Summary
Ribonucleótidos están entre los nucleótidos no canónico más abundantes incorporados en el genoma durante la replicación del ADN nuclear eucariótica. Si no quitado, ribonucleótidos pueden causar mutagénesis y daño de la DNA. Presentamos dos enfoques experimentales que se utilizan para evaluar la abundancia de incorporación ribonucleótido en ADN y sus efectos mutagénicos.
Abstract
La presencia de ribonucleótidos en el ADN nuclear ha demostrado ser una fuente de inestabilidad genómica. El grado de incorporación de ribonucleótido puede evaluarse por hidrólisis alcalina y electrophoresis del gel del RNA es muy susceptible a hidrólisis en condiciones alcalinas. Esto, en combinación con el análisis de Southern blot puede utilizarse para determinar la ubicación y el filamento en la que se han incorporado los ribonucleótidos. Sin embargo, este procedimiento es solamente semicuantitativa y puede no ser lo suficientemente sensible para detectar pequeños cambios en el contenido de ribonucleótido, aunque específicos de filamento Southern blot sondeo mejora la sensibilidad. Como una medida de una de las más sorprendentes consecuencias biológicas de ribonucleótidos en el ADN, mutagénesis espontánea pueden ser analizada utilizando un ensayo de mutación adelante. Mediante genes reporteros apropiados, mutaciones raras que resulta en la pérdida de función pueden ser seleccionada y en general y las tasas de mutación específica pueden medirse mediante la combinación de datos de experimentos de fluctuación con secuencia de la DNA del gene del reportero. El ensayo de fluctuación es aplicable para examinar una gran variedad de procesos mutagénicos en fondo genético específico o condiciones de crecimiento.
Introduction
Durante la replicación del ADN nuclear eucariótica, ribonucleótidos se incorporan en el genoma por todos tres principales replicases de ADN, ADN polimerasas (Pols) α, ε y δ1,2. Reparación de la supresión de Rnasa dependiente de H2 ribonucleótido (RER3) elimina la mayoría de estos ribonucleótidos incrustados.
Un ribonucleótido en el ADN es susceptible a la hidrólisis, como el grupo hidroxilo 2' de la molécula de azúcar puede atacar el enlace fosfodiéster adyacente, liberando un extremo con un 2' - 3' fosfato cíclico y el otro con un 5'-OH4. Condiciones alcalinas pueden acelerar significativamente esta reacción. Así, la hidrólisis de los ribonucleótidos encajados durante la incubación en una solución básica causa fragmentación de la DNA genomic, que puede ser visualizada por electroforesis de agarosa alcalina5. Este ADN puede ser transferido a una membrana y sondeado por análisis de Southern blot usando sondas específicas de filamento que permiten la identificación de sitios sensibles al álcali causada por ribonucleótidos incorporados en el naciente líder - o -filamento del revestimiento termoaislante ADN, respectivamente.
En las células de levadura que carece actividad Rnasa H2, eliminación de ribonucleótidos se puede iniciar cuando topoisomerasa I (Top1) mellas el ADN en el ribonucleótido encajado6,7. Sin embargo, cuando se segmenta el Top1 del lado 3' de la ribonucleótido, esto genera OH 5' y 2' - 3' fosfato cíclico ADN extremos que son refractarios a la religación. La falta de reparación o procesamiento aberrante de estas 'tapas sucias' puede conducir a inestabilidad genómica. Además, si la incisión se produce dentro de una secuencia de ADN repetida, el proceso de reparación puede llevar a mutaciones de la canceladura. Esto es particularmente problemático para repeticiones en tándem, donde corto las canceladuras (de entre dos y cinco pares de bases) se observa comúnmente en las células deficientes de H2 de Rnasa. Los efectos deletéreos de Top1-dependiente en la ausencia de levadura Rnasa H2 actividad se exacerban en un mutante ε de polimerasa de la DNA (M644G pol2) promiscuo para incorporación de ribonucleótido durante el naciente líder síntesis de strand.
Procesamiento de ribonucleótidos en el ADN conduce a mutaciones espontáneas y este mutagénesis puede detectarse utilizando genes del reportero apropiada y seleccionando el cambio fenotípico que lo acompaña. Una prueba de fluctuación o experimento de Luria y Delbrück es uno de los métodos más utilizados para medir las tasas de mutación espontánea utilizando seleccionable reporter genes8,9. En la levadura, los genes URA3 y CAN1 pueden utilizarse como reporteros en un ensayo de mutación adelante, que permite la detección de todos los tipos de mutación que resultan en la pérdida de función del gene. La tasa de mutación espontánea es estimada como la media de lo observado para múltiples culturas paralelas de colonias individuales sin mutaciones en el gene del reportero de destino. Una levadura Rnasa H2-deficiente tensión tales como rnh201Δ tiene una tasa de mutación espontánea en general moderadamente elevada en gran parte causado por una elevada incidencia de deleciones de bp 2-5 en tándem de secuencias repetidas. Así, para caracterizar completamente los efectos mutagénicos de ribonucleótidos en el genoma, las tasas de mutación específica tiene que determinarse. En este caso, los genes del reportero URA3 o CAN1 pueden ser amplificados y secuenciados para determinar los tipos y localizaciones de las mutaciones, y pueden calcularse tasas de mutación específica. Compilación de mutaciones identificadas en varios mutantes URA3 o CAN1 independiente puede utilizarse entonces para generar un espectro de mutación.
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Protocol
1. alcalina hidrólisis y filamento específico Southern Blot (figura 1)
- Crecimiento y aislamiento de ADN genómico de la célula
- Aislar el ADN genómico de levadura usando una kit de purificación de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante de la levadura. Uso de las culturas que se encuentran en la fase exponencial de crecimiento entre (densidad óptica de 0.5) y 1. Resuspender el precipitado de ADN final en 35 mL de 1 x de tampón TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM ácido de etilendiaminotetracético (EDTA)).
- Añadir 1 mL de 5 mg/mL Rnasa A para el ADN e incubar 30 min a 37 ° C.
- Precipitar el ADN con 0,1 volúmenes de acetato de sodio de 3 M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol al 100% por 20 min en hielo.
- Centrifugar a 16.000 x g por 20 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante con una pipeta.
- Lavar el pellet dos veces con 500 mL de etanol al 70%. Quite el sobrenadante con una pipeta.
- Secar el pellet en Banco y resuspender en 35 ml de 1 x de buffer TE.
- Cuantificar el ADN utilizando un Fluorímetro (Tabla de materiales) con el dsDNA kit BR ensayo.
- Precipitar el magnesio 5 del ADN de cada muestra utilizando 0,1 volúmenes de acetato de sodio de 3 M, volúmenes de pH 5.2 y 2,5 de 100% EtOH para un volumen total de 200 mL (si es necesario, adicional de 5 mg de ADN es necesaria si el gel neutro de control es necesario, agregue H2O). Incubar en hielo por 20 min.
- Centrifugar a 16.000 x g por 20 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante con una pipeta.
- Secar el pellet en Banco. Resuspender el DNA en 14 mL de H2O.
- Electroforesis alcalina de hidrólisis y gel
- Añadir 6 mL de 1 M de KOH e incubar a 55 ° C por 2 h.
- Incubar las muestras en hielo durante 5 minutos.
- Añadir 4 mL de 6 x de buffer de carga alcalina de ADN: 300 mM KOH, 6 mM EDTA, pH 8.0, 18% polysucrose (Tabla de materiales), 0.15% verde de bromocresol y 0.25% xileno cyanol FF.
- La fundición de un gel alcalino que se compone de 1% agarosa, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Utilice un peine que permite 24 mL de muestra de ADN para ser cargado por carril.
- Correr el gel a temperatura ambiente en 1 x buffer de electroforesis alcalina: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Incluyen un adecuado marcador de tamaño de DNA.
- Desactivación de los tubos brevemente y cargar la muestra entera 24 mL en el gel de agarosa alcalina. Electrophorese durante 30 min a 30 V, seguido por 18-20 h a 10 V.
- Neutralizar el gel para 2 incubaciones de 45 min a temperatura ambiente con agitación suave en el tampón de neutralización I: 1 M Tris-HCl, 1,5 M de NaCl.
- Mancha el ADN sumergiendo el gel neutralizado en 200 mL de agua que contiene una dilución 1/10.000 de tintura SYBR oro por 2 h a temperatura ambiente con agitación suave.
- Visualizar el ADN utilizando un transiluminador UV. Aumento de la sensibilidad de álcali provoca la aparición de pequeños fragmentos de ADN, lo que indica una mayor densidad de ribonucleótidos rupturas en el ADN5.
- Transferencia de meridional
- Transferir el ADN desde el gel alcalino a la membrana de nylon cargada positivamente por acción capilar10. Un ejemplo de cómo se puede configurar este traslado está previsto en el manual Sambrook y Russell10.
- Remojo el gel alcalino durante 15 min a temperatura ambiente en Buffer alcalino transferencia: 0.4 M NaOH, 1 M NaCl.
- Mojar la membrana de nylon (cortar al tamaño del gel) brevemente con agua y luego reposar 5 min en alcalina tampón de transferencia.
- Establecer la plataforma de transferencia invirtiendo 3 vasos de vidrio (100 mL) en un vaso de hornear. Este plato debe ser ligeramente mayor que el tamaño del gel de agarosa. Fijar una placa de vidrio sobre la parte superior de ellos.
- Cuelgue la placa de vidrio de 2 pedazos grandes de 3 MM CHR cromatografía en papel (el tamaño de la anchura del gel más lados más largos que pueden cuelgue de los bordes en el tanque del almacenador intermediario).
- Vierta alcalina tampón de transferencia sobre el papel de cromatografía y mitad llenar el plato de vidrio. Suavizar las burbujas con una pipeta de vidrio de 5 mL.
- Colocar el gel de agarosa en la parte superior, otra vez suaviza las burbujas. Alrededor de los bordes del gel con parafilm. Vierta una pequeña cantidad de tampón alcalino de transferencia en el gel.
- Coloque la membrana de nylon previamente remojadas en la parte superior del gel. Suavizar las burbujas.
- 2 pedazos húmedos de papel se cortan con el tamaño del gel de agarosa. Colocar encima de la membrana y alise cualquier burbuja.
- Coloque una pila grande de toallas de papel (corte a un tamaño ligeramente más grande que el gel de agarosa) en la parte superior el sándwich de transferencia. Con cuidado coloque una placa de vidrio sobre las toallas de papel. Agregar un objeto cargado a la parte superior (un libro con una masa de 400 g funciona bien).
- Que la transferencia de proceder durante la noche a temperatura ambiente.
- Cuidadosamente la pila de transferencia separar y remoje la membrana durante 15 min a temperatura ambiente en el II de tampón de neutralización: 0.5 M Tris-HCl, pH 7.2, 1 M NaCl.
- Reticulación de la DNA a la membrana de nylon cargada usando un crosslinker UV. Colocar la membrana en la vinculante y utilice la opción autocrosslink.
- Preparación de la sonda sur
Nota: El procedimiento descrito aquí para detectar sitios sensibles al álcali en el naciente líder-versus filamento del revestimiento termoaislante del filamento de la DNA se basa en un protocolo publicado previamente11. Para nuestro experimento, sondeo se realiza en el gene del reportero URA3 que se ha insertado en una de dos orientaciones (OR1 o OR2) adyacentes al origen de replicación de ARS306 en el cromosoma III (Figura 3A). La presencia de sitios sensibles al álcali en el ADN genómico de levadura es un indicador de la incorporación de ribonucleótido, permitiendo el uso de ribonucleótidos como los biomarcadores de ADN polimerasa actividad12,13,14. Este enfoque, con un objetivo de secuencia de ADN adyacente al eficiente ARS306 origen de replicación, debe prestarse a otras localizaciones genómicas y genes de la blanco.- Segmento de par 520-base de amplificación PCR del gen reportero URA3 utilizando el siguiente par de cartilla: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) y URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).
- Realizar la reacción de PCR con 10-20 ng de ADN genómico de levadura como plantilla, 4 μL de cada cebador (10 μM de valores), 10 μL de 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 8 μL de mezcla de dNTP (2,5 mM), 0.5 μL de Ex Taq ADN polimerasa (5 U/μL) y ajustar el volumen final a 100 μL con H2O.
- Ejecutar el siguiente programa PCR: 95 ° C por 5 min; 30 ciclos de 95 ° C por 1 min, 55 ° C por 1 min, 72 ° C por 2 min; 72 ° C durante 10 minutos y mantener a 4 ° C.
- Purificar el producto PCR utilizando un kit de potabilización de la polimerización en cadena y eluir el ADN con 50 mL de H2O. Esto puede usarse ahora como la plantilla en la reacción radiolabeling.
- Utilice los siguientes iniciadores para filamento específico radiolabeling: uso URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) para la visualización de ADN que recuece a sonda A. Esto corresponde al naciente líder hebra ADN se haya URA3 OR2 y tnascent quedando el filamento de la DNA cuando URA3 OR1. Utilice URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) para la visualización de DNA naciente que recuece a sonda B. Esto corresponde al naciente líder hebra ADN se haya URA3 OR1 y revestimiento naciente filamento de la DNA se haya URA3 OR2 (figura 3).
- Realizar la reacción radiolabeling con 10-20 ng amplificado URA3 fragmento como plantilla de ADN, 2 μL de cebador (stock de 10 μM), 5 μL de 10 x Ex Buffer Taq (Mg2 + plus), 4 μL de dNTPs 2,5 mM (menos dCTP), 5 μL (50 μCi) de a -32P-dCTP , 0.5 μL de ExTaq ADN polimerasa (5 U/μL) y ajustar el volumen final de 50 μL con H2O. ejecutar el siguiente programa para radiolabeling: 94 ° C por 5 min; 25 ciclos de 94 ° C por 1 min, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 1 min; 72 ° C por 5 min y mantener a 4 ° C.
- Utilizar una columna de giro G-25 para quitar etiqueta radiactiva no incorporada. Antes de añadir la muestra radiactiva, centrifugar la columna durante 1 min a 720 x g e impresor buffer mediante pipeteo. Cargar el producto de la reacción radiactiva y centrifugar durante 2 min a 720 g x a fin de eluir la sonda marcada.
- Incubar a 95 ° C por 5 min desnaturalizar la sonda inmediatamente antes de la hibridación. Dejar enfriar brevemente en el hielo.
- Hibridación de Southern
- Rollo de la membrana mojada en un tubo de hibridación y añadir 25 mL de tampón de hibridación recién preparado: tampón de fosfato sódico de 0,5 M, pH 7.2, 7% sodio dodecil sulfato (SDS), el 1% de albúmina sérica bovina (BSA). Incubar a 65 ° C durante 1-2 h con la rotación en un horno de hibridación.
- Con cuidado retirar la solución y añadir 25 mL de tampón de hibridación y la sonda radiactivamente. Incubar a 65 ° C durante 16-18 h con la rotación.
- Retirar la solución en un contenedor de residuos radiactivo. Realizar 5 lavados de 5 minutos a temperatura ambiente con fosfato-SDS lavado solución I: 40 mM de tampón fosfato de sodio, pH 7.2, pH de 5% SDS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 8.0.
- Realizar 2 lavados de 15 minutos a 65 ° C con fosfato-SDS lavado solución II: almacenador intermediario de fosfato de sodio 40 mM, pH 7.2, 1% SDS, 1 mM EDTA, pH 8.0.
- Quitar la membrana del tubo de hibridación con unas pinzas y colocar en un protector de la manga de plástico abierto. Cubrir y exponer a una placa de imagen. Trate de un número de tiempos que van de 4 h a 4 d de exposición diferentes.
- Si es necesario, pele y vuelva a sonda el blot con una sonda diferente aproximadamente 3 - 4 veces. Para la tira, incubar la membrana por 2 h a 65 ° C en 25 mL de un 50% de formamida, 2 solución de x SSPE.
Nota: 20 x SSPE solución: 3 NaCl M, 0,2 M NaH2PO4, 0.02 M de EDTA, pH 7,4. - Retirar la solución en un contenedor de residuos radiactivo. Realizar 2 lavados de 15 minutos a 65 ° C en fosfato-SDS lavado solución II.
- Verificar la membrana con un contador Geiger y repetir el protocolo de extracción si la señal permanece.
- Realizar la hibridación y la hibridación como se describió anteriormente.
2. medir la tasa de mutación y la especificidad de las cepas de S. cerevisiae
- Preparar el cultivo celular
- Inocular una colonia sola (levadura saludables células toma 2-3 días a 30 ° C a la forma adecuada de tamaño las colonias) cultivada en agar YPD suplementado con adenina 100 mg/mL en 5 mL de caldo YPDA con adenina de 250 mg/mL (la suplementación de la adenina sólo es necesario si la cepa empleada es un auxotroph adenina). Crecer en un Incubador agitador o en un rotador a 30 ° C hasta que la cultura llegue a saturación (36-48 h para una cepa sin un defecto de crecimiento grave).
- Desactivación de las células a ~ 2000 x g durante 5 minutos.
- Deseche el sobrenadante y lavar las células con 5 mL de agua estéril.
- Resuspender las células en 500 mL de agua estéril.
- Dilución del cultivo celular y galjanoplastia
- Para los controles de no selección, diluir las células en una placa de 96 pocillos por un factor de 1.600.000 y la placa de 100 mL de cada cultivo en una placa completa de (COM).
- Para seleccionar mutantes ura3 , placa 100 mL de células sin diluir en un plato 5-FOA para una cepa de tipo salvaje (WT). Diluir las células en consecuencia si la tasa de mutación de la cepa de interés se espera que sea mayor que en una cepa WT.
- Para seleccionar para can1 mutantes, diluir las células 5 veces y placa 100 mL sobre una placa que contienen canavanina (CAN) para una cepa WT. El factor de dilución es de 0,5.
- Incubar las placas a 30 ° C hasta que se formen las colonias de levadura. Para las cepas sin un defecto de crecimiento, 2-3 días es usualmente suficientes para COM y puede placas y 3-5 días para las placas 5-FOA. Para comparar las tasas de mutación entre diferentes cepas, es mejor elegir el mismo día de crecimiento en contar las colonias. Almacenar las placas listas para ser contados en la cámara fría (~ 4 ° C).
- Cálculo de la tasa de mutación espontánea
- Contar las colonias visibles en cada plato y tomar notas de los números de la Colonia
- Calcular la tasa de mutación con la fórmula de Drake: μ = f ÷ ln (μNt). f es la frecuencia de mutación calculada por el número de mutantes dividido por el número de células en el cultivo final. NT es el número de células en el cultivo final y μ es la tasa de mutación. Esta ecuación puede resolverse por un método iterativo como el método de Newton-Raphson. Hay otros métodos de estimador, incluyendo la prueba Lea y Coulson, para calcular la tasa de mutación15.
- Calcular el intervalo de confianza suponiendo que registro normal distribución de las tasas de utation de aislamientos individuales. Más a menudo se utiliza el intervalo de confianza de 95%.
- Análisis del espectro de la mutación
- Escoja una sola Colonia de cada 5-FOA o puede placa y refrescar en una placa YPDA.
- Realizar Colonia PCR para amplificar el gen URA3 o CAN1 y secuencia para la detección de mutaciones mediante los siguientes cebadores: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') y URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') para ambos amplificación por PCR y secuencia del gene 800 bp URA3 ; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') y CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') para la amplificación y CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') y (CAN1-BR 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') para la secuenciación del gen reportero 1800 bp CAN1 .
- Para realizar la PCR de Colonia, resuspender una colonia solo en 5 μL de H2O y use 1 μL como plantilla. Añadir 1 μL de cada uno de los iniciadores (5 μM de valores), 2 μL de tampón de x KAPA2G 5 (Mg2 + plus), 0.5 μL de dNTP (2,5 mM), 0.5 μL de KAPA2G Fast DNA polimerasa, 12 μL de H2O.
- Para la amplificación del gen URA3 , ejecutar el siguiente programa PCR: 95 ° C por 5 min; 5 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 61 ° C durante 15 s, 72 ° C por 30 s; 35 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 61 ° C durante 15 s, 72 ° C por 30 s; 72 ° C durante 2 minutos y mantener a 4 ° C. Para la amplificación del gen CAN1 , ejecutar el siguiente programa PCR: 95 ° C por 5 min; 5 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 61 ° C durante 15 s, 72 ° C por 45 s; 35 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 61 ° C durante 15 s, 72 ° C por 45 s; 72 ° C durante 2 minutos y mantener a 4 ° C.
- Alinear los resultados de la secuencia a la secuencia de referencia utilizando un programa como DNASTAR Seqman Pro o Sequencher identificar mutaciones.
- Compilar los datos de mutaciones mutación tipo (figura 4) o localización de la mutación (figura 5). Calcular las tasas de mutación específica por la frecuencia de una mutación (el número de eventos observados dividido por el número de mutantes secuenciado) multiplicaron por la tasa de mutación.
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Representative Results
Tratamiento de la DNA genomic con álcalis seguido de electroforesis alcalina permite la detección semicuantitativa de la fragmentación del DNA debido a la abundancia de ribonucleótidos estable incorporados. La figura 2 muestra las imágenes de gel de la DNA de genomic tratada con o sin KOH5de levadura. La variante M644L de Pol2, la subunidad catalítica de la Polε, ha reducido la capacidad de incorporación de ribonucleótidos mientras que el mutante de M644G incorpora más ribonucleótidos que la polimerasa de la WT. Como se detalla en el protocolo, el gel alcalino puede ser más explorado por análisis de Southern blot específica de filamento. Con el conocimiento de la ubicación del sitio sondeado genómica en relación con sus orígenes adyacentes, nosotros podemos sonda selectivamente ribonucleótidos incorporados a la naciente líder o filamentos del revestimiento. La figura 3 muestra los resultados de Southern blot sondeando el gene del reportero URA3 introducido en dos orientaciones opuestas que cerca de un origen de replicación temprana leña, ARS30616. Por la utilización de sondas específicas de strand, observamos el patrón de fragmentación de DNA causado por álcali-escote en ribonucleótidos en el naciente líder ADN de filamento en una cepa WT y en cepas que expresan las variantes de polimerasas α, δ y ε que son promiscuas para incorporación de ribonucleótido.
Mediante un experimento de fluctuación, podemos medir las tasas de mutación de cepas de levadura que contiene genes del reportero. La figura 4 muestra las tasas de mutación en el URA3 y CAN1 loci de las cepas expresan polimerasa WT o el mutante pol2-M644G con o sin funcional de Rnasa de H2. La ausencia de ARNasas H2 causa un aumento moderado en general tasas de mutación en los dos fondos. Sin embargo, el examen más detenido de la especificidad de la mutación revela que en las cepas que carecen Rnasa H2 (figura 5), hay un fuerte incremento en la tasa de mutación para las canceladuras cortas, especialmente en secuencias de la repetición tándem. Figura 5A compara la especificidad de la mutación en cepas de201Δ de peso y el rnh y la figura 5B muestra el efecto mutacional más elevado ribonucleótido incorporación en la cadena naciente de ADN líder Pol ε.
Figura 1: Protocolo de pasos involucrados en la detección específica de filamento de sitios sensibles al álcali causada por ribonucleótido incorporación ADN genómico de levadura. Un resumen de los distintos pasos principales implicados en este procedimiento, comenzando con el aislamiento de ADN genómico de levadura y proceder a través del análisis de Southern blot final. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: una imagen representativa de los resultados obtenidos por electroforesis del gel de agarosa alcalina. Esta figura ha sido adaptada de Nick McElhinny, A. S. et al. 5. levadura de ADN genómico de las cepas de diferentes genotipos de trataron con KCl (neutro) o KOH (alcalina) y luego separados en un gel de agarosa neutro o alcalino. "Peso" y "M644G" indican el estado de Pol ε. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: cadena específicos de sondeo de un gel de agarosa alcalinas por Southern blot. Esta figura ha sido adaptada de Williams, J. S. et al. 13. (A) las sondas radiactivos recuecen al naciente líder filamento de la DNA en el gen URA3 reportero que se ha insertado cerca de ARS306 en dos orientaciones opuestas (OR1 y OR2). (B) resultados representativos de borrar meridional con el nacientes líderes específico de filamento las puntas de prueba. Muestra son los resultados del sondeos para el naciente filamento principal en una cepa con polimerasas de la DNA de la WT o L868M pol1, pol2 M644G pol3-L612M variante con o sin Rnasa H2. Los genes POL1, POL2 y POL3 codifican subunidades catalíticas de Pols α, ε y δ, respectivamente. Las variantes son más promiscuas para incorporación de ribonucleótido5,12,17. (C) la cuantificación de la señal de radioactiva por la fracción del total en cada carril de (B). Valores se expresan como un porcentaje del total. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: tasas de mutación espontánea en cepas de levadura. Esta figura ha sido adaptada de Nick McElhinny, A. S. et al. 5. los genes del reportero URA3 y CAN1 fueron utilizados en el ensayo de mutación adelante para medir las tasas de mutación de las cepas indicadas. URA3 reportero está en "posición 2" (OR2, Figura 3A). El intervalo de confianza de 95% (IC) se incluye para cada medición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: espectros de mutación para el gen reportero de URA3-OR2. Esta figura ha sido adaptada de anteriores publicaciones5,18,19,20. El tipo de posición y de la mutación observado en cada colonia 5-FOA-resistente independiente seleccionada en el ensayo de mutación adelante están representados en el 804 bp URA3 secuencia de codificación. Letras indican base de sustituciones, triángulos abiertos indican eliminaciones base sola, triángulos cerrados indican inserciones base sola y líneas sólidas indican eliminaciones corto. (A) espectros de mutación en cepas WT y rnh201Δ . Etiquetas rojas por encima de la secuencia son las mutaciones observadas en peso mientras que azul etiquetas debajo de la secuencia son los observados en una variedad de rnh201Δ . (B) espectros de mutación en cepas M644G pol2 y pol2-M644G rnh201Δ . Etiquetas rojizas encima de la secuencia son las mutaciones observadas en pol2 M644G mientras azul debajo de la secuencia de cepas pol2-M644G rnh201Δ . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, describimos a los protocolos de dos series de experimentos que se utilizan con frecuencia para analizar cuantitativamente los ribonucleótidos incorporados durante la replicación del ADN y los efectos mutagénicos de ribonucleótidos rupturas. Aunque estos enfoques involucran el eukaryote modelo S. cerevisiae, estas técnicas se pueden adaptar fácilmente a otros microbios y eucariotas superiores incluso.
Sondeo de ribonucleótidos rupturas en el ADN mediante electroforesis en agarosa alcalinas juntada con borrar meridional proporciona información importante sobre el número de presentes de ribonucleótidos y la hebra en el cual se han incorporado. Sin embargo, es importante tener en cuenta que álcali-la sensibilidad también puede ser causada por otras lesiones del ADN, como un sitio abásico. Otro medio de detección de ribonucleótidos en el ADN es el tratamiento con la enzima purificada de Rnasa H2, como se ha hecho en células de mamífero21. Aunque nuestro enfoque implica sondear para sitios sensibles al álcali en el naciente líder versus quedando hebras en el gene del reportero URA3 utilizados en nuestros experimentos de análisis mutacional, es posible diseñar las sondas que hibridan en otros lugares en orden para obtener información importante con respecto a la densidad de ribonucleótido en otros sitios genómicos. La mancha blanca /negra meridional parte del procedimiento también puede utilizarse como referencia para otros genéricos experimentos de sondeo de ADN.
Medición de tasas de mutación mediante una prueba de la fluctuación ha sido ampliamente utilizado para el análisis de varios eventos mutagénicos en microorganismos y así no se limita al análisis de las consecuencias mutagénicas de ribonucleótidos en el ADN. Para este experimento, aumentando el número de culturas independientes puede realzar grandemente la exactitud de la medición. Colonias independientes pueden obtenerse por rayar una cepa de interés en medio YPDA o por el análisis de las colonias de esporas independientes obtenidos por disección de la tétrada de una mancha de levadura diploide. Idealmente, el uso de múltiples levaduras haploides independientes (e.g., de disección de la tétrada) se anima a minimizar el impacto de la variación de cepa a cepa. Esto es particularmente importante cuando la tasa de mutación espontánea es alta o cuando la cepa presenta un defecto de crecimiento. Un método adicional que puede ser empleado para medir espontánea la tasa de mutación es una acumulación de la mutación experimento22. En este análisis, frecuencia de mutación se determina para las células después de crecimiento extenso y puede ser utilizado para calcular la tasa de mutación. Acoplamiento de un experimento de acumulación de la mutación con la tecnología de secuenciación profunda ha demostrado ser una poderosa herramienta para analizar la tasa de mutación y la especificidad en el genoma.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los actuales y ex miembros del laboratorio de Kunkel por su trabajo y discusiones relacionadas con protocolo y reutilizar los datos presentados aquí. Este trabajo fue apoyado por proyecto Z01 ES065070 a T.A.K. de la división de investigación intramuros de los institutos nacionales de salud (NIH), nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
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