Summary
Diese Methode ermöglicht Decellularization ein komplexes solide Organ mit einem einfachen Protokoll basierend auf osmotischen Schock und Durchblutung des Ionischen Waschmittel mit minimalen Orgel Matrix Störung. Es verfügt über eine neuartige Decellularization-Technik für die Herzen der Menschen in einem unter Druck stehenden Beutel mit Echtzeit-Überwachung der Strömung Dynamik und zellulären Schutt Abfluss.
Abstract
Die ultimative Lösung für Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz ist Organtransplantation. Aber Spender Herzen sind begrenzt, Immunsuppression erforderlich ist und letztendlich Ablehnung auftreten kann. Erstellen einer funktionalen, könnte autologes Bio-künstliches Herz diese Herausforderungen lösen. Biofabrication eines Herzens bestehend aus Gerüst und Zellen ist eine Option. Eine natürliche Gerüst mit gewebespezifischen Zusammensetzung sowie Mikro- und Makro-Architektur erhalten Sie von einem Herzen von Menschen oder große Tiere wie Schweine. Decellularization beinhaltet Zelltrümmer und gleichzeitig 3D extrazellulären Matrix und Gefäßsystem und damit "Cellularization" auf einen späteren Timepoint auswaschen. Aufbauend auf unseren Roman zu finden, dass Perfusion Decellularization komplexe Organe ist möglich, entwickelten wir eine weitere "physiologisch" Methode, um nicht transplantable Menschenherzen zu decellularize, indem man sie in einem unter Druck stehenden Beutel in einem umgekehrten Orientierung unter kontrollierter Druck. Der Zweck der Verwendung eines unter Druck stehenden Beutels ist die Schaffung Druckgradienten über die Aortenklappe geschlossen halten und Verbesserung der myokardialen Perfusion. Gleichzeitige Beurteilung der Strömungsdynamik und Zelltrümmer Entfernung bei Decellularization erlaubt uns, sowohl Flüssigkeit und Schmutz Abfluss zu überwachen, damit erzeugen ein Gerüst, das sein kann entweder für einfache kardiale Reparatur verwendet (z.B. als Pflaster oder Ventil-Gerüst) oder als Ganzes-Orgel Gerüst.
Introduction
Herzinsuffizienz führt zu hoher Sterblichkeit bei Patienten. Die ultimative Behandlungsoption für terminaler Herzinsuffizienz ist allo-Transplantation. Jedoch gibt es eine lange Warteliste für eine Transplantation aufgrund des Mangels an Spenderorganen und Patienten Gesicht nach Transplantation Hürden, die von lebenslange Immunsuppression zu chronischen Orgel Ablehnung1,2reichen. Bioengineering funktionale Hearts von Wiederbevölkerung decellularized menschlicher Herzen mit einer patienteneigenen Zellen könnten diese Hürden3zu umgehen.
Ein wichtiger Schritt in der "Technik" ein Herz ist die Schaffung ein Gerüst mit geeigneten Gefäß- und parenchymatösen Struktur, Zusammensetzung und Funktion um die Ausrichtung zu führen und Organisation von gelieferten Zellen. Im Beisein der geeignete Rahmen sollte Zellen ausgesät auf dem Schafott die Umwelt zu erkennen und erfüllen die erwartete Funktion als Teil dieses Organs. Unserer Meinung nach umfasst decellularized Orgel extrazelluläre Matrix (dECM) die notwendigen Merkmale das ideale Gerüst.
Durch die Verwendung von intrinsischen Gefäßsystem, kann komplexe ganze-Orgel Decellularization durch Antegrade oder retrograde Perfusion4 zelluläre Komponenten zu entfernen, unter Beibehaltung der zarten 3D extrazelluläre Matrix und Gefäßsystem2erreicht werden, 5,6,7. Eine funktionale Gefäßsystem ist in Bioengineering ganze Organe nur wichtig, wie in Vivo, Nährstoffverteilung und Abfallentsorgung8. Koronaren Perfusion Decellularization nachweislich wirksam bei der Schaffung von decellularized Herzen von Ratten4oder Schweine4,7,9,10,11 ,12,13, und Menschen5,7,14,15,16. Jedoch kann die Integrität der Ventile, Atrien und anderen "dünnen" Regionen leiden.
Menschliche Größe decellularized Herzen Gerüste erhalten Sie von Schweinen mit Druck Kontrolle7,9,10,11,12 oder Infusion Flow Rate Control13, 17 und5,7,14,15von menschlichen Spendern mit Druck zu kontrollieren. Decellularization der menschlichen Spender Herzen erfolgt über 4-8 Tage unter Druck auf 80-100 MmHg in aufrechter Orientierung5,15,16 oder über 16 Tage unter Druck gesteuert um 60 MmHg14 gesteuert . Unter Antegrade, druckgesteuerten Decellularization spielt die Aortenklappe Kompetenz eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der koronaren Perfusion Effizienz und stabile Druck an die Aortenwurzel. Unsere bisherige Arbeit ergab, dass die Ausrichtung des Herzens die koronaren Perfusion Effizienz während des Decellularization-Verfahrens und damit das Gerüst Integrität im Ende9beeinflusst.
Als Fortsetzung von unserer bisherigen Arbeit9stellen wir ein neuartiges Konzept, wobei ein Herzbeutel-wie Beutel hinzugefügt wird, um vollem Herzen Decellularization zu verbessern. Wir beschreiben die Decellularization menschlicher Herzen platziert in unter Druck stehenden Beutel, umgekehrt orientiert, und unter Druck auf 120 MmHg auf die Aortenwurzel gesteuert. Dieses Protokoll umfasst die Überwachung der Strömungsprofil und Sammlung von Abfluss Medien während des Decellularization-Verfahrens, koronaren Perfusion Effizienz und Schmutzentfernung Zelle zu bewerten. Biochemische Tests werden dann durchgeführt, um die Wirksamkeit der Methode zu testen.
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Protocol
Alle Experimente eingehalten, die Ethik-Ausschuss Leitlinien aus Texas Heart Institute.
1. Orgel-Vorbereitung
Hinweis: In Zusammenarbeit mit LifeGift, einer Non-Profit-Organbeschaffungsorganisation in Texas (http://www.lifegift.org), spendete die Herzen der Menschen nicht geeignet für Transplantation waren für die Forschung mit zugelassenen Zustimmung verwendet.
- Um Herzen zu beschaffen, die intravenös Infusion 30.000 U Heparin in die Herzen. Sicher Naht Kardioplegie Kanüle in der Aorta und befestigen Sie eine eingespannte Perfusion-Linie. Perforieren der minderwertigen Vena Cava (IVC), das rechte Herz zu lüften. Schneiden Sie die linken überlegen Pulmonalvene oder die linken atrial Anhängsel, die linken Herzkammern vent.
- 1 L Kardioplegie oder heparinisierten Kochsalzlösung einzuflößen. Sezieren Sie Aortenbogen Zweigen, Vena Cava superior (SVC) und andere Lungenvenen, das Herz von Pfändungen Gefäß- oder umliegenden Gewebe freizugeben. Tauchen Sie gut heparinisierten Herzen in vereisten Salzlösung.
- Überprüfen die gespendeten menschlichen Herzens (anterior und nach hinten, Abbildung 1). Legen Sie das Herz in einen sezierenden Fach und für strukturelle Schäden oder anatomische Fehlbildungen zu inspizieren. Leber und/oder Lunge für die Transplantation beschafft wurden, kann das Herz mit einer kurzen minderwertige Vena Cava und/oder Abwesenheit des linken atrial hinteren Wand darstellen.
- Interne Inspektion auf mögliche Mängel - Vorhofseptumdefekt (ASD), Ventrikelseptumdefekt (VSD) oder Fehlbildung Ventil (pulmonale, Aorten-, Mitral-, dreiaufklappbar) durchzuführen.
- Wenn ein septal Defekt vorhanden ist, korrigieren Sie es mit geeigneten Nähten (Abb. 2A, 2 b). Die Korrektur von septal defekten wird benötigt, um Decellularization über Pulmonalarterie (PA) Abfluss Trübungsmessung Fortschritte. Korrektur des septal defektes entfernt Links zum rechten Shunt, daher, der Abfluss von PA stellt den Abfluss aus dem Herz-Kreislauf durch den Koronarsinus.
- Verbinden Sie superior und inferior Vena Cava mit 2: 0 Seide Naht (Abbildung 2).
- Die Aorta (Ao) vom Haupt-PA (Abb. 2D) für anschließende Kanülierung zu sezieren.
- Einsetzen Sie Steckverbinder, basierend auf den Durchmesser des Gefäßes, (Abbildung 3) in Ao und PA und sichern sie mit 2: 0 seidenen Fäden (Abb. 4A).
- Fügen Sie eine Röhre Zeile durch den linken Vorhof (Abbildung 4 b) und in Richtung der linke Ventrikel (LV) (Abbildung 3), unter Verwendung eines Pulmonalvene Körperöffnungen.
- Schließen Sie einen Infusionsschlauch an den Anschluss in der Ao und der Abfluss-Linie, die in der PA (Abbildung 3) gelegt.
- Setzen Sie die vorbereiteten Herzen ein Polyester Tasche in umgekehrter Orientierung (Kopf).
- Legen Sie den Beutel mit Herz in einen Behälter Perfusion und schließen Sie den Deckel (Abbildung 4).
- Schließen Sie jede der Linien an den jeweiligen Häfen in den Gummistopfen (basierend auf den Durchmesser des Behälters) und legen Sie es auf den Deckel des Behälters Perfusion den Polyester-Beutel (Abbildung 4 und Abbildung 5 b) abzudichten.
- Durchspülen Sie 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (136 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,8 mM KH2PO4 in destilliertem Wasser, pH 7,4) über die Infusion Port des Gummistopfens Abfluss aus der PA und von der Linie überprüfen in LV eingefügt
- Verwenden Sie diese Strömung um das Organ des verbleibenden Spuren von Blut in das Gefäßsystem zu reinigen. Fluss nicht beachtet, ziehen Sie die Anschlussleitungen an, wie sie lose sein könnten.
2. System-Setup und Orgel Decellularization Verfahren
- Montieren Sie des Bioreaktors und legen Sie in eine aufrechte Ausrichtung (Abbildung 5). Die Perfusion System beinhaltet einen Personal Computer (PC), Proportional-Integral-Derivat (PID) Controller, einer peristaltischen Pumpe für Ao-Infusion, Perfusion Bioreaktor, ein Kopf Druckbehälter für LV Perfusat Retention (2L Sauger Flasche mit Boden Nebenarm), und einer peristaltischen Pumpe, überschüssigen Flüssigkeit aus dem Kopf Druckbehälter abzulassen und den Abfluss von PA zu sammeln
- Verbinden Sie in der Gummiseptum den Infusionsschlauch, Druck-Kopf Line, PA-Abfluss Linie und Bioreaktor Entwässerung Line mit den Kautschuk GAP Oberfläche Anschlüssen über die Perfusion Bioreaktor (Abb. 5A) platziert.
- Decellularize Herzen unter dem ständigen Druck von 120 MmHg gemessen an der Aortenwurzel. Mitteldruck der LV sollte innerhalb von 14-18 MmHg während des gesamten Decellularization-Prozesses.
- Decellularize Herzen wie folgt: 4 h der hypertonen Lösung (500 mM NaCl), 2 h Hypotonische Lösung (20 mM NaCl), 120 h Sodium Dodecyl Sulfat (1 % SDS) Lösung, und eine endgültige waschen mit 120 L 1 X PBS (Abb. 6A).
- Decellularize die Herzen unter konstantem Druck-Kontrolle (120 MmHg). Infusion Durchflussmenge in Ao ist Herz-abhängig und ist im Durchschnitt 98.06±16.22 mL/min für Hypertone Lösung, 76.14±7.90 mL/min für hypotone Lösung und 151.50±5.76 mL/min für SDS 185.24±7.10 mL/min für PBS. Im Durchschnitt verbrauchten Gesamtvolumens von jedem Reagenz 23.36±5.70 L für Hypertone Lösung und 9.13±1.26 L für hypotone Lösung.
- Umwälzen Sie die letzten 60 L 1 % SDS (1 L pro Gramm Gewicht Herz) bis zum Ende des SDS Perfusion. Abbildung 6A zeigt eine Zeitleiste für den Decellularization-Prozess Endpunkte für die Datenerfassung zu entlocken: flow Rate Überwachung (Ao und PA) und Abfluss Sammlung (PA und nicht-PA) von Druck Kopf während der Decellularization.
- Da der SVC und IVC ligiert sind, ist es vernünftig anzunehmen, dass alle Flüssigkeit aus der PA gesammelt ist das Ergebnis der tatsächlichen koronaren Perfusion (Abb. 5 b). Koronaren Perfusion Effizienz zu bestimmen, indem man direkt die Durchflussmenge des Perfusat aus der PA durch die Strömungsgeschwindigkeit des infundierten Lösung in Ao:
Koronaren Perfusion Effizienz =
(%). - Vergleichende Analyse der Perfusat erhalten aus der PA und der LV und die infundierten Lösungen in zweifacher Ausfertigung durch 200 μL pro Well in eine klar unten 96-Well-Platte laden und lesen Absorption bei 280 nm. Der Extinktion Wert, empirisch nach dem Versuch verschiedene Werte ausgewählt wurde gefunden, um das beste Werte normalisiert.
- Verwenden Sie die Trübung des sauberen infundiert Reagenz als das Steuerelement. Die Trübung der Abfluss Perfusat stellt Auswaschung von Zellenrückstand und sofort während der Decellularization als ein Tracking-Tool des Prozesses quantifiziert werden kann.
- Während der letzten Wäsche mit 10 L 1 X PBS fügen Sie 500 mL sterile neutralisierte 2,1 % Peressigsäure saure Lösung, mit 10N NaOH, führt zu einer 0,1 % Peressigsäure saure Lösung (V/V) mit PBS-Puffer neutralisiert hinzu. Verwenden Sie diese Lösung, um das Gerüst zu sterilisieren.
(%).3. Bewertung der Decellularized Herzen
Hinweis: Nach Decellularization, repräsentativen Herzen für koronare Angiogramm Bildgebung und biochemischen Assays verwendet werden.
- Führen Sie Koronarangiographie der repräsentativen decellularized das Herz des Menschen, die Unversehrtheit des koronaren Gefäßsystem zu untersuchen. Kurz gesagt, mit Hilfe einer Sonographie, Bild decellularized Menschenherz nach Injektion von Kontrastmittel durch koronare ostial Kanüle in den wichtigsten rechten und linken Koronararterien.
- Sezieren Sie decellularized Herzen um Proben aus 19 Regionen zur Bewertung der verbleibenden Desoxyribonukleinsäure (DNA), Glykosaminoglykan (GAG) und SDS Ebenen in decellularized Gewebe zu erhalten. Entfernen Sie die Basis des Herzens aus Ventrikeln und sezieren Sie die Ventrikel in 4 gleiche Abschnitte (Abbildung 6). Jeder Abschnitt in den vorderen und hinteren rechten Ventrikel (RV), die vordere und hintere LV und der interventricular Septum (IVS) unterteilen. Das Gewebe mit der Spitze ist für die Probenahme in der LV und RV seziert.
- Schneiden Sie Gewebeproben für DNA, Knebel und SDS Assays (~ 15 mg Frischgewicht).
- Extrahieren Sie doppelsträngige DNA (DsDNA) von Proben in 1 M NaOH für 3 h bei 65 ° C zu verdauen und justieren Sie pH bis 7 mit 10 X-Tris-EDTA (TE)-Puffer und 1 M Salzsäure (HCl).
- Ein Kalb Thymus standard eine DsDNA Assay Kit mit DsDNA zu quantifizieren (siehe Tabelle der Materialien). Proben in zweifacher Ausfertigung mit einem Fluoreszenz Mikrotestplatte Reader lesen (Erregung bei 480 nm und Emission bei 520 nm). Berechnen Sie den Prozentsatz der verbleibenden DsDNA in den decellularized Herzen durch den Vergleich DsDNA-Konzentration in jedem Gewebe, dass in cadaveric (% cadaveric).
- Erhalten Sie sulfatierte GAGs in Lösung durch Verdauung Gewebeproben in eine Papain Extraktionslösung (0,2 M Natriumphosphat Puffer mit EDTA Binatrium Salz, Cystein HCl, Natriumacetat und Papain) bei 65 ° C für 3 Stunden. GAG-Inhalt (in zweifacher Ausfertigung) mithilfe eines Glykosaminoglykan Assay Kit zu messen.
- Lyophilize Proben für SDS-Assay in einem beheizten Vakuum und Maßnahme Trockengewicht. Jede getrocknete Probe 200 µL ultrareinem Wasser hinzu und homogenisieren Sie, um die restlichen SDS in Lösung zu extrahieren. Mischen Sie diese SDS-Lösung zu chloroform und eine Methylenblau-Lösung (12 mg Methylenblau in 1 L von 0,01 M HCl). Die SDS wird in der organischen Schicht durch die Bindung an die Methylenblau-Dye trennen.
- Mit einem Fluoreszenz Mikrotestplatte Reader lesen die Extinktion (655 nm) Standards und Proben in zweifacher Ausfertigung, die restliche SDS zu berechnen. Normalisieren Sie diesen SDS-Wert auf Gewebe Trockengewicht.
- Bildbeispiele aus dicken Regionen (d. h. LV, RV und Septum) des menschlichen Herzens mit nichtlinearen optischen Mikroskopie (NLOM), zelluläre entfernen nach Decellularization zu bestätigen. Das NLOM Setup wird in unseren vorherigen Veröffentlichungen18,19,20erläutert. NLOM ermöglicht es uns, Bildzelle, Elastin, Kollagen und Myosin-Fasern durch seine zwei-Photonen-Fluoreszenz (TPF) und zweiten harmonischen Generation (SHG) Kanäle ohne Verwendung einer exogenen Fleck oder Farbstoff21.
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Representative Results
Nach einer 7-Tage-Decellularization mit Antegrade aortalen Perfusion unter dem ständigen Druck von 120 MmHg wandte sich das menschliche Herz transluzente (Abb. 6 b). Das Herz war grob in 19 Sektionen für biochemische (DNA, Knebel und SDS) Analyse (Abbildung 6), um das Endprodukt decellularized bewerten seziert.
Während des Decellularization Prozesses war Fluss Infusionsrate von different Solutions variiert der Druck konstant gehalten. Die Fließgeschwindigkeit in der Ao (Abb. 7A) allmählich verringerte sich von 96.68±23.54 auf 80.59±12.41 mL/min (16,64 %) als die Perfusion Lösung von hypertonen auf hypotone geändert. Im Gegensatz dazu stieg Durchfluss von 71.68±10.63 auf 110.61±14.40 mL/min (54.31 %) als Perfusion Lösung von hypoton mit SDS gewechselt habe. Während die SDS-Perfusion schwankte Infusion Durchfluss zwischen 110±14.40 und 176.31±44.03 mL/min. Die Abflussrate aus PA (Abb. 7 b) zeigte zunächst eine ähnliche Tendenz (Abb. 7A). Jedoch wurde der Abfluss beträgt 1 % SDS Perfusion sank von 35.77±9.07 auf 27.08±4.09 mL/min koronaren Perfusion Effizienz zur Aortenklappe Durchgängigkeit und ähnliche Trends zu bewerten. Wirkungsgrad verringert sich im Laufe der Zeit als verschiedene Reagenzien durchblutet durch das Gefäßsystem (Abbildung 7). Während der ersten Stunde des 1 X PBS waschen Perfusion Effizienz wurde auf den ursprünglichen Wert Pre Hypotonische Lösung restauriert (28.39±3.61 % bei 1 h PBS vs. 31.02±7.16 % 1-h hypoton). Die mittlere koronaren Perfusion Wirkungsgrade lagen 46.08±9.89 %, 28.08±7.12 %, 25.70±5.30 % und 28.39±3.61 % mit der hypertonen Lösung, die hypotone Lösung, 1 % SDS und 1 X PBS bzw. (Abbildung 7).
Da der Abfluss Perfusat aus PA und LV gleichzeitig gesammelt wurden, ihre Trümmer Inhalte könnte sein im Vergleich (Abbildung 8A) durch Spektroskopie Extinktion gemessen bei 280 nm (Abbildung 8 b). Die Trübung des Abwassers aus PA und LV sank im Laufe der Zeit während der Perfusion der jeweiligen Lösung; Trübung aus der PA ergab jedoch einen abrupteren Farbwechsel im Vergleich von LV während der anfänglichen Perfusion Zeit beobachtet werden. Nach der Umstellung von einer hypertonen auf eine Hypotonische Lösung, die Trübung des PA-Abfluss von 1.15±0.03 zu 1.40±0.07 (21.73 % Steigerung) geändert und der LV von 1.13±0.05 auf 1.24±0.07 (9,73 % Steigerung) geändert. Während der ersten Stunde der 1 % SDS Perfusion verändert Trübung von 1.17±0.04 zu 2.77±0.15 (136.75 % Steigerung) für PA und 1.11±0.04, 1.75±0.26 (56,65 Prozent) für das LV-Abwasser. Die Korrelation zwischen Abfluss Trübung und Zelle Schmutz auswaschen war anhand der Bicinchoninic Säuren (BCA) Protein Assays wenn Proteinkonzentration in den Abfluss Proben quantifiziert wurde. Die Ergebnisse aus der Decellularization 6 menschlicher Herzen offenbart eine lineare Korrelation zwischen Proteinkonzentration und Abwasser Trübung mit R2 = 0,95 (Abbildung 8).
Nach Abschluss des gesamten-Herz Decellularization bestätigt die koronare Angiogramm die Erhaltung der intakten koronaren Gefäßsystem (Abbildung 9). Nichtlineare optische Bildgebung des Myokard Schichten aus dicken Bereichen (d.h., RV, LV und Septum) in decellularized Menschenherz bestätigt Zelle entfernen, da keine Zelle Präsenz in TPFS Kanäle (Abbildung 10) beobachtet wurde. Zellen (z.B. Herzzellen oder kardialen Fibroblasten) mit ihren Autofluoreszenz können leicht durch ihre ovale und längliche Form Morphologien in TPFS Kanal identifiziert werden. Um die Wirksamkeit des Decellularization Prozesses und Zelltrümmer Entfernung zu gewährleisten, wurden die decellularized die Herzen der Menschen weiter in 19 Regionen (Abbildung 6), die Ebenen von DNA, sulfatierten GAGs und SDS noch in diesen Regionen zu quantifizieren hochgerechnet. DNA in allen Regionen war weniger als 10 % des cadaveric Herzens. DNA in den rechten Vorhof (8,39-10,38 % im Vergleich zu cadaveric) und linken Atrium (5.11-7.60 %) war die höchste (Abb. 11A).
Abbildung 1: Cadaveric Menschenherz aus einer Orgel Beschaffungsbehörde. Vordere und hintere Ansichten cadaveric menschlichen Herzens. Minderwertige Vena Cava und ein Teil der rechten Vorhof fehlen, wie gestrichelten Gebiet beobachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Inspektion für septal und/oder Ventil anatomische Anomalien. (A) Inspect patent Foramen Ovale (PFO) vorhanden ist (Kommunikation zwischen rechtem und linkem Vorhof). (B) ein 5: 0-Polypropylen-Naht ist kontinuierliche PFO schließen angewandt. (C) rechten Vorhof ist mit einer laufenden Naht 5-0 Polypropylen geschlossen. (D) die wichtigsten Lungenarterie ist weg von der Aorta ascendens durch stumpfe Dissektion seziert. FO: offenes Foramen Ovale; PA: Lungenarterie; AO: Aorta. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Komponenten des Bioreaktors Infusion. Das Decellularization-System besteht aus (A) Gummikappe mit 4 Anschlüssen; (B) Abfluss Linie verbunden werden die Pulmonalarterie (PA); (C, F) Stecker mit Luer-Lock für PA und Aorta (Ao), (D) Einfügen Zeile für den linken Ventrikel (LV), (E) Infusion Linie an der Aorta, Polyester Tasche (G) und (H) Perfusion Behälter angeschlossen werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Menschenherz Kanülierung und Infusion Bioreaktor Montage. (A) Ansicht von ventral des Herzens zeigt Pulmonalarterie (PA) und Aorta (Ao) individuell kanülierte. (B) hintere Ansicht des Herzens zeigt Kanüle an linker Ventrikel (LV) durch Pulmonalvene (PV) gerichtet. (C) menschlichen Herzens innerhalb des Bioreaktors Infusion nach der Montage. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abb. 5: System-Setup der invertierten orientierte Decellularization mit Förderhöhe. (A) das komplette Decellularization-System besteht aus: ein Computer, ein Proportional-Integral-Derivat (PID) Controller, Pumpen, einem Bioreaktor und Stauseen für die Sammlung des Abwassers aus Pulmonalarterie (PA) und linker Ventrikel (LV). AO: Aorta. Pfeile zeigen Fließrichtung. (B) die schematische Darstellung der Einrichtung des menschlichen Herzens innen Perfusion Bioreaktor und der damit verbundenen Fließwege Perfusat/Abwasser während der Decellularization. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Decellularization Verfahren und Post-Decellularization Prüfung eines menschlichen Herzens. (A) schematische Darstellung des Decellularization-Verfahrens. (B) Anterior und posterior Untersuchung eines decellularized menschlichen Herzens. (C) Brutto Dissektion eines menschlichen Herzens in vier Querschnitte (Abschnitt A, Abschnitt D) für die Analyse der biochemischen Assays. Die Färbung in den Herzen der Menschen wird durch passives Lipofuzin Ablagerung verursacht. Die Färbung zeigt normalerweise in ventrikuläre Innenfläche oder die Grenze zwischen Epicardium und Myokard. LA: Linker Vorhof; RA: rechter Vorhof; LV: linke Herzkammer; RV: rechten Ventrikel; ANT: anterior; Post: Posterior; Hyper: Hypertone; Hypo: hypotone; SDS: Sodium Dodecyl Sulfat; PBS: Phosphat gepufferte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Zeitraffer Strömungsdynamik während Decellularization. (A) Fluss Infusionsrate von Decellularization Lösungen in Aorta während der Prozedur. (B) Fließgeschwindigkeit des Abwassers aus PA bei Decellularization. (C) koronaren Perfusion Effizienz beim Decellularization. (D) bedeutet Effizienz der koronaren Perfusion während der Durchblutung der verschiedenen Lösungen/Reagenzien. N = 6. Daten darstellen Mean±SEM. PA: Lungenarterie; Hyper: Hypertone; Hypo: hypotone; SDS: Sodium Dodecyl Sulfat; PBS: Phosphat gepufferte Kochsalzlösung; SEM: Standardfehler von Mittelwert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Zeitraffer Zelle Rückstand Auswaschung während Decellularization. (A) Abfluss Mediensammlung von PA und nicht-PA (linke Herzkammer). (B) Ergebnis der Trübungsmessung bei 280 nm. (C) lineare Korrelation besteht zwischen Proteinkonzentration und Trübung. n = 6 Menschenherzen. Kontrolle war sauber Decellularization Lösung. Daten darstellen Mean±SEM. PA: Lungenarterie; Hyper: Hypertone; Hypo: hypotone; SDS: Sodium Dodecyl Sulfat; SEM: Standardfehler von Mittelwert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9: koronare Angiogramm decellularized menschlichen Herzens bestätigt Thevascular Durchgängigkeit nach Decellularization. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 10: Bilder, die mit nichtlinearen optischen Mikroskopie von cadaveric und decellularized Myokard zeigen keine Präsenz der Zellen (z.B. Herzzellen oder kardialen Fibroblasten) mit ovalen oder länglichen Form Morphologien in der decellularized LV, RV und Septum. LV: Links Ventrikel; RV: rechten Ventrikel; TPF: zwei Photon Fluoreszenz; SHG: zweite Generation des harmonischen. Einige Herzmuskelzellen sind durch Pfeile angedeutet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 11: biochemische Untersuchungsergebnisse. (A) verbleibenden DNA relativ cadaveric Herzen in decellularized Geweben. (B) verbleibenden GAG im Vergleich zu cadaveric Herz in decellularized Gewebe. (C) verbleibenden SDS in decellularized Geweben. n = 6 Menschenherzen. Daten darstellen Mean±SEM. LA: Links Atrium; RA: rechter Vorhof; LV: linke Herzkammer; RV: rechten Ventrikel; ANT: anterior; Post: Posterior; SDS: Sodium Dodecyl Sulfat; SEM: Standardfehler von Mittelwert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Methode | Pro | Con |
| Konventionelle aufrecht Langendorff perfusion | · Leicht zugänglich das Herz, während Decellularization zu reparieren | · Übermäßige Belastung auf die Aorta wegen Herz-Gewicht |
| · Hohen Durchfluss Infusionsrate während SDS Perfusion unter konstantem Druck-Kontrolle | ||
| · Niedrige koronaren Perfusion Effizienz bei SDS perfusion | ||
| · Der Teil der Aorta/pulmonale Arterie oberhalb Kanüle Ligatur Linie dehydriert und leicht kontaminiert | ||
| Invertierte Langendorff Perfusion in einem unter Druck stehenden Beutel | · Minimieren Sie Druck ausgeübt auf die Aorta wegen Herz Gewicht | · Schwer zugänglich ist das Herz, wenn Reparatur erforderlich. |
| · Niedrige Infusion Durchflussmenge bei SDS Perfusion unter konstantem Druck-Kontrolle | ||
| · Effizienzsteigerung der koronaren Perfusion während SDS perfusion | ||
| · Kein Gewebe werden ausgetrocknet sein, da das ganze Herz unter Wasser/Feuchtigkeit versorgt ist. |
Tabelle 1: Eine Zusammenfassung der vor- und Nachteile von vollem Herzen Decellularization mit konventionellen aufrecht Perfusion vs. invertierten Langendorff Perfusion in einem unter Druck stehenden Beutel.
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Discussion
Nach unserer Kenntnis ist dies die erste Studie, Bericht invertiert Decellularization menschlicher Herzen in einem unter Druck stehenden Beutel mit Zeitraffer Überwachung der Flow-Rate und Zelle Schmutzentfernung. Der Perikard-wie Beutel hält die Ausrichtung des Herzens stabil während des Decellularization-Verfahrens. Eintauchen und invertieren von ganzen Herzen in einem Beutel verhindert Austrocknung und minimiert die übermäßige Belastung der Aorta (von Herzen Gewicht) als im Vergleich zu den herkömmlichen aufrecht Langendorff Perfusion Decellularization Methode9. Im Gegenzug bewahrt, die Kompetenz der Aortenklappe.
Um maximale Decellularization Effizienz zu erreichen, muss koronare vaskuläre Widerstand niedrig, um angemessene und konsequente Perfusion der Flüssigkeit durch die gesamte Myokard zu gewährleisten sein. Im vollem Herzen Decellularization Modell mit retrograde Perfusion Flüssigkeit sammelt sich in den Ventrikeln und erhebt intraventrikuläre Druck, die wiederum erhöht die koronare Gefäßwiderstand und begrenzt den Durchfluss von Flüssigkeiten. Obwohl die Aortenklappe intakt ist, die ventrikuläre Hohlraum füllt sekundär zu physiologischen Leckage und wiederum komprimiert die Ventrikelwand.
Unsere Technik von einem ein Herz in einem unter Druck stehenden Beutel zielt darauf ab, dieses Problem zu lindern und Effizienzsteigerung der Decellularization. Ein Druck von 120 MmHg auf die Aortenwurzel und 14 MmHg in der Tasche bleibt während des Decellularization Prozesses. Diese Druckwerte sind sehr nah an physiologischen Bereich (80-120 MmHg in der Aorta) und 15 MmHg für linken ventricular End-Diastolischer Druck22. Nach Murthy Et al. 23, die myokardialen Blut Flow Rate reicht von 0,61 bis 1,10 mL/min/g, und das menschliche Herz Gewicht24,25 ist etwa 245 bis 308 g; daher die physiologische koronare Durchflussrate ist etwa 149.45 zu 338.80 mL/min, aber Herz Gewicht abhängig. Unsere Abflussrate aus PA reichte von 20 bis 50 mL/min, das ist kleiner als der Wert der physiologischen koronare Durchflussrate und konnte aus 2 verschiedenen Situationen geführt haben: 1) die Infusion von Lösungen zum Herzen produzieren Ödem und es gibt auch normale anatomische Entwässerung des koronaren Systems in die linke Herzkammer Kavität; (2) während der Decellularization auftritt, Flüssigkeit ist auch verloren durch die decellularized Wände durch eine natürliche Erhöhung der Permeabilität. Diese Druckdifferenz verhindert Zusammenbruch der Schiffe und ermöglicht es ihnen, patent bleiben. Darüber hinaus unterhält dieses System das Herz im jeweiligen anatomischen Bedingungen ohne Komprimierung der myokardialen Wand, die koronare vaskuläre Widerstand erhöhen und beeinträchtigen die intravasale Zirkulation der Decellularization Lösungen. Infusion Strömungsprofil Rate menschlicher Herzen (Abbildung 7A) ist sehr ähnlich, was wir in unserem invertierten Decellularization Schweine Herz9, mit niedrigsten Infusionsrate Strömung, die während der hypotone Perfusion und einen leichten Anstieg beobachtet Flow Rate (110.61±14.40 mL/min, 176.31±44.03 mL/min), die während 1 % SDS Durchblutung auftreten. Unsere Aufguss-Durchfluss (Mittelwert = 151.50±3.71 mL/min) bei 1 % SDS Perfusion war vergleichbar oder sogar geringer als bei menschlichen Herzens Decellularization berichtet von Guyette Et Al. 14 aber unsere Methode erfolgt mit Druckregelung von 120 MmHg und ihre Methode verwendet 60 MmHg. Dieser Unterschied in der Perfusion Druck schlägt eine überlegene Wirksamkeit der Aortenklappe Schließung in unsere Technik da einen geringeren Durchsatz Infusion höheren Druck aufrechterhalten konnte. Eine weitere Möglichkeit ist, dass die koronare Widerstandserhöhung durch 14 MmHg Druck im Inneren der Tasche. Darüber hinaus zeigte unser menschliches Herz-Methode einen ähnlichen Trend sinkender koronaren Perfusion Wirkungsgrad (~ 30 %, Abbildung 7, 7 D) von hyper Hypotonische Lösung Änderung im Vergleich zu unseren umgekehrte Schweine Herz Decellularization (~ 10 % in invertiert Orientierung9vs. 1-2 % in aufrechten Ausrichtung). Jedoch diese neuartige Methode könnte bewahren koronaren Perfusion Effizienz bei SDS Perfusion Lösung Perfusion vergleichbar und somit scheint besser als unsere vorherige Methode der Probe Inversion. In Tabelle 1 sind die Vorteile und Nachteile der konventionellen aufrecht Perfusion vs. invertiert Langendorff Perfusion in einem unter Druck stehenden Beutel.
Neben der Durchflussmenge könnte Abfluss Trübung Überwachung ein weiteres nützliches Tool, Decellularization Fortschritt und Effizienz zu bewerten. Während Decellularization war die Trübung des Abwassers aus der PA höher als die des Abwassers von nicht-PA-Sites (Abbildung 8 b). Dies deutet darauf hin, dass ein Großteil der perfundierten Lösung war durch das Gefäßsystem für "richtige" Decellularization gehen. Doch dafür gelten die folgenden angegangen werden müssen: Inter Kammer Shunts oder Durchgängigkeit der Aortenklappe. Vorsichtig und sorgfältige Inspektion ist daher erforderlich, um Fehler der Methode aufgrund der anatomischen Nichtkonformitäten zu verhindern. Die Trübung Profil (Abb. 8 b) von ganzem Herzen Decellularization Prozess zeigten ähnliche Trends wie zuvor gezeigt, mit abrupten Trübung in der anfänglichen Übergangszeit von verschiedenen Perfusates9.
Ein Hauptziel für decellularized Gewebe ist, dass man sie mit Zellen neu zu besiedeln und erzielen hohe Zellhaftung, Proliferation, Reifung und Funktionalität. Unser decellularized Gewebe wurde erfolgreich cellularized für verschiedene Anwendungen26,27, wo das Gewebe wurden erfolgreich cellularized und geringere Thrombogenität erreicht. Unsere biochemischen Analysen von decellularized die Herzen der Menschen haben wir 19 Regionen mit unterschiedlichen Gewebe dicken ausgewertet. Die DNA und SDS in decellularized Geweben variiert mit dem höchsten Wert in der rechten und linken Atrium erhalten. Dies könnte durch die Ausrichtung des Herzens bei einer Kopf-Konfiguration verursacht werden, wobei Zellenrückstand war an der Unterseite des Beutels gefangen oder dem Außendruck reduziert fließen. Perfusion Decellularization stützt sich auf unbeschädigte Herz Strukturen, einschließlich intakt Koronarien und Nebenflüsse. Da diese Organe von Multi-Organspender bezogen werden, haben diese Herzen in der Regel einen Großteil ihrer Vorhöfe entfernt. Während der Vorbereitung dieser Organe und Reparatur der atrialen Wand gab es Störungen in der Bewässerung dieser Regionen, den Fluss der Decellularization Lösungen zu gefährden. Für nicht-Perfusion Herz Decellularization haben andere Forschungsgruppen 2-6 % übrig gebliebenen DNA in Ratte28, Porcines29,30 und menschlichen31 im Vergleich zu entsprechenden cadaveric Herzen berichtet. Sie verwendet jedoch Frost-Tausalz-28,29,30, Enzym29,30 und Serum31 in ihrem Decellularization-Protokoll, die das ECM in stärkerem Maße als beschädigen könnten Unsere Perfusion-basierte Technik. Entwicklung von Methoden, um diese Einschränkungen angemessen zu beheben wird entscheidend sein.
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Disclosures
Dr. Taylor ist der Gründer und Gesellschafter in Miromatrix Medical, Inc. Diese Beziehung wird im Einklang mit der Interessenkonflikt-Politik von der University of Minnesota und Texas Heart Institute; die anderen Autoren haben keinen Interessenkonflikt, offen zu legen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von der Houston Endowment-Zuschuss und die Texas Emerging Technology Fund unterstützt. Die Autoren erkennen die Orgel Beschaffungsbehörde LifeGift, Inc. und der Spenderfamilien dafür, dass diese Studie ermöglicht.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
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