Summary
Questo metodo consente di decellularizzazione di un organo solido complesso utilizzando un semplice protocollo basato su shock osmotico e l'aspersione di detergente ionico con rottura di matrice minimal organo. Si compone di una tecnica di decellularizzazione romanzo per cuori umani all'interno di una custodia pressurizzata con monitoraggio in tempo reale del deflusso di detriti cellulari e dinamiche flusso.
Abstract
La soluzione definitiva per i pazienti con infarto di stadio finale è il trapianto d'organo. Ma cuori erogatori sono limitati, l'immunosoppressione è necessaria e in ultima analisi, può verificarsi il rifiuto. Creazione di un funzionale, cuore bio-artificiale autologo potrebbe risolvere queste sfide. Biofabrication di un cuore composto da impalcatura e cellule è un'opzione. Un'impalcatura naturale con composizione tessuto-specifici, come pure micro - e macro-architettura possa essere reperita da cuori decellularizing esseri umani o animali di grandi dimensioni come i maiali. Decellularizzazione prevede il lavaggio fuori detriti cellulari preservando la vascolarizzazione e 3D matrice extracellulare e permettendo di "cellularization" ad un determinato timepoint successivo. Capitalizzando sulla nostra individuazione che decellularizzazione di perfusione degli organi complessi del romanzo è possibile, abbiamo sviluppato un metodo più "fisiologico" per decellularize cuori umani non trapiantabili inserendoli all'interno di una custodia pressurizzata, in un invertito orientamento, sotto pressione controllata. Lo scopo di utilizzare una custodia pressurizzata è quello di creare gradienti di pressione attraverso la valvola aortica a tenerlo chiuso e migliorare la perfusione del miocardio. Valutazione simultanea della dinamica dei flussi e la rimozione di detriti cellulari durante decellularizzazione ci ha permesso di monitorare sia fluido afflusso e deflusso di detriti, generando così un'impalcatura che può essere utilizzato sia per la semplice riparazione cardiaca (ad es. come una patch o impalcatura di valvola) o come un'impalcatura di tutto-organo.
Introduction
Insufficienza cardiaca conduce ad alto tasso di mortalità nei pazienti. L'opzione di trattamento finale per infarto di stadio finale è allo-trapianto. Tuttavia, c'è una lunga lista d'attesa per trapianto a causa della scarsità di donatori di organi e pazienti viso post-trapianto ostacoli che vanno da tutta la vita immunosoppressione cronica organo rifiuto1,,2. Il cuore funzionale Bioingegneria di ripopolare decellularizzati cuori di dimensioni umane con un propria del paziente cellule potrebbero aggirare questi ostacoli3.
Un importante passo in "ingegneria" un cuore è la creazione di un'impalcatura con adeguata struttura vascolare e parenchima, la composizione e la funzione di guidare l'allineamento e l'organizzazione delle cellule consegnate. In presenza del quadro appropriato, cellule seminate sul patibolo dovrebbero riconoscere l'ambiente e svolgere la funzione prevista come parte di quell'organo. A nostro parere, matrice extracellulare organo decellularizzati (dECM) comprende le caratteristiche necessarie dell'impalcatura ideale.
Utilizzando il sistema vascolare intrinseco, complesso intero-organo decellularizzazione può essere raggiunto via anterograda o aspersione retrograda4 per rimuovere componenti cellulari, preservando la matrice extracellulare 3D delicata e sistema vascolare2, 5,6,7. Un funzionale sistema vascolare è importante in organi interi di Bioingegneria soli quanto è in vivo, per la distribuzione dei nutrienti e la rimozione dei rifiuti8. Decellularizzazione di perfusione coronarica ha dimostrato di essere efficace nella creazione di decellularizzazione cuori da ratti4, o maiali4,7,9,10,11 ,12,13e gli esseri umani5,7,14,15,16. Ancora, può soffrire l'integrità delle valvole, atri e altre regioni "sottile".
Umani-dimensione decellularizzati cuore ponteggi possono essere ottenuti da suini usando pressione controllo7,9,10,11,12 o infusione flusso frequenza controllo13, 17 e da donatori umani usando pressione controllo5,7,14,15. Decellularizzazione di cuori di donatori umani si verifica oltre il 4-8 giorni sotto pressione controllata a 80-100 mmHg in orientamento verticale5,15,16 o oltre 16 giorni sotto pressione controllata a 60 mmHg14 . Sotto antegrade, pressione controllata decellularizzazione, la competenza della valvola aortica svolge un ruolo cruciale nel mantenimento della perfusione coronarica efficienza e pressione stabile alla radice aortica. Il nostro lavoro precedente ha rivelato che l'orientamento del cuore influenza l'efficienza di perfusione coronarica durante la procedura di decellularizzazione e pertanto l'integrità dell'impalcatura nel fine9.
Come una continuazione del nostro precedente lavoro9, introduciamo un nuovo concetto in cui un sacchetto di pericardio-come è aggiunto per migliorare tutto-cuore decellularizzati. Descriviamo il decellularizzazione di cuori umani disposti all'interno di sacchetti pressurizzati, inversamente orientati e sotto pressione controllata a 120 mmHg nella radice aortica. Questo protocollo include il monitoraggio del profilo di flusso e collezione di media di deflusso durante tutta la procedura di decellularizzazione per valutare l'efficienza di perfusione coronarica e rimozione detriti cellulari. Analisi biochimiche sono poi eseguite per testare l'efficacia del metodo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti rispettato gli orientamenti del Comitato di etica dal Texas Heart Institute.
1. organo preparazione
Nota: In collaborazione con LifeGift, un'organizzazione di acquisti di organo senza scopo di lucro in Texas (http://www.lifegift.org), Donato cuori umani non adatto per il trapianto sono stati utilizzati per la ricerca con consenso approvato.
- Per procurarsi i cuori, infondere per via endovenosa dell'eparina ai cuori 30.000-U. In modo sicuro suturare cardioplegia cannula nell'aorta e collegare una linea di aspersione bloccato. Forare la vena cava inferiore (IVC) per sfogare il cuore destro. Tagliare sia la vena polmonare superiore di sinistra o l'auricola sinistra per sfogare le camere sinistro del cuore.
- Infondere 1 L di cardioplegia o soluzione fisiologica eparinizzata. Sezionare i rami dell'arco aortico, vena cava superiore (SVC) e altri vene polmonari per liberare il cuore da ogni attaccamento di tessuto vascolare o circostanti. Immergere il cuore ben eparinizzato in soluzione salina ghiacciata.
- Ispezionare il cuore umano donato (sia anteriormente che posteriormente, Figura 1). Mettere il cuore su un vassoio per dissezione e controllare eventuali danni strutturali o le malformazioni anatomiche. Se il fegato o i polmoni sono stati acquistati per il trapianto, il cuore può presentare con una breve vena cava inferiore e/o assenza della parete atriale di sinistra posteriore.
- Effettuare ispezione interna di eventuali difetti - difetto del setto atriale (ASD), difetto del setto ventricolare (VSD) o malformazione della valvola (aortica, polmonare, mitrale, tricuspide).
- Se è presente un difetto settale, correggerlo con suture appropriate (Figura 2A, 2B). La correzione di difetti del setto è necessaria per monitorare il progresso di decellularizzazione via la misura di torbidità deflusso dell'arteria polmonare (PA). Correzione del difetto settale rimuove sinistra allo shunt di destro, quindi, il deflusso da PA rappresenta il deflusso dalla circolazione coronarica attraverso il seno coronario.
- Lega i superiore ed inferiore della vena cava con sutura seta 2-0 (Figura 2).
- Lontano il PA principale (Figura 2D) per il successivo inserimento di una canula la dissezione dell'aorta (Ao).
- Inserire i connettori, in base al diametro del vaso, (Figura 3) in Ao e PA e bloccarli con punti di sutura in seta 2-0 (Figura 4A).
- Inserire una linea di tubazione attraverso l'atrio sinistro (Figura 4B) e verso il ventricolo sinistro (LV) (Figura 3), utilizzando uno degli orifizi della vena polmonare.
- Collegare una linea di infusione al connettore posizionato in Ao e la linea di uscita a quello di PA (Figura 3).
- Inserire il cuore preparato un sacchetto poliestere in orientamento invertito (capovolto).
- Posizionare la busta con il cuore in un contenitore di aspersione e chiudere il coperchio (Figura 4).
- Collegare ciascuna delle linee per i rispettivi porti nel tappo di gomma (basato sul diametro del contenitore) e inserirla sul coperchio del contenitore di aspersione per sigillare il sacchetto poliestere (Figura 4 e figura 5B).
- Irrorare 1 x tamponato fosfato salino (PBS) (136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na2HPO4 e 1,8 mM KH2PO4 in acqua distillata, pH 7.4) tramite la porta di infusione del tappo in gomma per verificare il deflusso dal PA e dalla linea di inserito in LV
- Utilizzare questo flusso per pulire l'organo di qualsiasi residuo di sangue nel sistema vascolare. Se il flusso non è osservata, stringere le linee di connessione possano essere sciolti.
2. impostazione sistema e organo decellularizzazione procedura
- Assemblare il bioreattore e posto in un orientamento verticale (Figura 5). Il sistema di perfusione comprende un personal computer (PC), regolatore di proporzionale-integrale-derivato (PID), una pompa peristaltica per infusione di Ao, un bioreattore di aspersione, un contenitore di testa pressione per ritenzione di perfusato LV (bottiglia da 2L aspiratore con fondo sidearm) e una pompa peristaltica per drenare liquidi in eccesso dal contenitore testa di pressione e di raccogliere il deflusso da PA.
- Il setto di gomma, collegare la linea di infusione, testa di pressione linea, linea PA-deflusso e linea drenante bioreattore per i porti di superficie tappo gomma posizionati sulla parte superiore del bioreattore di aspersione (Figura 5A).
- Decellularize cuori sotto costante pressione di 120 mmHg misurata alla radice aortica. Pressione media del ventricolo sinistro dovrebbe essere all'interno di 14-18 mmHg durante il processo di decellularizzazione intero.
- Decellularize cuori come segue: 4 h di soluzione ipertonica (500 mM NaCl), 2 h di soluzione ipotonica (20 mM NaCl), 120 h di soluzione di sodio dodecil solfato (SDS 1%) e un lavaggio finale con 120 L di 1X PBS (Figura 6A).
- Decellularize i cuori sotto controllo a pressione costante (120 mmHg). Tasso di flusso di infusione in Ao è cuore-dipendente ed è, in media, 98.06±16.22 mL/min per soluzione ipertonica, 76.14±7.90 mL/min per una soluzione ipotonica, 151.50±5.76 mL/min per SDS e 185.24±7.10 mL/min per la PBS. Il volume totale consumato di ciascun reagente medie 23.36±5.70 L per soluzione ipertonica e L 9.13±1.26 per una soluzione ipotonica.
- Ricircolare il finale 60 L di 1% SDS (1L per grammo di peso del cuore) fino alla fine della perfusione di SDS. Figura 6A Mostra una sequenza temporale per il processo di decellularizzazione, suscitando gli endpoint per la raccolta dati: flusso di controllo di frequenza (Ao e PA) e raccolta di deflusso (PA e non-PA) dalla testa di pressione durante decellularizzati.
- Poiché la SVC e IVC sono legati, è ragionevole supporre che tutto il liquido raccolto dal PA è il risultato di perfusione coronarica effettivo (figura 5B). Determinare l'efficienza di perfusione coronarica dividendo direttamente la portata del perfusato fuori il PA per il tasso di flusso della soluzione infusa in Ao:
Efficienza di perfusione coronarica =
(%). - Eseguire analisi comparativa del perfusato ottenuto da PA e LV o le soluzioni infuse in duplice copia con carico 200 μL per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fondo chiaro e leggere l'assorbanza a 280 nm. Il valore di assorbanza, selezionato empiricamente dopo aver provato diversi valori, è stato trovato a dare il meglio di valori normalizzati.
- Utilizzare la torbidità del reagente infuso pulito come il controllo. La torbidità del perfusato deflusso rappresenta la sbiaditura di detriti cellulari e possa essere quantificata istantaneamente durante decellularizzazione come uno strumento di monitoraggio del processo.
- Durante il lavaggio finale con 10 L di 1X PBS, aggiungere 500 mL di sterile neutralizzati soluzione di acido peracetico 2,1%, neutralizzato con NaOH 10N, che conduce a una soluzione acido peracetico di 0.1% (v/v) in PBS. Utilizzare questa soluzione per sterilizzare il patibolo.
(%).3. valutazione dei cuori decellularizzati
Nota: Dopo decellularizzazione, cuori rappresentante verranno utilizzati per analisi di imaging e biochimiche di angiogramma coronario.
- Eseguire l'angiografia coronarica del cuore umano decellularizzato rappresentativo per esaminare l'integrità del sistema vascolare coronarico. Brevemente, usando un fluoroscopio, immagine decellularized cuore umano dopo l'iniezione di mezzo di contrasto attraverso la cannula ostial coronaria nelle principali arterie coronarie destra e sinistra.
- Sezionare il cuore decellularizzato per ottenere campioni da 19 aree per valutare il residuo acido deossiribonucleico (DNA), glicosaminoglicani (GAG) e livelli di SDS in tessuti decellularizzati. Rimuovere la base del cuore da ventricoli e sezionare i ventricoli in 4 sezioni uguali (Figura 6). Dividere ogni sezione in anteriore e posteriore ventricolo di destra (RV), il LV anteriore e posteriore e il setto interventricolare (IVS). Il tessuto che contiene l'apice viene sezionato in LV e RV per il campionamento.
- Tagliare i campioni di tessuto per analisi del DNA, GAG e SDS (~ 15 mg di peso umido).
- Estrarre il DNA a doppia elica (dsDNA) digerendo campioni in 1 M NaOH per 3 h a 65 ° C e regolare il pH a 7 utilizzando buffer di Tris-EDTA (TE) 10 x e 1 M di acido cloridrico (HCl).
- Quantificare il dsDNA utilizzando un dsDNA Assay kit con un timo di vitello standard (Vedi Tabella materiali). Leggere i campioni in duplicato utilizzando un lettore di micropiastre di fluorescenza (eccitazione a 480 nm ed emissione a 520 nm). Calcolare la percentuale di residuo dsDNA nei cuori decellularizzati confrontando concentrazione dsDNA in ogni tessuto a quello cadaverico (% cadaverico).
- Ottenere solfonato gag in soluzione digerendo i campioni di tessuto in una soluzione di estrazione di papaina (tampone di fosfato di sodio 0,2 M con cisteina di EDTA disodico sale, HCl, acetato di sodio e papaina) a 65 ° C per 3 ore. Misurare il contenuto di GAG (in duplicato) utilizzando un Kit di analisi Glycosaminoglycan.
- Lyophilize campioni per l'analisi di SDS in un peso a secco con vuoto e misura riscaldato. Aggiungere 200 µ l di acqua ultrapura per ogni campione essiccato e omogeneizzare per estrarre il residuo SDS in soluzione. Mescolare questa soluzione SDS al cloroformio e una soluzione di blu di metilene (12 mg di blu di metilene in 1 L di 0,01 M HCl). La SDS si separerà nello strato organico dal legame con il colorante blu di metilene.
- Utilizzando un lettore di micropiastre di fluorescenza, leggere l'assorbanza (655 nm) degli standard e dei campioni in duplicato per calcolare il residuo SDS. Normalizzare questo valore di SDS al peso a secco dei tessuti.
- Immagini di esempio da regioni spesse (cioè, LV, RV e setto) del cuore umano con la microscopia ottica non lineare (NLOM) per confermare la rimozione cellulare dopo decellularizzati. Il programma di installazione di NLOM è dettagliata nel nostro precedente Pubblicazioni18,19,20. NLOM ci permette di cella di immagine, elastina, fibre di collagene e miosina attraverso i suoi due fotoni di fluorescenza (TPF) e canali di seconda generazione di armonica (SHG) senza utilizzare alcun esogeno di macchia o tintura21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dopo un decellularizzazione di 7 giorni con aspersione aortico antegrade sotto costante pressione di 120 mmHg, il cuore umano trasformato traslucido (Figura 6B). Il cuore è stato grossolanamente dissecato in 19 sezioni per analisi biochimica (DNA, GAG e SDS) (Figura 6) per valutare il prodotto finale decellularizzato.
Durante tutto il processo di decellularizzazione, tasso di flusso di infusione di soluzioni diverse, diversi, come la pressione è mantenuta costante. La portata in Ao (figura 7A) diminuito gradualmente da 96.68±23.54 a 80.59±12.41 mL/min (16,64%) come la soluzione di perfusione modificato da ipertonica a ipotonica. Al contrario, portata aumentata da 71.68±10.63 a 110.61±14.40 mL/min (54,31%) quando la soluzione perfusione modificato da ipotonica a SDS. Durante la perfusione di SDS, velocità di flusso di infusione oscillò tra 110±14.40 e 176.31±44.03 mL/min. Il tasso di deflusso da PA (figura 7B) inizialmente ha mostrato un andamento simile (figura 7A). Tuttavia, il tasso di deflusso durante l'aspersione di SDS 1% è diminuito da 35.77±9.07 a 27.08±4.09 mL/min l'efficienza perfusione coronarica è stato usato per valutare la pervietà della valvola aortica e tendenze simili. L'efficienza è diminuito nel tempo come reagenti diversi irrorato attraverso il sistema vascolare (Figura 7). Durante la prima ora di 1 lavaggio PBS 1X, efficienza di aspersione è stato restaurato il valore originale di una soluzione pre-ipotonica (28.39±3.61% a 1-h PBS vs 31.02±7.16% a 1-h ipotonica). Le efficienze di perfusione coronarica media erano 46.08±9.89%, 28.08±7.12%, 25.70±5.30% e 28.39±3.61% con la soluzione ipertonica, la soluzione ipotonica, 1% SDS e 1x PBS, rispettivamente (Figura 7).
Poiché il perfusato deflusso da PA e LV simultaneamente sono stati raccolti, il loro contenuto di detriti potrebbe essere confrontato (Figura 8A) per spettroscopia assorbanza misurata a 280 nm (Figura 8B). La torbidità dell'effluente da PA e LV è diminuito nel tempo durante l'aspersione di ogni soluzione; Tuttavia, torbidità dal PA ha mostrato un cambiamento di colore più brusco rispetto a quello osservato da LV durante il periodo iniziale di aspersione. Dopo il passaggio da un'ipertonica a una soluzione ipotonica, la torbidità del deflusso di PA ha cambiato da 1.15±0.03 a 1.40±0.07 (21,73% aumento) e del LV cambiato da 1.13±0.05 a 1.24±0.07 (9,73% di aumento). Durante la prima ora di aspersione di 1% SDS, torbidità cambiato da 1.17±0.04 a 2.77±0.15 (136.75% aumento) per PA e 1.11±0.04 a 1.75±0.26 (56,65% aumento) per l'effluente di LV. La correlazione tra torbidità di deflusso e l'interruzione di detriti delle cellule è stata valutata usando l'analisi della proteina (BCA) acido bicinconinico quando la concentrazione nella proteina è stata quantificata nei campioni di deflusso. I risultati ottenuti da decellularizzazione di 6 cuori umani hanno rivelato una correlazione lineare tra la concentrazione nella proteina e degli effluenti torbidità con R2 = 0,95 (Figura 8).
Dopo il completamento di decellularizzazione intero-cuore, l'angiogramma coronario ha confermato la conservazione delle vene coronarie intatto (Figura 9). Imaging ottico non lineare degli strati di miocardio da aree spesse (cioè, RV, LV e setto) nel cuore umano decellularizzati ha confermato la rimozione delle cellule, come nessuna presenza di cellula è stata osservata nei canali TPF (Figura 10). Cellule (cioè, cardiomiociti o fibroblasti cardiaci) con loro autofluorescence possono essere facilmente identificate nel canale TPF da loro morfologie di forma ovale e allungata. Per garantire l'efficacia del processo di decellularizzazione e rimozione di detriti cellulari, i cuori umani decellularizzati erano ulteriormente ha incassati in 19 regioni (Figura 6) per quantificare i livelli di DNA, gag solfonato e SDS restanti in quelle regioni. DNA in tutte le regioni era inferiore al 10% del cuore cadaverico. DNA in atrio di destra (8,39% - 10,38% riguardante cadaverico) e sinistra atrio (5.11-7,60%) era più alto (Vedi figura 11).
Figura 1: cuore cadaverico umano da un'agenzia di approvvigionamento dell'organo. Vista anteriore e posteriore del cuore umano cadaverico. Vena cava inferiore e una porzione dell'atrio di destra sono mancanti, come osservato nell'area tratteggiata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: ispezione per settale e/o anomalie anatomiche della valvola. (A) ispezionare se forame ovale pervio (PFO) è presente (comunicazione tra atrio destro e sinistro). (B) una sutura in polipropilene 5-0 viene applicato in modo continuo per chiudere il PFO. (C) atrio di destra è chiuso con un suturare corrente di polipropilene 5-0. (D) l'arteria polmonare principale viene sezionato dall'aorta ascendente di dissezione smussa. FO: forame ovale pervio; PA: arteria polmonare; Ao: aorta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: componenti del bioreattore infusione. Il sistema di decellularizzazione è composto di cappuccio in gomma (A) con 4 porte; Linea di deflusso (B) essere collegato all'arteria polmonare (PA); Connettori (C, F) con luer lock per la PA e l'aorta (Ao), (D) linea di inserimento per il ventricolo sinistro (LV), infusione (E) linea per essere collegato all'aorta, sacchetto poliestere (G) e (H) contenitore di aspersione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: montaggio di bioreattore di inserimento di una canula e infusione di cuore umano. (A) vista anteriore del cuore risultati dell'arteria polmonare (PA) e dell'aorta (Ao) singolarmente cannulate. (B) vista posteriore del cuore risultati cannula indirizzati al ventricolo sinistro (LV) attraverso la vena polmonare (PV). (C) il cuore umano all'interno del bioreattore infusione dopo l'assemblaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: installazione del sistema di decellularizzazione invertito orientato con la testa di pressione. (A) il sistema di decellularizzazione completo è composto da: un computer, un regolatore proporzionale-integrale-derivato (PID), pompe, un bioreattore e serbatoi per la raccolta dell'effluente dal ventricolo sinistro (LV) e dell'arteria polmonare (PA). Ao: aorta. Le frecce indicano la direzione del flusso. (B) lo schema di installazione del cuore umano all'interno del bioreattore di aspersione e i percorsi di flusso associata di perfusato/acque reflue durante decellularizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: rappresentazione schematica dell'esame di routine e post-decellularizzazione di decellularizzazione di un cuore umano. (A) diagramma della procedura decellularizzati. (B) anteriore e posteriore esame di un cuore umano decellularizzato. (C) lordo dissezione di un cuore umano in quattro sezioni trasversali (sezione alla sezione D) per l'analisi di analisi biochimica. La colorazione nei cuori umani è causata tramite il deposito residuo lipofucin. La colorazione si presenta normalmente in superficie ventricolare interna o il confine tra epicardio e del miocardio. LA: atrio sinistro; RA: atrio destro; LV: ventricolo sinistro; RV: ventricolo destro; Formica: anteriore; Messaggio: posteriore; Hyper: ipertonica; IPO: ipotonica; SDS: solfato dodecilico di sodio; PBS: tampone fosfato salino. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: dinamica dei flussi time-lapse durante decellularizzati. (A) tasso di flusso di infusione di soluzioni di decellularizzazione nell'aorta durante la procedura. (B) una portata di effluente da PA durante decellularizzati. (C) l'efficienza di perfusione coronarica durante decellularizzati. (D) significa efficienza perfusione coronarica durante l'aspersione di soluzioni/reagenti diversi. N = 6. I dati rappresentano mean±SEM. PA: arteria polmonare; Hyper: ipertonica; IPO: ipotonica; SDS: solfato dodecilico di sodio; PBS: tampone fosfato salino; SEM: errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: interruzione di detriti di time-lapse cella durante decellularizzati. (A) raccolta multimediale di deflusso da PA e non-PA (ventricolo sinistro). (B) risultato della misura di torbidità a 280 nm. (C) correlazione lineare esiste tra torbidità e concentrazione nella proteina. n = 6 cuori umani. Il controllo era pulito decellularizzazione soluzione. I dati rappresentano mean±SEM. PA: arteria polmonare; Hyper: ipertonica; IPO: ipotonica; SDS: solfato dodecilico di sodio; SEM: errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: angiogramma coronario del cuore umano decellularizzati conferma l'evidenza thevascular dopo decellularizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: immagini ottenute mediante microscopia ottica non lineare dal miocardio cadaverico e decellularizzato non mostrano nessuna presenza di cellule (cioè, cardiomiociti o fibroblasti cardiaci) con morfologie di forma ovale o allungata nel decellularizzati LV, RV e setto. LV: lasciato ventricolo; RV: ventricolo destro; TPF: fluorescenza due fotoni; SHG: generazione di seconda armonica. Alcune cellule cardiache sono indicati dalle frecce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: risultati di analisi biochimica. (A) DNA rimanente relativo cuore cadaverico in tessuti decellularizzati. (B) rimanenti GAG relativo cuore cadaverico in tessuti decellularizzati. (C) rimanenti SDS in tessuti decellularizzati. n = 6 cuori umani. I dati rappresentano LA mean±SEM.: lasciato atrio; RA: atrio destro; LV: ventricolo sinistro; RV: ventricolo destro; Formica: anteriore; Messaggio: posteriore; SDS: solfato dodecilico di sodio; SEM: errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Metodo. | Pro | Con |
| Aspersione di Langendorff montante convenzionale | · Facile accesso al cuore per riparare durante decellularizzazione | · Eccessivo sforzo sull'aorta a causa del peso del cuore |
| · Tasso di flusso di infusione alta durante l'aspersione di SDS sotto controllo a pressione costante | ||
| · Efficienza bassa perfusione coronarica durante l'aspersione di SDS | ||
| · Parte dell'arteria aorta/polmonare sopra linea di legatura cannula potrebbe ottenere disidratata e facilmente contaminata | ||
| Invertito Langendorff perfusione all'interno di una custodia pressurizzata | · Minimizzare lo sforzo esercitato sull'aorta a causa del peso del cuore | · Difficile accesso cuore se la riparazione è necessaria. |
| · Tasso di flusso di infusione bassa durante l'aspersione di SDS sotto controllo a pressione costante | ||
| · Migliorato l'efficienza di perfusione coronarica durante l'aspersione di SDS | ||
| · Nessun tessuti sarà asciugato dal momento che tutto il cuore è sommersa/idratata. |
Tabella 1: Un riassunto dei Pro e contro di tutto cuore decellularizzazione mediante perfusione convenzionale verticale vs invertito Langendorff perfusione all'interno di una custodia pressurizzata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A nostra conoscenza, questo è il primo studio di decellularizzazione relazione invertita dei cuori umani all'interno di una custodia pressurizzata con monitoraggio time-lapse di rimozione di detriti di tasso e cella di flusso. Il sacchetto di pericardio-come mantiene l'orientamento del cuore stabile durante tutta la procedura di decellularizzazione. Sommergendo e invertendo i cuori interi all'interno di un sacchetto previene la disidratazione e riduce al minimo sforzo eccessivo sull'aorta (dal peso del cuore) quando contro il convenzionale verticale Langendorff aspersione decellularizzazione metodo9. Questo, a sua volta, conserva la competenza della valvola aortica.
Per raggiungere l'efficienza massima decellularizzazione, resistenza vascolare coronaria deve essere bassa per garantire adeguato e coerente di aspersione di fluido attraverso il miocardio intero. Nel modello tutto-cuore decellularizzazione mediante perfusione retrograda, fluido si accumula nei ventricoli ed eleva la pressione intraventricolare, che, a sua volta, aumenta la resistenza vascolare coronaria e limita il flusso di fluidi. Anche se la valvola aortica è intatta, la cavità ventricolare riempie secondaria a perdita del fisiologico e a sua volta comprime la parete ventricolare.
La nostra tecnica di decellularizing un cuore all'interno di una custodia pressurizzata è finalizzato ad alleviare questo problema e aumentare l'efficienza di decellularizzazione. Una pressione di 120 mmHg nella radice aortica e 14 mmHg nel sacchetto è mantenuta durante tutto il processo di decellularizzazione. Questi valori di pressione sono molto vicino al range fisiologico (80-120 mmHg nell'aorta) e 15 mmHg per la pressione telediastolica ventricolare sinistra22. Secondo Murthy et al. 23, gli intervalli di tassi di flusso sanguigno del miocardio da 0,61 a 1,10 mL/min/g e il cuore umano peso24,25 è circa 245 a 308 g; quindi, il tasso fisiologico flusso coronario è circa 149.45 a 338,80 mL/min, ma dipende dal peso del cuore. Il nostro tasso di deflusso da PA ha variato da 20 a 50 mL/min, che è inferiore al valore del tasso fisiologico flusso coronario e potrebbe avere portato da 2 diverse situazioni: 1) l'infusione di soluzioni al cuore produrre l'edema e c'è anche normale anatomico drenaggio del sistema coronarico nella cavità del ventricolo sinistro; 2) come si verifica la decellularizzazione, liquido inoltre è perso attraverso le pareti decellularizzate a causa di un aumento naturale della loro permeabilità. Questa pressione differenziale previene il collasso dei vasi e consente loro di rimanere brevetto. Inoltre, questo sistema mantiene il cuore nelle relative condizioni anatomiche senza comprimere la parete miocardica, che aumenterebbe la resistenza vascolare coronaria e compromettere la circolazione intravascolare delle soluzioni decellularizzati. Il profilo di tasso del flusso di infusione dei cuori umani (figura 7A) è molto simile a ciò che abbiamo osservato nel nostro decellularizzazione invertito di cuore suino9, con più basso tasso di flusso di infusione che si verificano durante la perfusione ipotonica e un leggero aumento nella flusso di velocità (110.61±14.40 mL/min a 176.31±44.03 mL/min) che si verificano durante l'aspersione SDS 1%. Il nostro tasso di flusso di infusione (valore medio = 151.50±3.71 mL/min) durante 1% SDS aspersione era paragonabile, o addirittura inferiore a quella per decellularizzazione di cuore umano segnalato da Guyette et al. 14 tuttavia, il nostro metodo è eseguito con controllo di pressione di 120 mmHg e loro metodo utilizzato 60 mmHg. Questa differenza di pressione di aspersione suggerisce un'efficacia superiore di chiusura della valvola aortica nella nostra tecnica poiché una portata minore di infusione potrebbe mantenere una maggiore pressione. Un'altra possibilità è che l'aumentata resistenza coronaria era dovuto alla pressione di 14 mmHg applicata all'interno della confezione. Inoltre, il nostro metodo di cuore umano ha mostrato una simile tendenza decrescente di efficienza di perfusione coronarica (~ 30%, Figura 7, 7D) da iper al cambiamento di soluzione ipotonica rispetto al nostro decellularizzazione invertito cuore porcino (~ 10% in invertito orientamento9vs 1-2% in orientamento verticale). Tuttavia, questo metodo novello potrebbe conservare efficienza perfusione coronarica durante l'aspersione di SDS paragonabile alla perfusione di soluzione e così sembra superiore al nostro precedente metodo di inversione del campione. La tabella 1 elenca i pro e contro della perfusione montante convenzionale vs invertito Langendorff perfusione all'interno di una custodia pressurizzata.
Oltre alla portata, deflusso torbidità monitoraggio potrebbe essere un altro strumento utile per valutare l'efficienza e il progresso di decellularizzazione. Durante decellularizzazione, torbidità dell'effluente dal PA era superiore a quella dell'effluente da siti non-PA (Figura 8B). Ciò suggerisce che la maggior parte dell'irrorato soluzione stava andando attraverso il sistema vascolare per decellularizzazione "corretto". Ma per questo deve essere valido, deve essere indirizzato al seguente: Inter-camera shunt, o la pervietà della valvola aortica. Attento e meticoloso controllo pertanto è necessaria per evitare il fallimento del metodo a causa di non conformità anatomica. Il profilo di torbidità (Figura 8B) del processo di decellularizzazione di tutto cuore dimostrato tendenze simili come illustrato in precedenza, con torbidità brusco cambiamento durante il periodo di transizione iniziale di diversi perfusati9.
Un obiettivo principale per tessuti decellularizzati deve essere in grado di ripopolarle con cellule ed ottenere funzionalità, proliferazione, maturazione e collegamento alta delle cellule. Nostri tessuti decellularizzati sono state con successo cellularizzati per varie applicazioni26,27, dove i tessuti sono stati con successo cellularizzati e raggiunto trombogenicità inferiore. Nella nostra analisi biochimiche di decellularizzazione cuori umani, abbiamo valutato 19 regioni con spessori differenti del tessuto. Il DNA e la SDS in tessuti decellularizzati vario, con il valore più alto ottenuto nell'atrio destro e sinistro. Questo potrebbe essere causato dall'orientamento del cuore in una configurazione a testa in giù, in cui i detriti cellulari era intrappolato nella parte inferiore del sacchetto o dove la pressione esterna ridotto flusso. Decellularizzazione di perfusione si basa su strutture di cuore intatto, tra cui affluenti e coronarie. Come questi organi siano prelevati da donatori multiorgano, questi cuori di solito hanno una grande parte di loro atria rimosso. Durante la preparazione di questi organi e la riparazione della parete atriale, ci era rottura nell'irrigazione di queste regioni, compromettendo il flusso delle soluzioni decellularizzati. Per decellularizzazione di cuore non-aspersione, altri gruppi di ricerca hanno segnalato il DNA rimanente 2-6% in ratto28, porcino29,30 e umano31 rispetto ai rispettivi cuore cadaverico. Tuttavia, hanno usato il gelo-disgelo28,29,30, enzima29,del siero e30 31 a loro protocollo di decellularizzazione, che potrebbe danneggiare l'ECM in misura maggiore rispetto la nostra tecnica di perfusione-basato. Lo sviluppo di metodi per affrontare adeguatamente queste limitazioni saranno fondamentale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Taylor è il fondatore e azionista di Miromatrix Medical, Inc. Questa relazione è gestita in conformità con le norme di conflitto di interessi dall'Università del Minnesota e il Texas Heart Institute; gli altri autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dalla concessione di Houston Endowment e il Texas Emerging Technology Fund. Gli autori riconoscono l'agenzia di approvvigionamento dell'organo LifeGift, Inc e famiglie del donatore per aver reso possibile questo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Zia, S., et al. Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).
- Zimmermann, W. H. Strip and Dress the Human Heart. Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
- Peloso, A., et al. Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 107 (2015).
- Guyette, J. P., et al.
- Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis. Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).
- Lee, P. F., et al. Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts. Acta Biomaterialia. , (2016).
- Momtahan, N., et al. Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Weymann, A., et al. Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model - Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds. Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).
- Weymann, A., et al. Bioartificial heart: A human-sized porcine model--the way ahead. PLoS One. 9 (11), e111591 (2014).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. Journal of Visualized Experiments. (70), e50059 (2012).
- Guyette, J. P., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Sanchez, P. L., et al. Data from acellular human heart matrix. Data Brief. 8, 211-219 (2016).
- Garreta, E., et al. Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts. Biomaterials. 98, 64-78 (2016).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Larson, A. M., Yeh, A. T. Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses. Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).
- Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices. Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).
- Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).
- Wu, Z., et al.
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Murthy, V. L., et al. Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC. Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal organ weights in men: Part I-the heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).
- Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix. PLoS One. 9 (2), e90406 (2014).
- Robertson, M. J., Soibam, B., O'Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology. PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).
- Baghalishahi, M., et al. Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Freytes, D. O., O'Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes. Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).
- Oberwallner, B., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
