Summary
Denna metod möjliggör decellularization av en komplex solida organ med hjälp av ett enkelt protokoll baserat på osmotiska chock och perfusion av Joniska tvättmedel med minimal orgel matrix störningar. Den består av en roman decellularization teknik för människors hjärtan inuti en trycksatt påsen med realtidsövervakning av flow dynamics och cellulära skräp utflöde.
Abstract
Den ultimata lösningen för patienter med Terminal hjärtsvikt är organtransplantation. Men givare hjärtan är begränsade, immunsuppression krävs och i slutändan avslag kan uppstå. Att skapa en funktionell, kunde autolog bio-konstgjort hjärta lösa dessa utmaningar. Biofabrication av ett hjärta består av byggnadsställning och celler är ett alternativ. En naturlig Rullställning med vävnadsspecifika sammansättning samt mikro - och makro-arkitekturen kan erhållas genom decellularizing hjärtan från människor eller stora djur som grisar. Decellularization innebär att skölja cellulära skräp samtidigt bevara 3D extracellulära matrix och kärlsystemet och tillåter ”cellularization” vid en senare tidpunkt. Kapitalisera på vår roman att hitta att perfusion decellularization av komplexa organ är möjligt, vi utvecklat en mer ”fysiologisk” metod att decellularize icke-transplanterbara människors hjärtan genom att placera dem inuti en trycksatt påsen, i en inverterad orientering, under kontrollerad press. Syftet med att använda en trycksatt påse är att skapa trycket lutningar över aortaklaffen till hålla den stängd och förbättra myocardial perfusion. Samtidiga bedömning av dynamik och cellulära skräp borttagning under decellularization tillät oss att övervaka både flytande inflöde och utflöde på skräp, därmed generera en byggnadsställning som kan användas antingen för enkel hjärt reparation (t.ex. som en patch eller ventil byggnadsställning) eller som en helhet-orgel byggnadsställning.
Introduction
Hjärtsvikt leder till hög dödlighet hos patienter. Den ultimata behandlingsalternativ för slutstadiet hjärtsvikt är allo-transplantation. Men det finns en lång väntelista för transplantation på grund av bristen på donerade organ och patienter ansikte efter transplantation häck som spänner från livslångt immunsuppression till kronisk orgel avvisande1,2. Bioengineering funktionella hjärtan av återinplantering cell-lösa mänsklig storlek hjärtan med patientens egna celler kan kringgå dessa hinder3.
Ett stort steg i ”engineering” ett hjärta är skapandet av en byggnadsställning med lämplig vaskulär och parenkymal struktur, sammansättning och funktion att styra justeringen och organisationen av levererade celler. I närvaro av en lämplig ram, bör celler seedade på schavotten känner igen miljön och utföra den förvänta funktionen som en del av det orgeln. Enligt vår mening omfattar cell-lösa orgel extracellulär matrix (dECM) nödvändiga egenskaper av den idealisk byggnadsställningen.
Genom att utnyttja inneboende kärlsystemet, kan komplexa helhet-organ decellularization uppnås via antegrade eller retrograd perfusion4 ta bort cellulära komponenter samtidigt som den ömtåliga 3D extracellulära matrix och kärlsystemet2, 5,6,7. En funktionell kärlsystemet är viktigt i bioteknik hela organ bara som det är i vivo, för näringsämnen distribution och avfallshantering8. Koronar genomblödning decellularization har visat sig vara effektivt att skapa cell-lösa hjärtan från råttor4eller svin4,7,9,10,11 ,12,13, och människor5,7,14,15,16. Ännu, integritet ventilerna, atria och andra ”tunn” regioner kan lida.
Mänsklig storlek cell-lösa hjärtat ställningar kan erhållas från grisar med hjälp av tryck kontroll7,9,10,11,12 eller infusion flödet klassar kontroll13, 17 och från mänskliga donatorer med hjälp av tryck kontroll5,7,14,15. Decellularization av mänskliga givare hjärtan uppstår under 4-8 dagar under tryck kontrolleras på 80-100 mmHg i stående orientering5,15,16 eller under 16 dagar pressad styrda 60 mmHg14 . Under antegrade, tryckstyrda decellularization, spelar aortaklaffen kompetensen en avgörande roll för att upprätthålla koronar genomblödning effektivitet och stabilt tryck i aortaroten. Vårt tidigare arbete visade att orienteringen av hjärtat påverkar dess koronar genomblödning effektivitet under det decellularization förfarandet och därför byggnadsställning integritet i slutet9.
Som en fortsättning på våra tidigare arbete9introducerar vi ett nytt koncept som vari en hjärtsäck-liknande påse är till för att förbättra hela-hjärta decellularization. Vi beskriver decellularization av människors hjärtan placerade inuti trycksatt påsar, omvänt orienterade, och under tryck kontrolleras på 120 mmHg på aortaroten. Detta protokoll omfattar övervakning av flödet profil och samling utflöde media under hela decellularization förfarandet att utvärdera koronar genomblödning effektivitet och cell avlägsnande av skräp. Biokemiska analyser utförs sedan för att testa effektiviteten av metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment följs etiska kommitténs riktlinjer från den Texas Heart Institute.
1. orgel förberedelse
Obs: I samarbete med LifeGift, en ideell organ upphandling organisation i Texas (http://www.lifegift.org), donerade mänskliga hjärtan inte lämpar sig för transplantation användes för forskning med godkända samtycke.
- För att upphandla hjärtan, intravenöst ingjuta 30.000 U heparin hjärtan. Säkert sutur cardioplegia kanyl i aorta och bifoga en klamma perfusion linje. Perforera den sämre vena cava (IVC) att ventilera rätt hjärtat. Skär antingen det vänstra överlägsen pulmonell ven eller i vänster förmak bihang att ventilera de hjärtats vänstra kammarna.
- Ingjuta 1 L cardioplegia eller hepariniserad saltlösning. Dissekera aortabågen grenar, överlägsen vena cava (SVC) och andra pulmonell vener att släppa hjärtat från bifogade filer vaskulär eller omgivande vävnad. Dränka väl hepariniserad hjärtat i iced saltlösning.
- Inspektera det donerade mänskliga hjärtat (både anteriorly och baktill, figur 1). Placera hjärtat på en dissekera bricka och inspektera för strukturella skador eller anatomiska missbildningar. Om levern eller lungorna uppbringades för transplantation, kan hjärtat uppvisa en kort sämre vena cava och/eller avsaknad av vänster förmak bakre väggen.
- Genomföra interna kontrollen för eventuella defekter - förmaksflimmer septumdefekt (ASD), ventrikulär septumdefekt (VSD) eller ventil (aorta, pulmonell, mitral, tricuspid) missbildning.
- Om en septumdefekt är närvarande, rätta till det med lämpliga suturer (figur 2A, 2B). Korrigering av septal defekter som behövs för att övervaka decellularization framsteg via lungartären (PA) utflöde turbiditetsmätning. Korrigering av septumdefekt tar bort vänster till höger shunt, därför utflödet från PA representerar utflödet från koronar cirkulationen genom koronar sinus.
- Ligera överlägsna och underlägsna hålvenen med 2-0 silk sutur (figur 2 c).
- Dissekera aorta (Ao) bort från den huvudsakliga PA (figur 2D) för efterföljande kanylering.
- Infoga färgkort, baserat på diametern på fartyget, (figur 3) i Ao och PA och säkra dem med 2-0 silk suturer (figur 4A).
- Infoga en slang linje via vänster förmak (figur 4B) och mot vänster kammare (LV) (figur 3), med en av de pulmonell ven öppningar.
- Anslut en infusionsslang till kontakten placeras i Ao och utflöde linjen till en i PA (figur 3).
- Placera beredd hjärtat i en polyester påse i omvänd riktning (uppochner).
- Placera påsen med hjärta behållare perfusion och Stäng locket (figur 4 c).
- Anslut varje rad till respektive portar i gummiproppen (baserat på diametern på behållare) och infoga den i locket på behållaren perfusion att försegla polyester påsen (figur 4 c och figur 5B).
- BEGJUTA 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (136 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 och 1,8 mM KH2PO4 i destillerat vatten, pH 7,4) via infusion porten av gummiproppen kontrollera utflödet från PA och från linjen infogas i LV.
- Använd detta flöde för att rengöra organ av eventuella rester av blod i kärlsystemet. Om flödet inte iakttas, dra åt anslutningen raderna som de kan vara lös.
2. system Setup och orgel Decellularization förfarandet
- Montera bioreaktor och placera i en upprätt orientering (figur 5). Perfusion systemet inkluderar en persondator (PC), proportionell-integral-derivat (PID) controller, en Peristaltisk pump Ao infusionsvätska, ett perfusion bioreaktor, en pressar huvudet behållare för LV perfusatet retention (2L hygienfilter flaskan med botten Sidearm), och en Peristaltisk pump att tömma överflödig vätska från behållaren pressar huvudet och samla utflödet från PA.
- I gummi septum, ansluta den infusionsslang, Tryckhuvud line, PA-utflöde line och bioreaktor dränerande line till gummi cap yta hamnar ovanpå den perfusion bioreaktor (figur 5A).
- Decellularize hjärtan under konstant tryck 120 mmHg uppmätt vid aortaroten. Genomsnittliga trycket av LV ska vara inom 14-18 mmHg under hela decellularization processen.
- Decellularize hjärtan som följer: 4 h av hyperton lösning (500 mM NaCl), 2 h hypoton lösning (20 mM NaCl), 120 h sodium dodecyl sulfate (1% SDS) lösning, och en sista tvätt med 120 L 1 X PBS (figur 6A).
- Decellularize hjärtan under konstant tryckkontroll (120 mmHg). Infusionshastigheten flöde in i Ao är hjärtat-beroende och är, i genomsnitt 98.06±16.22 mL/min för hyperton lösning, 76.14±7.90 mL/min för hypoton lösning, 151.50±5.76 mL/min för SDS och 185.24±7.10 mL/min för PBS. Den totala konsumerade volymen av varje reagens genomsnitt 23.36±5.70 L för hyperton lösning och 9.13±1.26 L för hypoton lösning.
- Återcirkulera den slutliga 60 L av 1% SDS (1 L per gram hjärtat vikt) fram till slutet av SDS perfusion. Figur 6A visar en tidslinje för den decellularization processen, framkalla slutpunkter för datainsamling: flöda övervakning (Ao och PA) och utflöde samling (PA och icke-PA) från Tryckhuvud under decellularization.
- Eftersom de SVC och IVC är sammanskrivna, är det rimligt att anta att alla vätska samlas in från PA är resultatet av faktiska koronar genomblödning (figur 5B). Bestämma koronar genomblödning effektivitet genom att direkt dela flödet klassar av perfusatet ur PA av flödet klassar av infunderas lösning i Ao:
Koronar genomblödning effektivitet =
(%). - Utföra jämförande analys av de perfusatet framställd av PA och LV och infunderade lösningarna i dubblett laddar 200 μl per brunn i en tydlig bottenplattan med 96 brunnar och läsa absorbans vid 280 nm. Det absorptionsvärdet, valt empiriskt efter att ha provat olika värden, konstaterades att ge bäst normaliserade värden.
- Använd turbiditeten ren infunderas reagens som kontroll. Turbiditeten av den utflöde perfusatet representerar bortspolning av cellfragment och kan kvantifieras direkt under decellularization som ett verktyg för spårning av processen.
- Under den sista tvätten med 10 L 1 X PBS, tillsätt 500 mL steril neutraliserat 2,1% persyra syralösning, neutraliseras med 10N NaOH, leder till en 0,1% persyra syralösning (v/v) i PBS. Använd denna lösning för att sterilisera schavotten.
(%).3. utvärdering av cell-lösa hjärtan
Obs: Efter decellularization, representativa hjärtan kommer att användas för koronar angiografi imaging och biokemiska analyser.
- Utföra koronarangiografi av det representativa cell-lösa mänskliga hjärtat att undersöka obrutna av den koronara kärlsystemet. Kort, använder en fluoroscope, bilden cell-lösa mänskliga hjärtat efter injektion av kontrastmedel via koronar ostial kanyl i de huvudsakliga höger och vänster kranskärl.
- Dissekera cell-lösa hjärtat för att få prover från 19 områden att utvärdera återstående deoxiribonukleinsyra (DNA), glykosaminoglykan (GAG) och SDS nivåer i cell-lösa vävnader. Ta bort basen av hjärtat från ventriklarna och dissekera ventriklarna i 4 lika delar (figur 6 c). Dela varje avsnitt i främre och bakre höger kammare (RV), främre och bakre LV och interventricular septum (IVS). Den vävnad som innehåller apexen är dissekeras in i LV och RV för provtagning.
- Skär vävnadsprover för DNA, GAG och SDS analyser (~ 15 mg våt vikt).
- Extrahera dubbelsträngat DNA (dsDNA) genom att smälta prover i 1 M NaOH för 3 h vid 65 ° C och justera pH till 7 med 10 x Tris-EDTA (TE) buffert och 1 M saltsyra (HCl).
- Kvantifiera dsDNA med en dsDNA Assay kit med en kalv bräss standard (se Tabell för material). Läs prover i två exemplar med en fluorescens microplate reader (magnetiseringen på 480 nm och utsläpp på 520 nm). Beräkna procentandelen av kvarvarande dsDNA i cell-lösa hjärtan genom att jämföra dsDNA koncentration i varje vävnad som i avlidna (% avlidna).
- Hämta sulfaterade GAGs i lösning genom att smälta vävnadsprover i en papain extraktionslösningen (0,2 M natriumfosfat buffert med EDTA dinatrium salt, cystein HCl, natriumacetat och papain) vid 65 ° C i 3 timmar. Mäta GAG innehåll (i dubblett) genom att använda en glykosaminoglykan Assay Kit.
- Lyophilize prover för SDS-analysen i en uppvärmd vakuum och mäta torr vikt. Tillsätt 200 µL av ultrarent vatten till varje torkat prov och homogenisera för att extrahera den kvarvarande SDS i lösning. Blanda denna SDS lösning med kloroform och en lösning av metylenblått (12 mg metylenblått i 1 L 0,01 M HCL). SDS kommer separata i det organiska lagret genom att binda till den metylenblått färgämnen.
- Använda en fluorescens microplate reader, läsa absorbans (655 nm) av de standarder och prover i två exemplar att beräkna återstående SDS. Normalisera detta SDS värde till vävnad torrvikt.
- Bild prover från tjocka regioner (dvs, LV, RV och septum) av mänskliga hjärtat med ickelinjär optisk mikroskopi (NLOM) att bekräfta cellulära borttagning efter decellularization. Inställningen för NLOM är detaljerad i våra tidigare publikationer18,19,20. NLOM ger oss möjlighet till bildcell, elastin, kollagen och myosin fibrer genom sina två-photon fluorescens (TPF) och andra harmoniska generation (SHG) kanaler utan att använda något EXOGEN fläcken eller färgämne21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter en 7-dagars decellularization med antegrade aorta perfusion under konstant tryck 120 mmHg vände det mänskliga hjärtat genomskinlig (figur 6B). Hjärtat var grovt dissekeras i 19 sektioner för bioanalys (DNA, GAG och SDS) (figur 6 c) för att utvärdera cell-lösa slutprodukten.
Under hela decellularization hölls infusion flödet klassar av olika lösningar varierade som trycket konstant. Flödet i Ao (figur 7A) successivt minskat från 96.68±23.54 till 80.59±12.41 mL/min (16,64%) som perfusion lösningen ändras från hyperton hypoton. Däremot ökade flöde från 71.68±10.63 till 110.61±14.40 mL/min (54.31%) när perfusion lösning ändras från hypoton till SDS. Under SDS perfusionen pendlat flöde infusionshastigheten mellan 110±14.40 och 176.31±44.03 mL/min. Utflödessatser från PA (figur 7B) initialt uppvisade en liknande utveckling (figur 7A). Dock användes utflödessatsen på under 1% SDS perfusion minskade från 35.77±9.07 till 27.08±4.09 mL/min. koronar genomblödning effektivitet att utvärdera aortaklaffen patency och liknande trender. Effektivitet minskat över tid som olika reagenser perfusion via kärlsystemet (figur 7 c). Under den första timmen av 1 X PBS tvätten, perfusion effektivitet återställdes till det ursprungliga värdet före hypoton lösning (28.39±3.61% vid 1-h PBS vs. 31.02±7.16% 1-h hypoton). De genomsnittliga koronara genomblödning effektivitetsvinsterna var 46.08±9.89%, 28.08±7.12%, 25.70±5.30% och 28.39±3.61% med den hyperton lösningen, den hypoton lösningen, 1% SDS och 1 X PBS, respektive (figur 7 d).
Eftersom den utflöde perfusatet från PA och LV samlades samtidigt, deras skräp innehåll kunde vara jämfört (figur 8A) av spektroskopi absorbans mätt vid 280 nm (figur 8B). Turbiditeten i utflödet från PA och LV minskade över tid under perfusionen i varje lösning; turbiditet från PA visade dock en mer abrupt färgförändring jämfört med som observerats från LV under perioden inledande perfusion. Efter byte från en hyperton till en hypoton lösning, turbiditeten PA utflöde ändrats från 1.15±0.03 till 1.40±0.07 (21,73% ökning) och LV ändrats från 1.13±0.05 till 1.24±0.07 (9,73% ökning). Under den första timmen av 1% SDS perfusion, grumlighet ändras från 1.17±0.04 till 2.77±0.15 (136,75% ökning) för PA och 1.11±0.04 till 1.75±0.26 (56.65% ökning) för LV utflödet. Korrelationen mellan utflödet grumlighet och cell skräp blekt utvärderades med bicinchoninic syra (BCA) protein analys när proteinkoncentration kvantifierades i utflödet proven. Resultat från decellularization av 6 människors hjärtan avslöjade en linjär korrelation mellan proteinkoncentration och spillvatten grumlighet med R2 = 0,95 (figur 8 c).
Efter slutförandet av hela-hjärta decellularization bekräftade koronar angiogrammet bevarandet av intakt hjärt kärlsystemet (figur 9). Ickelinjär optisk avbildning av myokardiet lager från tjocka områden (dvs, RV, LV och septum) i cell-lösa mänskliga hjärtat bekräftade cell avlägsnande, som ingen cell närvaro observerades i TPF kanaler (figur 10). Celler (dvs hjärtmuskelcellerna eller hjärt fibroblaster) med deras autofluorescens kan lätt identifieras i TPF kanal genom sin ovala och långsträckt form morfologier. För att säkerställa effektiviteten i den decellularization processen och cellulära skräp borttagning, var cell-lösa människors hjärtan ytterligare räknats in i 19 regioner (figur 6 c) att kvantifiera nivåerna av DNA, sulfaterade GAGs och SDS kvar i dessa regioner. DNA i alla regioner var mindre än 10% av avlidna hjärta. DNA i höger förmak (8.39% - 10,38% i förhållande till avlidna) och vänster atrium (5,11-7,60%) var högsta (Fig. 11A).
Figur 1: Avlidna mänskliga hjärtat från en orgel upphandling byrå. Främre och bakre utsikt över avlidna mänskliga hjärtat. Sämre vena cava och en del av höger förmak saknas, som observerats i streckad region. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: inspektion för septal eller ventil anatomiska anomalier. (A) Inspect om patent foramen ovale (PFO) är närvarande (kommunikation mellan höger och vänster atrium). (B) en 5-0 polypropylen sutur används på ett fortlöpande sätt att stänga PFO. (C) höger förmak är stängd med en rinnande sutur av 5-0 polypropen. (D) de viktigaste lungartären är dissekerade från aorta ascendens genom trubbig dissektion. FO: foramen ovale; PA: lungartären; Ao: aorta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: komponenter i den infusion bioreaktor. Decellularization systemet består av (A) gummi keps med 4 portar; (B) utflöde linje anslutas till lungpulsådern (PA); (C, F) kopplingar med luerlock för PA och aorta (Ao), (D) insättningsraden för vänster kammare (LV), (E) infusion linje för att anslutas till aorta, (G) polyester påse och (H) Perfusion behållare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: montering av mänskliga hjärtat kanylering och infusion bioreaktor. (A) främre bild av hjärtat visar lungartären (PA) och aorta (Ao) individuellt kanylerade. (B) bakre vy av hjärtat visar kanylen riktat till vänster kammare (LV) genom pulmonell ven (PV). (C) mänskliga hjärtat inuti den Infusion bioreaktor efter montering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: System setup av inverterad orienterade decellularization med Tryckhuvud. (A) komplett decellularization systemet består av: en dator, en proportionell-integral-derivat (PID) controller, pumpar, en bioreaktor och reservoarer för samlar spillvattnet från lungpulsådern (PA) och vänster kammare (LV). Ao: aorta. Pilar indikerar flödesriktning. (B) schematiskt av inställningen av mänskliga hjärtat inuti perfusion bioreaktor och associerade flöde stigarna perfusatet/utflöde under decellularization. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Schematisk bild av decellularization förfarandet och efter decellularization prövningen av ett mänskligt hjärta. (A) Diagram av förfarandet decellularization. (B) Anterior och posterior undersökning av en cell-lösa mänskliga hjärtat. (C) brutto dissektion av ett mänskligt hjärta i fyra tvärsnitt (avsnitt A till avsnitt D) för biokemisk analys analys. Färg i människors hjärtan orsakas av kvarvarande lipofucin nedfall. Färgläggning presenterar normalt i inre ventrikulära ytan eller gränsen mellan epicardium och hjärtmuskeln. LA: vänster förmak; RA: höger förmak; LV: vänster kammare; RV: höger kammare; ANT: främre; Inlägg: bakre; Hyper: hyperton; Hypo: hypoton; SDS: sodium dodecyl sulfate; PBS: fosfatbuffrad koksaltlösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Time-lapse dynamik under decellularization. (A) Infusion flödet klassar av decellularization lösningar i aorta under förfarandet. (B) flödet av avloppsvatten från PA under decellularization. (C) koronar genomblödning effektivitet under decellularization. (D) : koronar genomblödning effektiviteten under perfusion av olika lösningar/reagenser. N = 6. Uppgifterna representerar mean±SEM. PA: lungartären; Hyper: hyperton; Hypo: hypoton; SDS: sodium dodecyl sulfate; PBS: fosfatbuffrad koksaltlösning. SEM: standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Time-lapse cell skräp blekt under decellularization. (A) utflöde mediesamling från PA och icke-PA (vänster kammare). (B) resultatet av turbiditetsmätning vid 280 nm. (C) linjär korrelation finns mellan proteinkoncentration och grumlighet. n = 6 människors hjärtan. Kontroll var rena decellularization lösning. Uppgifterna representerar mean±SEM. PA: lungartären; Hyper: hyperton; Hypo: hypoton; SDS: sodium dodecyl sulfate; SEM: standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: koronar angiografi av cell-lösa mänskliga hjärtat bekräftar thevascular patency efter decellularization. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: bilder som erhållits med ickelinjär optisk mikroskopi från avlidna och cell-lösa hjärtmuskeln visar ingen närvaron av celler (dvs hjärtmuskelcellerna eller hjärt fibroblaster) med ovala eller avlånga formen morfologier i den cell-lösa LV, RV och septum. LV: vänster kammare; RV: höger kammare; TPF: två photon fluorescens; SHG: harmonisk understödjautvecklingen. Vissa hjärt celler indikeras förtroendesökvägarna av pilar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: biokemiska test resultat. (A) återstående DNA i förhållande till avlidna hjärtat i cell-lösa vävnader. (B) återstående GAG i förhållande till avlidna hjärtat i cell-lösa vävnader. (C) återstående SDS i cell-lösa vävnader. n = 6 människors hjärtan. Uppgifterna representerar mean±SEM. LA: vänster atrium; RA: höger förmak; LV: vänster kammare; RV: höger kammare; ANT: främre; Inlägg: bakre; SDS: sodium dodecyl sulfate; SEM: standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Metoden | Pro | CON |
| Konventionella upprätt av perfusion | · Lätt att komma åt hjärtat att reparera under decellularization | · Alltför stora påfrestningar på aorta på grund av hjärtat vikt |
| · Hög infusionshastighet flöde under SDS perfusion under konstant tryckkontroll | ||
| · Låg koronar genomblödning effektivitet under SDS perfusion | ||
| · Del av aorta/Pulmonell artär ovanför kanyl ligering linjen kunde få uttorkad och lätt förorenade | ||
| Inverterad av perfusion inuti en trycksatt påsen | · Minimera belastningen på aorta på grund av hjärtat vikt | · Svårt att komma åt hjärtat om reparation behövs. |
| · Lågt flöde infusionshastigheten under SDS perfusion under konstant tryckkontroll | ||
| · Bättre koronar genomblödning effektivitet under SDS perfusion | ||
| · Ingen vävnader kommer att torkas eftersom hela hjärtat är nedsänkt/hydrerad. |
Tabell 1: En sammanfattning av för- och nackdelar av hela-hjärta decellularization med konventionella upprätt perfusion vs inverterad av perfusion inuti en trycksatt påsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Till vår kunskap är detta den första studien som rapporten inverterad decellularization av människors hjärtan inuti en trycksatt påsen med time-lapse övervakning av flödet klassar och cell avlägsnande av skräp. Hjärtsäck-liknande påsen håller orientering på hjärtat stabil under hela förfarandet för decellularization. Dränka och vända hela hjärtan inuti en påsen förhindrar uttorkning och minimerar alltför stor belastning på aorta (från hjärtat vikt) när jämfört med den konventionella upprätt av perfusion decellularization metod9. Detta, i sin tur bevarar kompetensen av aortaklaffen.
För att uppnå maximal decellularization effektivitet, måste koronar kärlmotstånd vara låg för att säkerställa adekvat och konsekvent perfusion av vätska genom hela hjärtmuskeln. I hela-hjärta decellularization modellen på retrograd perfusion, vätska ansamlas i ventriklarna och höjer intraventrikulära trycket, som i sin tur ökar koronar kärlmotstånd och begränsar flödet av vätskor. Även om aortaklaffen är intakt, ventrikulära kaviteten fylls sekundärt till fysiologiska läckage och i sin tur komprimerar ventrikulära väggen.
Vår teknik med decellularizing ett hjärta inuti en trycksatt påsen syftar till att lindra detta problem och öka decellularization effektivitet. Ett tryck av 120 mmHg på aortaroten och 14 mmHg i fodralet bibehålls under hela decellularization. Dessa tryckvärden är mycket nära fysiologiska intervallet (80-120 mmHg i aorta) och 15 mmHg för vänster ventrikulära slutet-diastoliskt tryck22. Enligt Murthy et al. 23, hjärtinfarkt blod flöde klassar spänner från 0,61-1.10 mL/min/g, och de mänskliga hjärta vikt24,25 är ca 245 till 308 g; därav, fysiologiska koronar flödet klassar är omkring 149.45 till 338.80 mL/min, men beror på hjärtat vikt. Våra utflödessats från PA varierade mellan 20 och 50 mL/min, vilket är mindre än värdet av fysiologiska koronar flödeshastighet och kunde ha resulterat från 2 olika situationer: 1) infusion av lösningar till hjärtat producerar ödem och det finns också normala anatomiska dränering av koronar systemet till vänster kammare hålighet; (2) som decellularization inträffar, vätska förloras också genom cell-lösa väggarna på grund av en naturlig ökning i deras permeabilitet. Denna tryckskillnad förhindrar kollaps av fartyg och tillåter dem att förbli patent. Dessutom upprätthåller detta system hjärtat i relativa anatomiska förhållanden utan att komprimera hjärtinfarkt väggen, vilket skulle öka koronar kärlmotstånd och försämra den intravaskulära cirkulationen av decellularization lösningar. Infusionen flödet klassar profilen av människors hjärtan (figur 7A) är mycket likt vad vi observerat i vår inverterade decellularization svin hjärta9, med lägsta infusion flöde som inträffar under hypoton perfusionen och en liten ökning Flow rate (110.61±14.40 mL/min till 176.31±44.03 mL/min) som inträffar under 1% SDS perfusion. Vårt flöde infusionshastigheten (medelvärde = 151.50±3.71 mL/min) under 1% SDS perfusion var jämförbar med, eller ännu mindre än för mänskliga hjärtat decellularization rapporteras av Guyette o.a. 14 men vår metod utförs med tryckreglering på 120 mmHg och deras metod används 60 mmHg. Denna skillnad i perfusion tryck antyder en överlägsen effektivitet av aortaklaffen nedläggning i vår teknik eftersom ett lägre flöde infusionshastigheten kunde upprätthålla högre tryck. En annan möjlighet är att ökad koronara motståndet var på grund av den tillämpade 14 mmHg trycket inuti påsen. Dessutom vår mänskliga hjärtat metod visade en liknande trend av minskande koronar genomblödning effektivitet (~ 30%, figur 7 c, 7 D) från hyper hypoton lösning förändring jämfört med vår inverterade svin hjärtat decellularization (~ 10% i inverterad orientering9vs. 1-2% i stående orientering). Men denna nya metod kunde bevara koronar genomblödning effektivitet under SDS perfusion jämförbar lösning perfusion och verkar därmed överlägsen vår föregående metod av provet inversion. Tabell 1 visar fördelarna och nackdelar med konventionella upprätt perfusion vs inverterad av perfusion inuti en trycksatt påsen.
Utöver flöde, kan utflöde grumlighet övervakning vara ett annat användbart verktyg för att utvärdera decellularization framsteg och effektivitet. Under decellularization var grumlighet av utflödet från PA högre än för utflödet från icke-PA platser (figur 8B). Detta tyder på att de flesta av de perfunderade lösning var att gå igenom vaskulatur för ”riktiga” decellularization. Men för att detta ska vara giltig, måste ta itu med följande: mellan kammare shuntar eller patency av aortaklaffen. Försiktig och noggrann inspektion behövs därför att förhindra bristande metoden på grund av anatomiska avvikelser. Turbiditet profilen (figur 8B) av hela hjärtat decellularization processen visat liknande tendenser som tidigare visad, med abrupt grumlighet förändring under den inledande omställningsperioden av olika perfusates9.
Ett huvudmål för cell-lösa vävnader är att återbefolka dem med celler och uppnå hög cell fastsättning, spridning, mognad och funktionalitet. Vår cell-lösa vävnader har varit framgångsrikt cellularized för olika applikationer26,27, där vävnader var framgångsrikt cellularized och uppnått lägre trombogeniciteten. I våra biokemiska analyser av cell-lösa människors hjärtan utvärderat vi 19 regioner med olika vävnad tjocklekar. De DNA och SDS i cell-lösa vävnader varierade, med det högsta värdet som erhålls i höger och vänster förmak. Detta kan bero på orienteringen av hjärtat i ett uppochnervänt konfiguration, vari cellfragment var fångade på botten av påsen eller där yttre trycket minskat flöde. Perfusion decellularization bygger på oskadad hjärtat strukturer, inklusive intakt hjärtinfarkt och bifloder. Som dessa organ anskaffas från flera organdonatorer, har dessa hjärtan oftast en stor del av deras atria bort. Under beredningen av dessa organ och reparation av förmaksflimmer väggen fanns störningar i bevattning av dessa regioner, äventyra flödet av decellularization lösningar. För icke-perfusion hjärtat decellularization rapporterat andra forskargrupper 2-6% överblivna DNA i råtta28, svin29,30 och mänskliga31 jämfört med respektive avlidna hjärtat. Men de används frysning-tining28,29,30, enzym29,30 och serum31 i deras decellularization protokoll, vilket kan skada ECM i högre grad än vår perfusion-baserad teknik. Utveckla metoder att kunna hantera dessa begränsningar kommer att vara avgörande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Taylor är grundare och delägare i Miromatrix Medical, Inc. Detta förhållande förvaltas i enlighet med politiken som intressekonflikt av University of Minnesota och Texas Heart Institute; andra författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av Houston Endowment bidraget och Texas framväxande teknik fonden. Författarna erkänner byråns orgel upphandling LifeGift, Inc. och givarens familjer för att göra denna studie möjlig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Zia, S., et al. Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).
- Zimmermann, W. H. Strip and Dress the Human Heart. Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
- Peloso, A., et al. Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 107 (2015).
- Guyette, J. P., et al.
- Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis. Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).
- Lee, P. F., et al. Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts. Acta Biomaterialia. , (2016).
- Momtahan, N., et al. Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Weymann, A., et al. Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model - Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds. Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).
- Weymann, A., et al. Bioartificial heart: A human-sized porcine model--the way ahead. PLoS One. 9 (11), e111591 (2014).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. Journal of Visualized Experiments. (70), e50059 (2012).
- Guyette, J. P., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Sanchez, P. L., et al. Data from acellular human heart matrix. Data Brief. 8, 211-219 (2016).
- Garreta, E., et al. Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts. Biomaterials. 98, 64-78 (2016).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Larson, A. M., Yeh, A. T. Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses. Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).
- Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices. Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).
- Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).
- Wu, Z., et al.
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Murthy, V. L., et al. Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC. Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal organ weights in men: Part I-the heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).
- Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix. PLoS One. 9 (2), e90406 (2014).
- Robertson, M. J., Soibam, B., O'Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology. PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).
- Baghalishahi, M., et al. Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Freytes, D. O., O'Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes. Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).
- Oberwallner, B., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
