælp af de følgende primere: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') og URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') for begge PCR-amplifikation og sekventering af 800 bp URA3 genet; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') og CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') til forstærkning og CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') og CAN1-BR ( 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') til sekvensering af 1800 bp CAN1 reporter gen.
    3. For at udføre koloni PCR, resuspend en enkelt koloni i 5 μl af H2O og bruge 1 μL som skabelon. Tilføj 1 μL af hver af primere (5 μM stock), 2 μl af 5 x KAPA2G Buffer (Mg2 + plus), 0,5 μl af dNTP (2,5 mM), 0,5 μl af KAPA2G hurtigt DNA Polymerase, 12 μl af H2O.
    4. Til forstærkning af URA3 gen, køre programmet følgende PCR: 95 ° C i 5 min; 5 cyklusser af 95 ° C til 10 s, 61 ° C i 15 s, 72 ° C i 30 s; 35 cykler på 95 ° C til 10 s, 61 ° C i 15 s, 72 ° C i 30 s; 72 ° C i 2 min. og hold ved 4 ° C. Til forstærkning af CAN1 gen, køre programmet følgende PCR: 95 ° C i 5 min; 5 cyklusser af 95 ° C til 10 s, 61 ° C i 15 s, 72 ° C i 45 s; 35 cykler på 95 ° C til 10 s, 61 ° C i 15 s, 72 ° C i 45 s; 72 ° C i 2 min. og hold ved 4 ° C.
    5. Juster sekventering resultaterne til en reference sekvens ved hjælp af et program som DNASTAR Seqman Pro eller Sequencher til at identificere mutationer.
    6. Kompiler mutationer data af mutation type (figur 4) eller mutation placering (figur 5). Beregning af de specifikke mutation satser for hyppigheden af en mutation (antallet af begivenheder observeret divideret med antallet af mutanter sekventeret) ganget med den samlede Mutationshastighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Behandling af genomisk DNA med alkalibehandling efterfulgt af alkalisk gelelektroforese giver mulighed for semi-kvantitative påvisning af DNA fragmentering på grund af overfloden af stabilt indarbejdet ribonucleotides. Figur 2 viser gel billeder af gær genomisk DNA behandlet med eller uden KOH5. M644L varianten af Pol2, den katalytiske subunit af Polε, har reduceret evne til at optage ribonucleotides, mens M644G mutant inkorporerer flere ribonucleotides end WT-polymerase. Som beskrevet i protokollen, kan den alkaliske gel yderligere aftestede af strand-specifikke sydlige skamplet analyse. Med kendskab til placeringen af den probed genomisk site i forhold til dets tilstødende oprindelse, kan vi selektivt probe ribonucleotides indarbejdet i den spirende fører eller halter tråde. Figur 3 viser de sydlige skamplet resultater sondering URA3 reporter gen indsat i to modsatte retninger tæt på en snarlig fyring replikering oprindelse, ARS30616. Ved hjælp af førende strand-specifikke sonder, observerer vi DNA fragmentering mønster forårsaget af alkali-kavalergang på ribonucleotides i spirende førende strand DNA i en WT stamme og stammer udtrykker de varianter og polymeraser α, δ, ε, er promiskuøs for ribonucleotide indarbejdelse.

Bruger et udsving eksperiment, kan vi måle mutation satserne af gærstammer indeholdende reporter gener. Figur 4 viser mutation satser på URA3 og CAN1 loci af stammer udtryk for WT polymerase eller pol2-M644G mutant med eller uden funktionelle RNase H2. Manglen på RNase H2 forårsager en moderat stigning i samlede mutation priser i både baggrunde. Nærmere undersøgelse af mutation specificitet viser imidlertid, at i stammer mangler RNase H2 (figur 5), er der en stærk stigning i Mutationshastighed for korte sletninger, især i tandem repeat sekvenser. Figur 5A sammenligner mutation specificitet i WT og rnh201Δ stammer og figur 5B viser den mutationsmønstre effekt af yderligere forhøjet ribonucleotide indarbejdelse i den spirende førende DNA streng af Pol ε.

Figure 1
Figur 1: protokol trin involveret i strand-specifik påvisning af alkali-følsomme steder forårsaget af ribonucleotide indarbejdelse i gær genomisk DNA. En oversigt over de forskellige større trin involveret i denne procedure, begyndende med gær genomisk DNA isolation og fortsætter gennem den endelige sydlige skamplet analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: et repræsentativt billede af resultater opnået ved alkaline-Agarosen gelelektroforese. Dette tal er blevet tilpasset fra Nick McElhinny, S. A. et al. 5. gær genomisk DNA fra stammer af forskellige genotyper blev behandlet med KCl (neutral) eller KOH (alkalisk) og derefter adskilt på en neutral eller basisk agarosegel. "WT" og "M644G" angiver status for Pol ε. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Strand-specifikke sondering af en alkalisk-agarosegel af sydlige skamplet. Dette tal er blevet tilpasset fra Williams, J. S. et al. 13. (A) radiolabeled sonder at anneal til den spirende førende DNA streng inden for det URA3 reporter gen, der er blevet indsat tæt på ARS306 i to modsatte retninger (OR1 og OR2). (B) repræsentative resultater af det sydlige duppe bruge de spirende førende strand-specifikke sonder. Vises er de dybdeborende resultater for den spirende førende strand i en stamme med WT DNA polymeraser, eller pol1-L868M, pol2-M644G eller pol3-L612M variant stammer med eller uden RNase H2. POL1, POL2, og POL3 gener indkode katalytisk underenheder af Pols α, ε og δ, henholdsvis. Varianterne er mere promiskuøs for ribonucleotide indarbejdelse5,12,17. (C) kvantificering af det radioaktive signal af brøkdel af det samlede antal i hver lane fra (B). Værdierne er udtrykt som en procentdel af samlet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: spontan mutation priser i gærstammer. Dette tal er blevet tilpasset fra Nick McElhinny, S. A. et al. 5. URA3 og CAN1 reporter gener blev brugt i fremad mutation analysen til at måle mutation satser af de angivne stammer. URA3 reporter er i "orientering 2" (OR2, figur 3A). 95% konfidensinterval (CI) er inkluderet for hver måling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Mutation spektre for URA3-OR2 reporter gen. Dette tal er blevet tilpasset fra tidligere publikationer5,18,19,20. Den holdning og mutation type observeret i hver uafhængig 5-FOA-resistente koloni valgt i fremad mutation assay er afbildet i 804 bp URA3 kodende sekvens. Bogstaver angiver base erstatninger, åbne trekanter angive enkelt base sletninger, lukkede trekanter angiver enkelt base indsættelser og solid linjer angiver kort sletninger. (A) Mutation spektre i WT og rnh201Δ stammer. Røde mærker over sekvensen er mutationer observeret i WT, mens blå mærker under sekvensen er observeret i en rnh201Δ stamme. (B) Mutation spektre i pol2-M644G og pol2-M644G rnh201Δ stammer. Røde mærker over sekvensen er mutationer i pol2-M644G mens blå nedenstående rækkefølge for pol2-M644G rnh201Δ stammer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi protokollerne for to sæt eksperimenter, der ofte bruges til at analysere semi-kvantitativt ribonucleotides indarbejdet under DNA replikation og de mutagene virkninger af unrepaired ribonucleotides. Selv om disse metoder indebærer model eukaryote S. cerevisiae, kan disse teknikker nemt tilpasses andre mikrober og endnu højere eukaryoter.

Sondering for unrepaired ribonucleotides i DNA bruger alkaline-Agarosen elektroforese kombineret med det sydlige blotting giver vigtige oplysninger om antallet af ribonucleotides nuværende og strand, som de er blevet indarbejdet. Det er dog vigtigt at bemærke, at alkali-følsomhed kan også være forårsaget af andre DNA læsioner, såsom en abasic site. Et andet middel til påvisning af ribonucleotides i DNA er ved behandling med oprenset RNase H2 enzym, som er sket i pattedyrceller21. Selv om vores tilgang indebærer sondering for alkali-følsomme steder i spirende førende versus halter tråde på URA3 reporter gen bruges i vores mutationsmønstre analyse eksperimenter, er det muligt at designe de sonder at anneal på andre steder i rækkefølgen at få vigtige oplysninger om ribonucleotide tæthed på andre genomisk websteder. Sydlige skamplet del af proceduren, kan også bruges som reference til andre generiske DNA sondering eksperimenter.

Måling af mutation priser ved hjælp af et udsving test har været bredt anvendt i analysen af forskellige mutagene begivenheder i mikroorganismer, og således er begrænset ikke til analyse af de mutagene konsekvenser af ribonucleotides i DNA. For dette eksperiment, kan øge antallet af uafhængige kulturer væsentligt forbedre målenøjagtighed. Uafhængige kolonier kan opnås ved striber en stamme af interesse på YPDA medium eller ved analyse af uafhængige spore kolonier opnåede ved tetrad dissektion af en diploide gær pletten. Ideelt set vil anvendelsen af flere uafhængige haploide gærstammer (fx., fra tetrad dissektion) opfordres til at minimere virkningen af stamme til stamme variation. Dette er især vigtigt, når spontan mutation er høj, eller når stammen har en vækst defekt. En supplerende metode, der kan anvendes til at måle spontan mutation satsen er en mutation ophobning eksperimentere22. I denne analyse, mutation frekvens bestemmes for cellerne efter omfattende vækst og kan bruges til at beregne for mutation satsen. Kobling af en mutation ophobning eksperiment med dyb sekventering teknologi har vist sig for at være et effektivt redskab til at analysere Mutationshastighed og specificitet på tværs af genomet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker alle nuværende og tidligere Kunkel Lab medlemmer for deres arbejde og drøftelser relateret til protokollen og genbruges data præsenteres her. Dette arbejde blev støttet af projekt Z01 ES065070 til T.A.K. fra Division af murene forskning af de nationale kontorer i Health (NIH), nationale Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
YPD media 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave.
COM plates 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate.
CAN plates 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution.
5-FOA plates 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution.
L-Canavanine sulfate US Biological C1050
5-FOA US Biological F5050
20 mL glass culture tube Any brand
Culture rotator in 30 °C incubator Shaker incubator can be used instead
96 well round bottom plates Sterile, any brand
3 mm glass beads Fisher Scientific 11-312A Autoclave before use
12-channel pipettes Any brand
Ex Taq DNA Polymerase TaKaRa RR001
Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit Epicenter MPY80200
3 M sodium acetate Sigma-Aldrich S7899
100% ethanol
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Q32866 Newer model available
dsDNA BR Assay kit Invitrogen Q32850
KOH Sigma-Aldrich 221473
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Ficoll 400 Dot Scientific Inc. DSF10400
Bromocresol green Eastman 6356
Xylene cyanol FF International Technologies Inc. 72120
NaOH Sigma-Aldrich S8045
1 M Tris-HCl (pH 8.0) Teknova T5080
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain Invitrogen S11494
UV transilluminator
Amersham Nylon membrane Hybond-N+ GE Healthcare RPN303B
3 MM CHR Chromotography paper Whatman 3030-392
NaCl Caledon 7560-1
Stratalinker 1800 Stratagene
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
G-25 spin column GE Healthcare 27-5325-01
1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) Sigma-Aldrich NaH2PO4 (S9638);
Na2HPO4 (S9390)
SDS Sigma-Aldrich L4522
BSA Sigma-Aldrich A3059
Formamide Sigma-Aldrich 47671
Geiger counter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
  2. Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
  3. Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
  4. Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
  5. Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
  6. Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
  7. Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
  8. Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).
  9. Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
  10. Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  11. Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
  12. Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
  13. Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
  14. Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
  15. Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
  16. Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
  17. Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).
  18. Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
  19. Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
  20. Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
  21. Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
  22. Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).

Tags

Biologi sag 137 Ribonucleotide vedtægter DNA-replikation RNase H2 alkalisk gel elektroforese udsving test mutagenese
Studere Ribonucleotide vedtægter: Strand-specifik påvisning af Ribonucleotides i gær genom og måling Ribonucleotide-induceret mutagenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhou, Z. X., Williams, J. S.,… More

Zhou, Z. X., Williams, J. S., Kunkel, T. A. Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis. J. Vis. Exp. (137), e58020, doi:10.3791/58020 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter