Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتوليف كبريتات شوندروتن المشيمة بربط الببتيد (بلكسا-BP)-مترافق دهن البوليمر جسيمات نانوية عبر خطوة واحدة سونيكاتيون وبيوكونجوجاتي تقنيات. وتشكل هذه الجسيمات أداة جديدة للتنفيذ الهادف للتداوي للأورام البشرية الأكثر والمشيمة تروفوبلاستس لعلاج السرطان والاضطرابات المشيمية.
Abstract
طريقة علاجية فعالة سرطان يقلل ويزيل الأورام مع الحد الأدنى من السمية الشاملة. جسيمات نانوية نشطة تستهدف تقدم نهجاً واعداً لعلاج السرطان. يتم التعبير عن كبريتات شوندروتن المشيمية glycosaminoglycan (بلكسا) على مجموعة واسعة من الخلايا السرطانية و trophoblasts المشيمة، والبروتين الملاريا على وجه التحديد يمكن ربط VAR2CSA بلكسا. يمكنك ربط كبريتات شوندروتن المشيمية عنها بربط ببتيد (بلكسا-BP)، المستمدة من البروتين الملاريا VAR2CSA، أيضا على وجه التحديد بلكسا على الخلايا السرطانية والمشيمة تروفوبلاستس. ومن ثم، يمكن استخدام جسيمات نانوية بلكسا-بي بي-مترافق كأداة لإيصال الأدوية المستهدفة للسرطانات البشرية والمشيمة تروفوبلاستس. في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة لتجميع جسيمات نانوية بوليمر دهن بلكسا-بي بي-مترافق محملة ميتوتريكسات (بلكسا-دنبس)؛ وتتألف الطريقة تقنيات خطوة وبيوكونجوجاتي sonication واحد. وبالإضافة إلى ذلك، يرد وصف أساليب عدة لوصف بلكسا-دنبس، بما في ذلك تحديد الخصائص الفيزيائية الكيميائية والخلوية امتصاص الخلايا المشيمية تشوريوكارسينوما (JEG3)،.
Introduction
طريقة علاجية فعالة سرطان يقلل ويزيل الأورام مع الحد الأدنى من السمية الشاملة. ومن ثم استهداف الورم الانتقائي هو المفتاح لاستكشاف أساليب علاجية ناجحة. جسيمات نانوية فرصة واعدة لعلاج السرطان، وسيعزز فعالية المخدرات التجميعات الجزيئية مع مختلف المجموعات الوظيفية والتقليل من الآثار الجانبية المرتبطة به1،2. وعلاوة على ذلك، تستخدم نظم نانوحبيبات أساسا الاستهداف السلبي والإيجابي للتوصل إلى الهدف الأورام3.
استهداف السلبي يستغل الخصائص الفطرية جسيمات نانوية وزيادة نفاذية والاستبقاء (EPR) تأثيرات للوصول إلى الخلايا السرطانية. الدهنية الموجبة قد استخدمت بنجاح لتسليم المخدرات السرطان المختلفة للأورام في التطبيقات السريرية4،،من56. على الرغم من التأثير العلاجي الفعال السرطان المحتملة، بتركيز منخفض من المخدرات في منطقة الورم وعدم قدرة على التمييز بين الخلايا السرطانية من أنسجة طبيعية هي القيود الرئيسية اثنين من جسيمات نانوية الاستهداف السلبي7.
استراتيجيات الاستهداف النشط الاستفادة ضد مستضد ومستقبلات يجند والتفاعلات الأخرى التعرف الجزيئي لتسليم المخدرات على وجه التحديد إلى أورام8. وأعرب عن كبريتات شوندروتن المشيمية glycosaminoglycan (بلكسا) هو على نطاق واسع في معظم الخلايا السرطانية والمشيمة تروفوبلاستس. وعلاوة على ذلك، البروتين الملاريا VAR2CSA تحديداً ربط بلكسا9،10. ومن ثم فإن VAR2CSA يمكن أن يكون أداة لاستهداف الخلايا السرطانية البشرية. ومع ذلك، عندما يتم مترافق VAR2CSA للجسيمات النانوية، قد تحد من البروتين كامل طول الاختراق من جسيمات نانوية في الخلايا السرطانية. في الآونة الأخيرة، فقد اكتشفنا ببتيد ملزمة بلكسا (بلكسا-BP)، المستمدة من البروتين الملاريا VAR2CSA. جسيمات نانوية بوليمر دهن بلكسا-بي بي-مترافق الرهينة بسرعة إلى خلايا تشوريوكارسينوما وميتوتريكسات زيادة كبيرة (دوكس) نشاط السرطان في فيفو11؛ هذه الجزيئات أيضا على وجه التحديد المستعبدين إلى trophoblasts المشيمة ويمكن أن تستخدم كأداة لإيصال الأدوية المستهدفة ل المشيمة12.
جسيمات نانوية بوليمر الدهن تتكون من قذيفة أحادي الطبقة الدهنية ونواة البوليمرية مسعور وتمثل شركة جديدة لإيصال الأدوية. جسيمات نانوية هذه الجمع بين مزايا الدهنية ونانوكاريرس البوليمرية، مثل حجم نانوحبيبات يمكن السيطرة عليها وعالية توافق مع الحياة، والإفراج عن المخدرات مستمرة، وتحميل المخدرات عالية الكفاءة (LE) والاستقرار الممتاز13. في هذا العمل، استخدمنا أسلوب sonication خطوة واحدة لتجميع جسيمات نانوية بوليمر الدهن. هو سريعة وملائمة ومناسبة للارتقاء بهذا الأسلوب وقد استخدمت على نطاق واسع لإعداد جسيمات نانوية دهن البوليمر لدينا مجموعة11،14 وغيرها15،،من1617،18 .
هيدروكلوريد كاربودييميدي 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) (EDC) كاربودييميدي شعبية المستخدمة كعامل كروسلينكينج للتصريف الجزيئات الحيوية التي تحتوي على كاربوكسيلاتيس والامينات19. بالإضافة إلى تنمية الصادرات، N-هيدروكسيسولفوسوكسينيميدي (NHS) هو الأكثر شيوعاً الكاشف التصريف في المياه السطحية ونانوحبيبات الاقتران ردود فعل20،21. يمكن تقليل عدد ردود فعل الجانب الصحي ويعزز الاستقرار والغلة إستر وسيطة22،23.
هنا، نحن وصف بروتوكول لتوليف جسيمات نانوية بوليمر دهن بلكسا المستهدفة. أولاً، يتم وصف التوليف sonication خطوة واحدة لتحميل دوكس الدهن-بوليمر جسيمات نانوية (DNPs). ثم، يتم عرض أسلوب بيوكونجوجاتي تنمية الصادرات/دائرة الصحة الوطنية لتوليد جسيمات نانوية بوليمر دهن بلكسا-بي بي-مترافق. أيضا يمكن هذا الأسلوب بيوكونجوجاتي متزاوجة الببتيدات إلى جسيمات نانوية والأجسام المضادة الأخرى. وأخيراً، يصف لنا المقايسة خصائص و في المختبر الفيزيائية المستخدمة لتوصيف جسيمات نانوية بوليمر دهن بلكسا المستهدفة. ونحن نعتقد أن هذه الجسيمات النانوية بوليمر دهن بلكسا المستهدفة يمكن أن تشكل نظاما فعالاً للتنفيذ الهادف من المخدرات إلى أمراض السرطان معظم البشرية وتسليم الحمولات المستهدفة للمشيمة لعلاج الاضطرابات المشيمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد حلول الأسهم
- إعداد محلول مائي من الإيثانول 4% بإذابة 4 مل إيثانول المطلق مع 100 مل الماء عالي النقاوة. مخزن الحل عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم تعريف الماء عالي النقاوة كالماء دون الملوثات مثل البكتيريا، والجسيمات، وأيونات، أو نوكليسيس. تم الحصول على الماء عالي النقاوة من نظام لتنقية مياه مع مقاومة مستهدفة لتصل إلى 18.2 mΩ·cm، مما يعني انخفاض التلوث أنيونى. - إعداد 1 ملغ/مل فول الصويا الليسيثين الأسهم الحل بإذابة 20 ملغ ليستين فول الصويا في 20 مل محلول مائي من الإيثانول 4%. مخزن الحل الأسهم ليستين فول الصويا في 4 درجات مئوية.
- إعداد 25 ملغ/مل الحل الأسهم (2000)-COOH دسبي-شماعة بإذابة 100 مغ من دسبي-شماعة-COOH في 4 مل محلول مائي من الإيثانول 4%. مخزن الحل الأسهم عند-20 درجة مئوية.
- إعداد 10 ملغ/مل الحل دوكس الأسهم بإذابة 50 مغ دوكس في 5 مل الماء عالي النقاوة. تخزين الحل دوكس الأسهم عند 4 درجة مئوية في الظلام.
- إعداد 2 مغ/مل حل بلجا الأسهم بإذابة 20 ملغ بلجا في 10 مل من الاسيتو الانيتريل. تخزين حل بلجا الأسهم عند 4 درجة مئوية.
تنبيه: الاسيتو الانيتريل القابلة للاشتعال والسامة. تعمل مع الرعاية في غطاء دخان، وارتداء المعدات الشخصية المناسبة، مثل معاطف المعمل ونظارات السلامة وقفازات مطاط. - تحضير م 0.1 2-(morpholino) اثانيسولفونيك أسهم حمض (مس، pH 6.0) حل بتذويب ز 2.17 من مس في 100 مل الماء عالي النقاوة. مخزن الحل الأسهم عند 4 درجة مئوية.
2-تجميع دنبس
ملاحظة: لتجنب تدهور الضوئية دوكس، أجريت جميع العمليات في الظلام.
تم توليفها جسيمات نانوية التي سبق الإبلاغ عنها خطوة واحدة sonication أسلوب11،،من1314.
- أضف 3 مل محلول مائي من الإيثانول 4% إلى أنبوب الطرد مركزي معقم 10 مل. ثم إضافة 90 ميكروغرام من فول الصويا الليسيثين الحل الأسهم وميكروغرام 210 من الحل الأسهم دسبي-شماعة-COOH 750 ميكروغرام من الحل دوكس الأسهم إلى 3 مل محلول مائي من الإيثانول 4%.
- ضع الأنبوب الطرد المركزي في حمام الثلج، ومكان حمام الجليد على معالج بالموجات فوق الصوتية.
- مع حقنه 1 مل، "الماصة؛" 2 مغ الحل الأسهم بلجا dropwise (1 s قطره/4-6) في أنبوب الطرد المركزي. وفي الوقت نفسه، sonicate الأنبوبة باستخدام معالج بالموجات فوق الصوتية في تردد من 20 كيلو هرتز وسعه ناتج نسبة 30 في المائة لمدة 5 دقائق توليف في دنبس.
ملاحظة: لتوليف جزيئات موحدة مع أحجام صغيرة، السرعة الذي هو مقطر حل بلجا في الأنبوب يجب أن تكون بطيئة، وينبغي تجنب توليد فقاعة. - تنقية دنبس واسطة الغسيل الحل أعلاه في 0.1 م مس المخزن المؤقت (pH 6.0) 3 مرات باستخدام عامل تصفية جهاز الطرد مركزي (موكو، كاتشين 10). أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية و 1000 × ز لمدة 3 دقائق في كل مرة. وأخيراً، ينبغي أن يظل حوالي 1 مل من مس--حل جسيمات نانوية.
ملاحظة: هذا نقطة توقف مقبولة في الإجراءات. إذا لم يكن المستخدمة إلى متزاوجة الببتيدات، يمكن تنقيته جسيمات نانوية من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4)، ويمكن تخزين دنبس المنقاة في 4 درجات مئوية في الظلام.
3-تصريف الببتيدات إلى دنبس
-
تفعيل إستر
- إضافة 0.4 ملغ الصادرات (تركيز نهائي 2 مم) إلى 1 مل دنبس.
- إضافة 0.24 ملغ من المستشفيات العامة إلى رد فعل (تركيز نهائي 2 مم).
ملاحظة: لسهولة إضافة الكمية الصحيحة لتنمية الصادرات، والمستشفيات العامة، حل أسهم قد تكون مستعدة إذا حلت الكواشف واستخدامها على الفور. - خلط مكونات رد فعل جيدا، ووضع رد فعل على شاكر؛ السماح بالرد على 30 دقيقة-1 ح في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
-
رد أمين
- زيادة درجة الحموضة العازلة إلى 7.2-7.5 باستخدام برنامج تلفزيوني (20 ×، ودرجة الحموضة 7.4).
- إضافة 0.5 ملغ من استهداف بلكسا الببتيد (بلكسا-شركة بريتيش بتروليوم، ادفكدينفدتكيكفلاجكليفسفهيجكك) في حل رد فعل.
ملاحظة: قبل الإضافة، حل الببتيدات في الاسيتو الانيتريل 20%. إذا لم ديسولفابل الببتيدات، قد سونيكيشن في سونيكاتور حمام مفيدة. - مزيج الحل جيد، ومن ثم ضع على شاكر؛ السماح بأن رد الفعل على المضي قدما في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في الظلام.
- ضع الحل المتقارنة في أكياس الغسيل الكلوي (موكو، دا 3,500) دياليزي وتنقية بلكسا-دنبس استخدام المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) في درجة حرارة الغرفة 24 ساعة في الظلام.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، تنقية يمكن أداء كما في الخطوة 2، 4 للحصول على دنبس بلكسا. - بالنسبة لتطبيقات ثقافة الخلية، تصفية الحل أعيد تشكيلها من خلال عامل تصفية المحاقن معقمة 0.22 ميكرون لإزالة رواسب المحتملة.
4-توصيف دهن بلكسا المستهدفة-بوليمر جسيمات نانوية
-
قياس حجم نانوحبيبات هيدرودينامية استخدام تشتت الضوء الحيوي (DLS)
- جسيمات نانوية مخفف بالماء عالي النقاوة (تمييع 50-fold). تحميل 500 ميليلتر من العينة ومبومو وفقا لتعليمات الصك المحتمل DLS أو زيتا.
ملاحظة: إمكانية زيتا والترعة DLS يمكن أن تختلف استناداً إلى مواصفات هذا الصك. - بعد الانتهاء من القياس، تسجيل قطر الجسيمات ومؤشر بوليديسبيرسيتي (حزب النضال الديمقراطي الإندونيسي) وزيتا المحتملة. متوسط النتائج التي تم الحصول عليها من 4 تكرار القراءات، وحساب الانحراف المعياري.
- جسيمات نانوية مخفف بالماء عالي النقاوة (تمييع 50-fold). تحميل 500 ميليلتر من العينة ومبومو وفقا لتعليمات الصك المحتمل DLS أو زيتا.
-
مجهر إلكتروني (TEM)
ملاحظة: لوحظ تيم مورفولوجية جسيمات نانوية بطريقة سلبية وصمة عار. 24- جسيمات نانوية مخفف بالماء عالي النقاوة (تمييع 400-fold). إضافة 20 ميليلتر من العينة على شبكة تيم، والسماح للجلوس لمدة 5 دقائق.
- إضافة 100 ميليلتر من حمض فوسفوتونجستيك 2% (w/v) والسماح للجلوس للحد الأدنى 2 الفتيل بعيداً الحبرية.
- الجاف للشبكة تيم في درجة حرارة الغرفة.
- تعيين الجهد تسارع ال 80 كيلو فولت، وتكبير الصورة إلى × 100,000 لتصور جسيمات نانوية.
-
تحديد كفاءة التغليف (هة) ولو
- إنشاء المنحنى المعياري. حل دوكس في الماء عالي النقاوة لإعداد حلول دوكس خمسة تركيزات مختلفة: 1 ميكروغرام/مل، 5 ميكروغرام/مل، 10 ميكروغرام/مل، 50 ميكروغرام/مل و 100 ميكروغرام/مل. قياس امتصاص الحلول دوكس في 480 نانومتر مع مطياف الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة. إنشاء منحنى قياسي استناداً إلى التركيزات دوكس.
- تمييع 25 ميليلتر من جسيمات نانوية مع 500 ميليلتر من الماء عالي النقاوة. قياس الامتصاص في 480 نانومتر مع مطياف الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة. حساب تركيزات المخدرات بواسطة المنحنى القياسي.
- حساب LE استخدام المعادلة التالية:
جنيه = ((كمية من المخدرات في جسيمات نانوية)/(إجمالي وزن المواد)) × 100%. - حساب هة استخدام المعادلة التالية:
EE = ((كمية من المخدرات في جسيمات نانوية) (يضاف كمية من المخدرات)) × 100%.
-
قياس كفاءة التصريف باستخدام المقايسة (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك 25 , 26 , 27
- "الماصة؛" 25 ميليلتر من حلول الببتيد القياسية (الجدول 1) أو بلكسا-دنبس في آبار الميكروسكوبية في مكررة. إضافة 200 ميليلتر من الكاشف العامل لكل بئر، ومزيج لوحة جيدا على شاكر طبق لمدة 30 ثانية.
- تغطية اللوحة، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- قياس امتصاص في 562 نانومتر على قارئ لوحة. استخدام المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه لحساب تركيزات بلكسا دنبس بلكسا.
- حساب كفاءة التصريف باستخدام المعادلة التالية:
كفاءة التصريف = ((المبلغ من الببتيد في جسيمات نانوية) (يضاف مبلغ الببتيد)) × 100%.
| فيال | حجم مخفف (ميكروليتر) | الحجم والمصدر من الببتيد (ميكروليتر) | التركيز النهائي الببتيد (ميكروغرام/مل) |
| A | 0 | 300 للأسهم | 1000 |
| ب | 250 | 250 قنينة إضعاف | 500 |
| ج | 250 | 250 لتمييع القنينة ب | 250 |
| د | 250 | 250 من قنينة C تمييع | 125 |
| ه | 300 | 200 لتمييع قنينة د | 50 |
| و | 250 | 250 لتمييع فيال ه | 25 |
| ز | 400 | 100 تمييع القنينة و | 5 |
| ح | 500 | 0 | 0 |
الجدول 1. إعداد الببتيدات القياسية
5-الأسفار مجهرية تقييم امتصاص نانوحبيبات بلكسا المستهدفة في الخلايا تشوريوكارسينوما (JEG3)
- بذور الخلايا على لوحات 12-جيدا العقيمة في 1.0 × 104 خلايا/جيدا مع كامل DMEM/F12 (كدميم/F12، التي تحتوي على 1% البنسلين/ستربتوميسين و 10% الجنيني البقري المصل (FBS)). السماح للخلايا أن تنمو إلى التقاء 60% في 37 درجة مئوية و 5% CO2 تحت الظروف الرطبة.
- قم بإزالة الوسائط، وإضافة 1 مل الإعلام الطازجة الباردة مع محتوى مصل منخفضة (5% FBS) ودنبس أو بلكسا-دنبس (5 ميكروغرام من مكافئ دوكس).
- احتضان الخليط من الخلايا، وجسيمات نانوية في 4 درجات مئوية عن ح 1.
- وبعد الحضانة، قم بإزالة الوسائط وتغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. ثم أضف 1 مل من جديد كدميم/F12، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إزالة كدميم/F12، وتغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة 2 مل من البرد 4% بارافورمالدهيد (منهاج عمل بيجين)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة إصلاح الخلايا.
- إزالة منهاج عمل بيجين. تغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني مرة واحدة. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني يتضمن DAPI (1 ميكروغرام/مل) لنواة تلطيخ، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- نضح في برنامج تلفزيوني، وتغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة المتوسطة المتصاعدة، والصورة الأسفار مع مجهرية الأسفار، باستخدام قنوات الأخضر والأزرق لتصور دوكس ونوى، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا البروتوكول، تعتبر بلجا، دسبي-شماعة-COOH، وفول الصويا الليسيثين البوليمر الممثل، المتقارن الدهن-شماعة-COOH والدهن، على التوالي. ويتضح تركيب جسيمات نانوية بوليمر دهن بلكسا المستهدفة عن طريق خطوة واحدة أسلوب sonication وأسلوب تنمية الصادرات/دائرة الصحة الوطنية في الشكل 1. أولاً، في ظل الظروف سونيكيشن، منظم ليستين فول الصويا، بلجا ودسب-شماعة-COOH تجميع ذاتي للنموذج الأساسي-شل دنبس. نواة تتكون من بلجا ومغلفة دوكس، shell يتكون من دسب-شماعة-COOH، ويقع أحادي الطبقة ليستين فول الصويا في واجهة shell والأساسية. ثم، المجموعات-COOH مكشوف على سطح التثقيف كانت مترافق مع المجموعات2 -NH من الببتيد عبر تقنية تنمية الصادرات/المستشفيات العامة توليف دنبس بلكسا.
دنبس أعد في هذا البروتوكول نانومتر ± 4.7 82.3 في القطر، وبعد التصريف إلى بلكسا-بي بي، زيادة قطر دنبس الأولية إلى 109.3 ± 5.9 نانومتر (الشكل 2). وكان حزب النضال الديمقراطي الإندونيسي دنبس ودنبس بلكسا 0.127±0.005 و ± 0.134 0.065، على التوالي. وقد أظهرت الصور تيم دنبس ودنبس بلكسا أيضا أن الجسيمات قد توزعت جيدا وعموما كان مورفولوجيس كروية (الشكل 3). كان احتمال زيتا دنبس ودنبس بلكسا-20.1 ± 1.32 mV و-29.9 ± 3.56 بالسيارات، على التوالي (الجدول 2). ومن ثم فهذه الجسيمات النانوية يتوقع أن تكون مستقرة جداً.
| جسيمات نانوية | Diameter(nm) | حزب النضال الديمقراطي الإندونيسي | زيتا المحتملة (mV) |
| دنبس | 82.3±4.7 | 0.127±0.005 | --20.1±1.32 |
| دنبس بلكسا | 109.3±5.9 | 0.134±0.065 | --29.9±3.56 |
| مؤشر PDI:polydispersity. وترد البيانات يعني ± التنمية المستدامة (n = 3). | |||
الجدول 2. توصيف جسيمات نانوية
هة ولو من جسيمات نانوية مهمان للتطبيقات السريرية. EE دوكس دنبس ودنبس بلكسا كان 40.3 ± 1.67% و 39.5 ± 1.94 في المائة، على التوالي. جنيه دوكس دنبس ودنبس بلكسا كان 6.2 ± 0.74% و 0.42 ± 5، 1%، على التوالي. وأظهرت هذه البيانات هو الحفاظ على مدى تحميل المخدرات وتغليف المخدرات بعد الديكور بلكسا-بي بي. وكان تحديد فعالية الديكور بلكسا-بي بي على سطح دنبس بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي (الشكل 4). تم العثور على كفاءة تصريف بلكسا-بي بي أن 45.5 ± 3.7 في المائة.
مقايسة الامتصاص الخلوي JEG3 أشارت إلى أن بلكسا-دنبس ملتزمة بسرعة JEG3 الخلايا داخل 30 دقيقة (الشكل 5). ولذلك، كانت كفاءة مترافق بلكسا-بي بي إلى السطح التثقيف في هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، يمكن أن بلكسا-بي بي سرعة ربط الخلايا JEG3 وزيادة على الإقبال جسيمات نانوية الهاتف الخلوي.
رقم 1. التوضيح التخطيطي للطريقة المستخدمة لتوليف جسيمات نانوية بوليمر الدهون المستهدفة بلكسا. أولاً، قد استخدمت طريقة sonication خطوة واحدة توليف دهن البوليمر جسيمات نانوية (DNPs)، وثم استخدمت تقنية تنمية الصادرات/دائرة الصحة الوطنية متزاوجة الببتيدات إلى السطوح نانوحبيبات (بلكسا-دنبس). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. حجم التوزيع من جسيمات نانوية مختلفة. الحجم الهيدروديناميكي دنبس (A) وبلكسا-دنبس (ب) تقاس بدائرة الأراضي والمساحة. يتم عرض الأرقام التمثيلية لإثبات حجم الجسيمات وحجم التوزيع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. مورفولوجيا نانوحبيبات تتميز بال- صورة تيم نموذجي دنبس (A) وبلكسا-دنبس (ب) لاحظ مع 2% حمض فوسفوتونجستيك تلطيخ. شريط المقياس = 100 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. قياس كفاءة التصريف باستخدام مقايسة اتفاق التعاون الأساسي. المنحنى المعياري من الببتيدات في 562 شمال البحر الأبيض المتوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5. نانوحبيبات امتصاص الخلايا JEG3- تم تحليل خلايا JEG3 بالفحص المجهري الأسفار بعد 30 دقيقة من الحضانة مع 5 ميكروغرام/مل جسيمات نانوية مختلفة. الأحمر: دوكس، الأزرق: أنوية المسمى DAPI. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول يوفر طريقة فعالة واستنساخه لتوليف بوليمر دهن بلكسا-بي بي-مترافق جسيمات نانوية. الأسلوب سونيكيشن خطوة واحدة لإعداد جسيمات نانوية دهن البوليمر سريعة واستنساخه وتختلف أساليب نانوبريسيبيتيشن النموذجية التي تشمل التدفئة أو فورتيكسينج أو التبخر. ومن ثم، الأسلوب المتقدمة يقلل كثيرا من الوقت التوليف. وبالإضافة إلى ذلك، بيوكونجوجاتي الصادرات/دائرة الصحة الوطنية المستخدمة في هذا البروتوكول تقنية شائعة المستخدمة ومريحة متزاوجة الببتيدات والأجسام المضادة للجسيمات النانوية. ولذلك، المزيج من الأسلوب سونيكيشن خطوة واحدة مع تقنية بيوكونجوجاتي تنمية الصادرات/المستشفيات العامة توليف بوليمر الدهن استهداف بلكسا جسيمات نانوية يمكن زيادتها للتطبيقات السريرية.
بعض الإجراءات الحاسمة لتوليف بنجاح وتميز دنبس بلكسا. أولاً، تحديد تركيزات النسبية من الليسيثين، بلجا ودسبي-شماعة-COOH حجم نانوحبيبات بوليمر الدهن و polydispersity. عندما تركز ليستين ثابتة، وجود تركيز أعلى من نتائج دسب-شماعة-COOH في بوليديسبيرسيتي أقل وحجم أصغر نانوحبيبات،13،15 مما وبالتالي يقلل من المخدرات LE. عندما يتم إصلاح تركيز بلجا، يتم استبدال أكثر دسب-شماعة-COOH الليسيثين، مما أدى إلى ارتفاع نانوحبيبات polydispersity ونانوحبيبات أكبر حجم15. في هذه الحالة، يتم جسيمات نانوية غير مستقرة وتجميع أكثر سهولة. في هذا البروتوكول، وهو نسبة وزن دسب-شماعة-COOH/بلجا 0.11، ونسبة كتلة ليستين/دسب-شماعة-COOH 0.43. هو حجم نانوحبيبات بوليمر الدهن حوالي 82 شمال البحر الأبيض المتوسط مع PDI من 0.127 تقريبا.
وثانيا، الرقم الهيدروجيني للحل أثناء تصريف الببتيدات إلى جسيمات نانوية أهمية قصوى. الرقم الهيدروجيني الأمثل لتفعيل إستر 5.0-6.0، ورد فعل أمين الأكثر كفاءة في الرقم الهيدروجيني 7.2-7.519،،من2829. للحصول على أفضل النتائج، ينبغي القيام برد فعل على خطوتين. أولاً، يحدث التنشيط إستر في مس (أو آخر نونكاربوكسيلاتي، نوناميني المخزن المؤقت) على درجة الحموضة 5.0-6.0. ثم، يتم تعديل درجة الحموضة إلى 7.2-7.5 باستخدام برنامج تلفزيوني (أو آخر نوناميني العازلة) مباشرة قبل التفاعل مع جزيء المحتوية على أمين19. وبالنظر إلى أن نصف عمر استرات الصحي ح 4-5 على درجة الحموضة 7.019، يتجاوز مدة رد فعل أمين ح 10 في 4 درجات مئوية.
العامل الحاسم النهائي امتصاص نانوحبيبات. ألغى نونتارجيتيد امتصاص دنبس بالخلايا JGE3 في تحليل وظيفة لاستيعاب المستهدفة بضبط الوقت الثقافة ودرجة الحرارة وتركيز FBS في الأجلين المتوسط و. في هذا البروتوكول، كانت المحتضنة الخلايا JEG3 مع 5% FBS في 4 درجات مئوية ل 1 ح، ومثقف ثم في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتقليل امتصاص الخلوية إدارة التخطيط الوطني.
إذا كانت قضايا تنشأ أثناء الإجراء، هناك ثلاث خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الرئيسية المتصلة بعملية التوليف وتوصيف دنبس بلكسا. أولاً، وأعد بوليمر الدهن جسيمات نانوية التجميع الذاتي بلجا والليسيثين تحت ظروف sonication. فقط بلجا يذوب في المذيبات العضوية. ومن ثم فعلية بالإضافة إلى مذيب ماء، بلجا رواسب بسرعة إلى جسيمات نانوية الصغيرة. لتقليل تأثير عن سرعة إضافة دروبويسي وتجنب توليد الجسيمات الأكبر حجماً، سونيكيشن المخلوط لمدة 1-2 دقيقة قبل إضافة بلجا ضروري. ثانيا، على الرغم من أن التحليل الكمي لكفاءة تصريف بلكسا-بي بي باستخدام الأسلوب اتفاق التعاون الأساسي سريعة ومريحة، مقايسة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) أكثر دقة. تفاصيل التجريبية [هبلك] قد وصف لنا المجموعة11 وآخرون30،،من3132. أخيرا، قد تختلف الظروف المثلى لامتصاص بلكسا-التثقيف الخلوية للخلايا السرطانية الأخرى. انخفاض تركيز FBS تدريجيا وزيادة وقت الحضانة عند 37 درجة مئوية قد تساعد على تحديد أفضل الظروف.
واحد الحد من البروتوكول أن يحدد hydrophobicity للمخدرات هة العقاقير. بالمقارنة مع العقاقير ماء، مسعور المخدرات لها صلة أقوى بلجا، مما يؤدي المخدرات زيادة هة. وفي هذه الحالات، سيتعين الإجراءات المتعلقة تخليق جسيمات نانوية بوليمر الدهون المستهدفة بلكسا دراستها تجريبيا لتحديد طريقة التوليف الأكثر فعالية التي ينتج المخدرات مثالية جنيه وهة.
كما ذكر أعلاه، هو على وجه التحديد عن بلكسا glycosaminoglycan معظم الخلايا السرطانية والمشيمة تروفوبلاستس. ومن ثم فمن المهم أن نلاحظ أنه ينبغي استخدام بلكسا-NPs للتنفيذ الهادف للتداوي للخلايا السرطانية في البشر والحيوانات نونبريجنانت فقط، وأن هذه الجسيمات محملة بالمخدرات يؤدي إلى آثار جانبية في المشيمة الحيوانات الحوامل و البشر.
وباختصار، لقد قمنا بوصف طريقة بسيطة وملائمة توليف بوليمر الدهون المستهدفة بلكسا جسيمات نانوية. أهمية هذا البروتوكول أنه يزيد توافر المخدرات في الأورام والمشيمة، مع تقليل سمية المصاحبة. هذا النهج ينبغي أن يكون مفيداً لإيصال الأدوية المستهدفة للأورام والمشيمة، وقد يكون الارتقاء بإعداد جسيمات نانوية بوليمر دهن بلكسا المستهدفة للتطبيقات السريرية في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X.F. و B.Z. من المخترعين في البراءات PCT/CN2017/108646 و 201710906587.6 المقدمة من سيت الذي يغطي أسلوب التوليف نانوحبيبات بلكسا المستهدفة وتطبيق. تم الكشف عن لا تضارب محتمل في المصالح مؤلفين آخرين.
Acknowledgments
أيد منح هذا العمل من البحوث الرئيسية الوطنية وبرنامج التنمية في الصين (2016YFC1000402) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية (81571445 و 81771617) ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ (2016A030313178) إلى X.F. وصندوق البحوث الأساسية شنتشن (JCYJ20170413165233512) إلى X.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid--polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Cancer Research. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Biochemistry. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
