Summary
Her presenterer vi en protokoll for syntese av placental chondroitin sulfate A bindende peptid (plCSA-BP)-konjugert lipid-polymer nanopartikler via enkeltsteg sonication og bioconjugate teknikker. Disse partiklene utgjør et romanen verktøy for målrettet levering av therapeutics til de fleste mennesker svulster og placental trophoblasts til å behandle kreft og placental lidelser.
Abstract
En effektiv kreft terapeutisk metode reduserer og eliminerer svulster med minimal systemisk toksisitet. Aktivt målretting nanopartikler tilbyr en lovende tilnærming til kreft terapi. Glycosaminoglycan placental chondroitin sulfate en (plCSA) er uttrykt i et bredt spekter av kreftceller og placental trophoblasts og malarial protein VAR2CSA kan spesifikt bindes til plCSA. Et rapportert placental chondroitin sulfate A bindende peptid (plCSA-BP), avledet fra malarial protein VAR2CSA, kan også binde å plCSA kreftceller og placental trophoblasts. PlCSA-BP-konjugerte nanopartikler kan derfor brukes som et verktøy for målrettet stoffet levering til kreft hos mennesker og placental trophoblasts. I denne protokollen beskriver vi en metode for å syntetisere plCSA-BP-konjugerte lipid-polymer nanopartikler lastet med doksorubicin (plCSA-DNPs); metoden består av en enkelt sonication trinn og bioconjugate teknikker. I tillegg beskrives flere metoder for å karakterisere plCSA-DNPs, herunder fastsettelse av deres mekanisk-egenskaper og mobilnettet opptak av placental choriocarcinoma (JEG3) celler.
Introduction
En effektiv kreft terapeutisk metode reduserer og eliminerer svulster med minimal systemisk toksisitet. Derfor er selektiv svulst målretting nøkkelen til å utforske vellykket terapeutiske metoder. Nanopartikler tilbyr en lovende mulighet for kreft terapi, og molekylær samlinger med ulike funksjonsgruppene vil forbedre narkotika effekt og redusere tilhørende bivirkninger1,2. Videre benytter hydrogenion systemer hovedsakelig passive og aktive målretting for å nå målet svulster3.
Passiv målretting utnytter medfødte egenskaper av nanopartikler og økt permeabilitet og oppbevaring (EPR) effekter å nå kreftceller. Kationisk liposomer har blitt brukt til å levere ulike anticancer narkotika til svulster i klinisk bruk4,5,6. Til tross for den potensielle effektive kreft terapeutiske effekten, en lav narkotika konsentrasjon i regionen svulst og en manglende evne til å skille kreftceller fra normalt vev er to store begrensninger av passiv målretting nanopartikler7.
Aktive målretting strategier utnytte antigen-antistoff, ligand-reseptor og andre molekylære anerkjennelse interaksjoner spesielt levere narkotika til svulster8. Glycosaminoglycan placental chondroitin sulfate en (plCSA) er generelt uttrykt på de fleste kreftcellene og placental trophoblasts. Videre malarial protein VAR2CSA kan spesielt binde plCSA9,10. Derfor kan VAR2CSA være et verktøy for målretting menneskelige celler. Men når VAR2CSA er konjugert til nanopartikler, kan full lengde protein begrense gjennomtrengning av nanopartikler i kreftceller. Nylig oppdaget vi en plCSA binding peptid (plCSA-BP), avledet fra malarial protein VAR2CSA. plCSA-BP-konjugerte lipid-polymer nanopartikler raskt limt til choriocarcinoma celler og betydelig økt doksorubicin (DOX) anticancer aktivitet i vivo11; disse partiklene også limt til placental trophoblasts og kan tjene som et verktøy for målrettet levering av narkotika morkaken12.
Lipid-polymer nanopartikler består av en lipid monolayer skall og en hydrofobe polymere kjerne og representerer en ny operatør for narkotika-leveranser. Disse nanopartikler kombinere fordelene med liposomer og polymere nanocarriers, som kontrollerbar hydrogenion størrelse, høy biocompatibility, vedvarende narkotika utgivelsen, høy narkotika lasting effektivitet (LE) og utmerket stabilitet13. I dette arbeidet brukte vi en enkelt-trinns sonication metode for å syntetisere lipid-polymer nanopartikler. Denne metoden er rask, praktisk og egnet for oppskalering og har vært mye brukt til å forberede lipid-polymer nanopartikler av vår gruppe11,14 15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydroklorid (EDC) er en populær carbodiimide brukes som crosslinking agent for bøye biomolecules som inneholder aminer og carboxylates19. EDC er N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) den vanligste Bøyning reagensen i overflaten og hydrogenion Bøyning reaksjoner20,21. NHS kan redusere antall siden reaksjoner og forbedre stabilitet og ytelse på ester mellomprodukter22,23.
Her beskriver vi en protokoll for å syntetisere plCSA målrettede lipid-polymer nanopartikler. Først er enkeltsteg sonication syntese av DOX lastet lipid-polymer nanopartikler (DNPs) beskrevet. Deretter er en EDC/NHS bioconjugate teknikk for å generere plCSA-BP-konjugerte lipid-polymer nanopartikler innført. Denne bioconjugate teknikken kan også brukes til å bøy andre antistoffer og peptider å nanopartikler. Til slutt, vi beskrive mekanisk-egenskaper og i vitro analysen benyttes for å karakterisere plCSA målrettede lipid-polymer nanopartikler. Vi tror at disse plCSA målrettede lipid-polymer nanopartikler kan utgjøre et effektivt system for levering av målrettede narkotika mest menneskelige kreft og målrettet levering av payloads i morkaken å behandle placental lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av lager løsninger
- Forberede en vandig løsning av 4% etanol fortynne 4 mL av absolutt etanol med 100 mL ultrapure vann. Lagre løsningen på 4 ° C.
Merk: Ultrapure vann er definert som vann uten forurensninger som bakterier, partikler, ioner eller nucleases. Ultrapure vann er Hentet fra en vannrensing system med et mål resistivitet av opptil 18.2 mΩ·cm, som betyr lav anionic forurensning. - Forbered en 1 mg/mL soyabønner lecithin lagerløsning ved oppløsning 20 mg av soyabønner lecithin i 20 mL vannløsning av 4% etanol. Lagre soyabønner lecithin lager løsningen på 4 ° C.
- Forbered en 25 mg/mL DSPE-pinne (2000)-COOH lagerløsning ved oppløsning 100 mg av DSPE-PEG-COOH i 4 mL vannløsning av 4% etanol. Lagre lager løsningen på 20 ° C.
- Forbered en 10 mg/mL DOX lagerløsning ved oppløsning 50 mg DOX i 5 mL ultrapure vann. Lagre DOX lager løsningen på 4 ° C i mørket.
- Forbered en 2 mg/mL PLGA lagerløsning ved oppløsning 20 mg av PLGA i 10 mL av acetonitrile. Lagre PLGA lager løsningen på 4 ° C.
FORSIKTIG: Acetonitrile er brannfarlige og giftige. Operere med forsiktighet i avtrekksvifte, og ha riktig personlig utstyr, som labfrakker, vernebriller og latex hansker. - Forbered en 0.1 M 2-(morpholino) ethanesulfonic acid (MES, pH 6.0) lager løsning ved oppløsning 2.17 g MES i 100 mL ultrapure vann. Lagre lager løsningen på 4 ° C.
2. syntese av DNPs
Merk: For å unngå DOX fotokjemisk fornedrelse, alle operasjoner ble utført i mørket.
Nanopartikler ble syntetisert av en tidligere rapportert enkeltsteg sonication metode11,13,14.
- Legge 3 mL vannløsning av 4% etanol som et sterilt 10 mL sentrifuge rør. Deretter legge til 90 µg soyabønner lecithin lager løsningen, 210 µg DSPE-PEG-COOH lager løsningen og 750 µg DOX lager løsningen i 3 mL vannløsning av 4% etanol.
- Sett sentrifuge røret i en isbadet og plassere isbadet på en ultralyd prosessor.
- Med en 1 mL sprøyte, Pipetter 2 mg PLGA lager løsningen dropwise (1 drop/4-6 s) i sentrifuge røret. I mellomtiden sonicate røret ved hjelp av en ultralyd prosessor på en frekvens på 20 kHz og en utgang amplituden til 30% i 5 min for å syntetisere DNPs.
Merk: For å syntetisere uniform partikler med små størrelser, hastigheten som den PLGA løsningen er dryppet inn i røret må være treg, og boble generasjon bør unngås. - Rense DNPs ved å vaske ovenstående løsning inne 0.1 M MES buffer (pH 6.0) 3 ganger ved hjelp av en sentrifuge filter (MWCO, 10 kDa). Sentrifuger på 4 ° C og 1000 × g for 3 min hver gang. Til slutt, ca 1 mL av MES-løst nanopartikler bør forbli.
Merk: Dette er en akseptabel sluttpunkt i prosedyren. Hvis ikke brukt å bøye peptider, nanopartikler kan bli renset av PBS buffer (pH 7.4), og de renset DNPs kan lagres på 4° C i mørket.
3. Bøyning av peptider å DNPs
-
Ester aktivisering
- Legge til 0,4 mg av EDC (siste konsentrasjon 2 mM) til 1 mL av DNPs.
- Legge til 0,24 mg NHS reaksjonen (siste konsentrasjon 2 mM).
Merk: For enkel addisjon av riktig antall EDC og NHS, en lagerløsning kan tilberedes hvis reagensene er oppløst og brukes umiddelbart. - Bland reaksjon komponentene godt, og plassere reaksjonen på en shaker; tillate reaksjon for 30 min - 1 t ved romtemperatur i mørket.
-
Amin reaksjon
- Øke buffer pH 7.2 7.5 bruke PBS (20 ×, pH 7.4).
- Legg til 0,5 mg plCSA målretting peptid (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) reaksjon-løsning.
Merk: Før tillegg oppløse peptider i 20% acetonitrile. Hvis peptider ikke dissolvable, kan sonication i et bad sonicator nyttig. - Blandingen løsningen, og plasser på en shaker; at reaksjonen å fortsette i 4 ° C over natten i mørket.
- Plasser konjugat løsning i dialyse poser (MWCO, 3500 Da) dialyze og rense de plCSA-DNPs med PBS (pH 7.4) buffer ved romtemperatur for 24 h i mørket.
Merk: Alternativt rensing kan utføres som i trinn 2.4 hente plCSA-DNPs. - Filtrere rekonstituert løsningen gjennom et 0.22 µm sterile sprøyter filter fjerne potensielle precipitates celle kultur-programmer.
4. karakterisering av plCSA målrettede Lipid-Polymer nanopartikler
-
Måling av etter hydrogenion størrelsen med dynamisk lysspredning (DLS)
- Fortynne nanopartikler med ultrapure vann (50-fold fortynning). Legg 500 µL av utvalget i søppel i henhold til instruksjonene i Distribusjonslister eller zeta potensielle apparatet.
Merk: Zeta potensial og DLS cuvettes kan variere avhengig av instrumentets spesifikasjoner. - Når målet er fullført, registrere partikkel diameter, polydispersity indeksen (PDI) og zeta potensielle. Gjennomsnittlig resultatene fra 4 gjentatte målinger og beregne standardavviket.
- Fortynne nanopartikler med ultrapure vann (50-fold fortynning). Legg 500 µL av utvalget i søppel i henhold til instruksjonene i Distribusjonslister eller zeta potensielle apparatet.
-
Overføring elektronmikroskop (TEM)
Merk: Morfologi av nanopartikler ble observert av TEM med metoden negative flekken. 24- Fortynne nanopartikler med ultrapure vann (400-fold fortynning). Legg 20 µL av utvalget til et TEM rutenett, og la sitte i 5 minutter.
- Legg 100 µL av 2% (w/v) phosphotungstic syre og la sitte i 2 min. veken bort slippverktøyet.
- Tørr TEM rutenettet ved romtemperatur.
- Sett TEM akselerasjon spenningen på 80 kV, og forstørre bildet til 100.000 × å visualisere nanopartikler.
-
Fastsettelse av innkapsling effektiviteten (EE) og LE
- Standardkurve generasjon. Oppløse DOX i ultrapure vann for å forberede DOX løsninger av fem ulike konsentrasjoner: 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL og 100 µg/mL. Måle absorpsjon av DOX løsninger på 480 nm med en UV-VIS spectrometer. Generere en standard kurve basert på DOX konsentrasjoner.
- Fortynne 25 µL av nanopartikler med 500 µL ultrapure vann. Måle opptaket på 480 nm med en UV-VIS spectrometer. Beregne narkotika konsentrasjonen av standardkurven.
- Beregne LE hjelp av følgende ligning:
LE = ((mengde narkotika i nanopartikler) / (totalvekt av materialer)) × 100%. - Beregne EE hjelp av følgende ligning:
EE = ((mengde narkotika i nanopartikler) / (mengde lagt narkotika)) × 100%.
-
Måling av Bøyning effektivitet ved hjelp bicinchoninic syre (BCA) analysen 25 , 26 , 27
- Pipetter 25 µL av standard peptid løsninger (tabell 1) eller plCSA-DNPs i microplate brønnene i duplikat. Legg 200 µL til reagensen som arbeider i hver brønn, og bland platen på en plate shaker for 30 s.
- Dekk platen, og ruge på 37 ° C i 30 min.
- Måle absorbans ved 562 nm på en plate-leser. Bruke genererte standardkurven for å beregne plCSA konsentrasjonen av plCSA-DNPs.
- Beregne Bøyning effektiviteten ved hjelp av følgende ligning:
Bøyning effektivitet = ((antall peptid i nanopartikler) / (mengde lagt peptid)) × 100%.
| Medisinglass | Volumet av fortynner (μL) | Volum og kilde til peptid (μL) | Siste peptid konsentrasjon (μg/mL) |
| A | 0 | 300 av lager | 1000 |
| B | 250 | 250 av ampullen en fortynning | 500 |
| C | 250 | 250 av ampullen B fortynning | 250 |
| D | 250 | 250 av ampullen C fortynning | 125 |
| E | 300 | 200 av ampullen D fortynning | 50 |
| F | 250 | 250 av ampullen E fortynning | 25 |
| G | 400 | 100 av ampullen F fortynning | 5 |
| H | 500 | 0 | 0 |
Tabell 1. Utarbeidelse av Standard peptider
5. fluorescens mikroskopi vurdering av plCSA-målrettet hydrogenion opptak i Choriocarcinoma (JEG3) celler
- Frø celler på sterilt 12-vel plater på 1.0 × 104 celler/godt med komplett DMEM/F12 (cDMEM/F12, som inneholder 1% penicillin/streptomycin og 10% fosterets bovin serum (FBS)). At cellene å vokse til 60% samløpet på 37 ° C og 5% CO2 under fuktige tilstand.
- Fjerne media, og Legg til 1 mL av kalde friske medier med lav serum innhold (5% FBS) og DNPs eller plCSA-DNPs (5 µg av DOX tilsvarer).
- Inkuber blanding av celler og nanopartikler ved 4 ° C i 1 time.
- Inkubasjon fjerne media og vaskes cellene tre ganger med PBS. Deretter legger 1 mL av fersk cDMEM/F12 og ruge cellene på 37 ° C i 30 min.
- Fjern cDMEM/F12, og vask cellene tre ganger med PBS.
- Legg 2 mL kaldt 4% paraformaldehyde (PFA), og ruge ved romtemperatur i 15 min å fikse cellene.
- Fjerne PFA. Vask cellene med 2 mL PBS en gang. Legge 1 mL av PBS som inneholder DAPI (1 µg/mL) for kjerner flekker, og Inkuber ved romtemperatur for 10 min.
- Sug opp PBS og vaskes cellene tre ganger med PBS.
- Legge til montering medium, og image fluorescens med en fluorescens mikroskopi, med grønne og blå kanalene for å visualisere DOX og kjerner, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen, PLGA, DSPE-PEG-COOH og soyabønner lecithin er et representativt polymer, lipid-PEG-COOH konjugert og lipid, henholdsvis. Syntese av plCSA målrettede lipid-polymer nanopartikler via en enkelt-sonication metoden og en EDC/NHS teknikken illustreres i figur 1. Først sonication tilfeller soyabønner lecithin, PLGA og DSPE-PEG-COOH selv montere skjemaet core-skallet strukturert DNPs. Kjernen består av PLGA og innkapslet DOX, skallet består av DSPE-PEG-COOH og soyabønner lecithin monolayer ligger på grensesnittet av skallet og kjernen. Deretter var - COOH gruppene utsatt på DNP overflaten konjugert med -NH2 grupper av den peptid via EDC/NHS teknikken å syntetisere plCSA-DNPs.
DNPs i denne protokollen var 82.3 ± 4.7 nm i diameter, og etter Bøyning til plCSA-BP, diameteren på de primære DNPs økt til 109.3 ± 5.9 nm (figur 2). PDI av DNPs og plCSA-DNPs var 0.127±0.005 og 0.134 ± 0.065, henholdsvis. TEM bilder av DNPs og plCSA-DNPs viste også at partikler ble godt spredt, og generelt hatt sfærisk morphologies (Figur 3). Zeta potensialet av DNPs og plCSA-DNPs var-20.1 ± 1.32 mV og-29.9 ± 3.56 mV, henholdsvis (tabell 2). Derfor er disse nanopartikler forventet for å være svært stabil.
| Nanopartikler | Diameter(NM) | PDI | Zeta potensielle (mV) |
| DNPs | 82.3±4.7 | 0.127±0.005 | -20.1±1.32 |
| plCSA-DNPs | 109.3±5.9 | 0.134±0.065 | -29.9±3.56 |
| PDI:polydispersity indeks. Dataene presenteres gjennomsnittlig ± SD (n = 3). | |||
Tabell 2. Karakteristikk av nanopartikler
EE og LE av nanopartikler er viktig for klinisk bruk. EE DOX av DNPs og plCSA-DNPs var 40.3 ± 1,67% og 39.5 ± 1,94%, henholdsvis. LE av DOX i DNPs og plCSA-DNPs var 6,2 ± 0.74% og 5.1 ± 0.42%, henholdsvis. Disse data viste at omfanget av narkotika lasting og narkotika innkapsling ble opprettholdt etter plCSA-BP dekorasjon. Dekorasjon effektiviteten i plCSA-BP på overflaten av DNPs ble bestemt av BCA analysen (Figur 4). PlCSA-BP Bøyning effektiviteten ble funnet for å være 45.5 ± 3,7%.
JEG3 mobilnettet opptaksanalyse indikerte at de plCSA-DNPs raskt bundet til JEG3 celler innenfor 30 min (figur 5). Derfor var plCSA-BP effektivt konjugert til DNP overflaten i denne protokollen. Videre kan plCSA-BP raskt binde JEG3 celler og øke cellulære opptaket av nanopartikler.
Figur 1. Skjematisk illustrasjon av metoden som brukes til å syntetisere plCSA målrettede lipid-polymer nanopartikler. Først enkeltsteg sonication metode ble brukt til å syntetisere lipid-polymer nanopartikler (DNPs), og deretter EDC/NHS teknikken ble brukt til å bøy peptider hydrogenion overflater (plCSA-DNPs). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Størrelse distribusjon av de forskjellige nanopartikler. Etter størrelsen på DNPs (A) og plCSA-DNPs (B) målt ved DLS. Representant tallene er presentert for å vise partikkelstørrelse og størrelsesDistribusjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Hydrogenion morfologi TEM. Typisk TEM bilde DNPs (A) og plCSA-DNPs (B) observert med 2% phosphotungstic acid flekker. Skala bar = 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Måling av Bøyning effektiviteten ved hjelp av BCA analysen. Standardkurve av peptider i 562 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Hydrogenion opptak av JEG3 celler. JEG3 celler ble analysert av fluorescens mikroskopi etter 30 min med inkubering med 5 µg/mL forskjellige nanopartikler. Rød: DOX, blå: DAPI-merket kjerner. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir en effektiv og reproduserbar metode for å syntetisere plCSA-BP-konjugerte lipid-polymer nanopartikler. Metoden enkeltsteg sonication å forberede lipid-polymer nanopartikler er rask, reproduserbare og forskjellig fra typiske nanoprecipitation metoder som innebærer varme, vortexing eller fordampning. Derfor reduserer utviklet metoden betraktelig tiden det syntese. I tillegg er til EDC/NHS bioconjugate brukes i denne protokollen en vanlig brukte og praktisk teknikk å bøye peptider og antistoffer mot nanopartikler. Derfor kombinasjonen av metoden enkeltsteg sonication med EDC/NHS bioconjugate teknikken å syntetisere plCSA målretting lipid-polymer nanopartikler kan besteget for klinisk bruk.
Bestemte prosedyrer er avgjørende for å syntetisere og karakteriserer plCSA-DNPs. Først bestemmer de relative konsentrasjonene av lecithin, PLGA og DSPE-PEG-COOH lipid-polymer hydrogenion størrelse og polydispersity. Når konsentrasjonen av lecithin er fast, en høyere konsentrasjon av DSPE-PEG-COOH resulterer i lavere polydispersity og mindre hydrogenion størrelse,13,15 som dermed reduserer stoffet LE. Når konsentrasjonen av PLGA er fast, erstattes mer DSPE-PEG-COOH av lecithin, fører til høyere hydrogenion polydispersity og større hydrogenion størrelse15. I dette tilfellet nanopartikler er mer ustabil og samlet lett. I denne protokollen, DSPE-PEG-COOH/PLGA vekt er 0,11 og lecithin/DSPE-PEG-COOH masse forholdet er 0.43. Lipid-polymer hydrogenion størrelsen er omtrent 82 nm med en PDI på ca 0.127.
Andre er pH av løsningen under Bøyning av peptider til nanopartikler av største betydning. Optimal pH av ester aktivisering er 5.0-6.0, Amin reaksjonen er mest effektiv i pH 7.2 7.519,28,29. For best resultat, bør reaksjonen utføres i to trinn. Først skjer ester aktiveringen i MES (eller et annet noncarboxylate, nonamine buffer) på pH 5.0-6.0. Deretter justeres pH til 7,2-7.5 med PBS (eller en annen nonamine buffer) umiddelbart før reaksjon med Amin inneholder molekyl19. Tatt i betraktning at halveringstiden av NHS estere er 4-5 h pH 7.019, overstiger varigheten av Amin reaksjonen 10 h på 4 ° C.
Den siste kritiske faktoren er hydrogenion opptak. Nontargeted opptak av DNPs av JGE3 celler ble utslått i en funksjon analyse av målrettet opptaket ved å kontrollere kultur tid og temperatur og konsentrasjonen av FBS i medium. I denne protokollen, JEG3 celler ble inkubert med 5% FBS ved 4 ° C i 1 t, og deretter kultivert på 37 ° C i 30 min å minimere DNP mobilnettet opptak.
Hvis det oppstår problemer under prosedyren, finnes det tre store feilsøkingstrinn syntese og karakterisering av plCSA-DNPs. Først lipid-polymer nanopartikler ble utarbeidet av den selv-montering av PLGA og lecithin under sonication forhold. PLGA bare oppløses i organiske løsemidler. Derfor, på tillegg til et hydrofile løsemiddel, PLGA precipitates raskt i små nanopartikler. For å redusere effekten av hastigheten på dropwise tillegg og unngå å generere større partikler, er sonication av blandingen i 1-2 minutter før du legger til PLGA nødvendig. Andre, selv om kvantitativ analyse av plCSA-BP Bøyning effektiviteten med metoden BCA er rask og praktisk, en høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) analysen er mer nøyaktig. HPLC eksperimentelle detaljene har blitt beskrevet av vår gruppe11 og andre30,31,32. Til slutt, optimale forhold for plCSA-DNP mobilnettet opptak kan variere for andre kreftceller. Gradvis avtagende FBS konsentrasjonen og øke inkubasjon tiden på 37 ° C kan hjelpe bestemme optimale forhold.
En begrensning av protokollen er at hydrophobicity av narkotika bestemmer EE av narkotika. Sammenlignet med hydrofile stoffer, har hydrofobe narkotika en sterkere affinitet for PLGA, som resulterer i en økt narkotika EE. I slike tilfeller må prosedyrene for syntese av plCSA målrettede lipid-polymer nanopartikler undersøkes eksperimentelt for å finne mest effektive syntese metode som resulterer i ideelle stoffet LE og EE.
Som nevnt ovenfor, er glycosaminoglycan-plCSA spesielt uttrykt i de fleste kreftceller og placental trophoblasts. Derfor er det viktig å merke seg at plCSA-NPs skal brukes for målrettet levering av therapeutics tumor celler i bare nonpregnant dyr og mennesker, og at disse narkotika-lastet partiklene ville føre til bivirkninger i morkaken gravide dyr og mennesker.
I sammendraget, har vi beskrevet en enkel og praktisk metode for å syntetisere plCSA målrettede lipid-polymer nanopartikler. Betydningen av denne protokollen er at den øker narkotika tilgjengeligheten på svulster og morkaken, samtidig som samtidig toksisitet. Denne tilnærmingen bør være nyttig for målrettet levering av narkotika til svulster og morkaken og kan skaleres for å forberede plCSA målrettede lipid-polymer nanopartikler kliniske applikasjoner i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X.F. og B.Z. er oppfinnere på patent PCT/CN2017/108646 og 201710906587.6 innsendt av Netthinnen som dekker en plCSA målrettede hydrogenion syntese metode og program. Noen mulige interessekonflikter ble avslørt av andre forfattere.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra nasjonale nøkkelen forskning og utvikling Program i Kina (2016YFC1000402), National naturvitenskap Foundation (81571445 og 81771617) og Natural Science Foundation av Guangdongprovinsen (2016A030313178) til X.F. og Shenzhen Basic Research Fund (JCYJ20170413165233512) til X.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid--polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Cancer Research. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Biochemistry. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
