Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese de sulfato de condroitina placentária A peptídeo de vinculação (plCSA-BP)-conjugados lipid-polímero nanopartículas através de etapa única sonication e bioconjugate técnicas. Estas partículas constituem uma nova ferramenta para a entrega de alvo da terapêutica de tumores mais humanos e trophoblasts da placenta para tratar cancros e anormalidades da placenta.
Abstract
Um método terapêutico eficaz câncer reduz e elimina tumores com mínima toxicidade sistêmica. Nanopartículas ativamente direcionamento oferecem uma abordagem promissora para a terapia do câncer. O sulfato de condroitina placentária glicosaminoglicano um (plCSA) é expressa em uma ampla gama de células cancerosas e trophoblasts da placenta e proteína da malária que var2csa especificamente pode ligar para plCSA. Um peptídeo de sulfato de condroitina placentária relatado A ligação (plCSA-BP), derivado da malária proteína VAR2CSA, especificamente também pode ligar para plCSA em células cancerosas e trophoblasts placentárias. Daí, nanopartículas plCSA-BP-conjugado podem ser usadas como uma ferramenta para entrega de drogas específicas para cânceres humanos e trophoblasts placentárias. Neste protocolo, descrevemos um método para sintetizar lipídios plCSA-BP-conjugados-polímero nanopartículas carregadas com doxorrubicina (plCSA-DNPs); o método consiste em um único sonication passo e bioconjugate técnicas. Além disso, vários métodos para caracterizar plCSA-DNPs, incluindo a determinação de suas propriedades físico-químicas e celular captação pelas células da placenta Coriocarcinoma (JEG3), são descritos.
Introduction
Um método terapêutico eficaz câncer reduz e elimina tumores com mínima toxicidade sistêmica. Daí, tumor seletivo segmentação é a chave para explorar métodos terapêuticos bem sucedidos. Nanopartículas para oferecer uma oportunidade promissora para a terapia do câncer, e moleculares assemblies com diferentes grupos funcionais irão melhorar a eficácia da droga e reduzir os efeitos colaterais associados1,2. Além disso, os sistemas de nanopartículas principalmente utilizam passiva e ativa como alvo para atingir o alvo tumores3.
Segmentação passiva explora as características inatas de nanopartículas e permeabilidade reforçada e efeitos de retenção (EPR) para alcançar as células do tumor. Os lipossomas catiônicos têm sido utilizados com sucesso para entregar várias drogas anticâncer para tumores em aplicações clínicas4,5,6. Apesar do potencial efeito terapêutico eficaz do cancro, uma concentração baixa de drogas na região de tumor e uma incapacidade de distinguir as células do tumor de tecidos normais são duas limitações principais de nanopartículas de direcionamento de passivo-7.
Estratégias de segmentação ativas aproveitam do antígeno-anticorpo, ligante-receptor e outras interações de reconhecimento molecular para entregar drogas especificamente tumores8. O sulfato de condroitina placentária glicosaminoglicano um (plCSA) é amplamente expresso na maioria das células cancerosas e trophoblasts placentárias. Além disso, a proteína da malária VAR2CSA especificamente pode ligar para plCSA9,10. Portanto, o VAR2CSA pode ser uma ferramenta para o direcionamento de células cancerosas humanas. No entanto, quando VAR2CSA é conjugada com nanopartículas, a proteína completo pode limitar a penetração de nanopartículas em células tumorais. Recentemente, descobrimos um peptídeo de vinculação de plCSA (plCSA-BP), derivado da proteína da malária VAR2CSA. nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-BP-conjugados rapidamente ligado a células de Coriocarcinoma e doxorrubicina significativamente aumentada (DOX) atividade anticancerígena em vivo11; Estas partículas também especificamente ligados a trophoblasts da placenta e podem servir como uma ferramenta para a entrega de alvo de drogas para a placenta12.
Nanopartículas de lipídios-polímero consistem em um escudo de monocamada lipídico e um núcleo de polímero hidrofóbico e representam uma nova transportadora para a entrega da droga. Essas nanopartículas combinam as vantagens de lipossomas e nanocarriers poliméricos, tais como tamanho controlável de nanopartículas, alta biocompatibilidade, liberação de drogas sustentado, eficiência de carregamento de droga alta (LE) e excelente estabilidade13. Neste trabalho, usamos um método passo a passo sonication para sintetizar lipídios-polímero nanopartículas. Este método é rápido, conveniente e apropriado para aumentar e tem sido amplamente utilizado para preparar as nanopartículas de lipídios-polímero do nosso grupo11,14 e outros15,16,17,18 .
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) cloridrato de carbodiimida (EDC) é uma popular carbodiimida usada como um agente de reticulação para conjugar biomoléculas contendo aminas e carboxilatos19. Além de EDC, N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) é o reagente de conjugação mais comum na superfície e nanopartículas conjugação reações20,21. NHS pode reduzir o número de reações colaterais e melhorar a estabilidade e o rendimento do éster intermediários22,23.
Aqui, descrevemos um protocolo para a síntese de nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-alvo. Primeiro, a síntese de etapa única sonication de nanopartículas de lipídios-polímero DOX-carregado (DNPs) é descrita. Então, uma técnica de bioconjugate EDC/NHS para a geração de nanopartículas de lipídios plCSA-BP-conjugados-polímero é introduzida. Esta técnica de bioconjugate também pode ser usada para conjugar outros anticorpos e peptídeos de nanopartículas. Finalmente, descrevemos o ensaio físico-químico de propriedades e in vitro usado para caracterizar as nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-alvo. Acreditamos que essas nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-alvo poderiam constituir um sistema eficaz para a entrega de alvo de drogas para cânceres mais humanos e a alvo entrega de cargas para a placenta para tratar anormalidades da placenta.
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Protocol
1. preparação das soluções estoque
- Prepare uma solução aquosa de etanol a 4% diluindo com 100 mL de água ultrapura, 4 mL de etanol absoluto. Armazenar a solução a 4 ° C.
Nota: Água ultrapura é definida como a água sem contaminantes, como bactérias, partículas, íons ou nucleases. Água ultrapura foi Obtida de um sistema de purificação de água com uma resistividade de alvo de até 18,2 mΩ·cm, que significa baixa contaminação aniônica. - Prepare um 1 mg/mL solução de lecitina de soja, dissolvendo-se 20 mg de lecitina de soja em 20 mL de solução aquosa de etanol a 4%. Armazenar a solução estoque da lecitina de soja a 4 ° C.
- Prepare um 25 mg/mL solução DSPE-PEG (2000)-COOH dissolvendo-se 100 mg de DSPE-PEG-COOH em 4 mL de solução aquosa de etanol a 4%. Armazenar a solução estoque a-20 ° C.
- Prepare um 10 mg/mL solução stock de DOX, dissolvendo-se 50 mg de DOX em 5 mL de água ultrapura. Armazene a solução estoque DOX a 4 ° C no escuro.
- Prepare um 2 mg/mL solução stock de PLGA, dissolvendo-se 20 mg de PLGA em 10 mL de acetonitrila. Armazenar a solução estoque de PLGA a 4 ° C.
Cuidado: Acetonitrilo é inflamável e tóxico. Operar com cuidado em uma coifa e usar o equipamento pessoal, tais como aventais, óculos de segurança e luvas de látex. - Prepare uma solução stock ácido (MES, pH 6.0) de etanesulfónico 0,1 M 2-(morpholino) dissolvendo 2,17 g do MES em 100 mL de água ultrapura. Armazenar a solução a 4 ° C.
2. síntese das DNPs
Nota: Para evitar degradação fotoquímica de DOX, todas as operações foram realizadas no escuro.
Nanopartículas foram sintetizadas por um relatado anteriormente etapa única sonication método11,13,14.
- Adicione 3 mL de solução aquosa de etanol a 4% para um tubo de centrifuga estéril 10 mL. Em seguida, adicione 90 µ g da solução-mãe lecitina de soja, 210 µ g da solução DSPE-PEG-COOH e 750 µ g da solução DOX para 3 mL de solução aquosa de etanol a 4%.
- Coloque o tubo de centrifugação em um banho de gelo e coloque o banho de gelo em um processador ultra-sônico.
- Com uma seringa de 1 mL, pipete 2 mg de PLGA solução-mãe gota a gota (1 gota/4-6 s) no tubo de centrífuga. Enquanto isso, proceda à sonicação do tubo usando um processador ultra-sônico em uma frequência de 20 kHz e uma amplitude de saída de 30% por 5 min para sintetizar os DNPs.
Nota: Para sintetizar partículas uniformes com tamanhos pequenos, a velocidade na qual a solução PLGA é gotejada no tubo precisa ser lento, e geração de bolha deve ser evitada. - Purificar os DNPs lavando a solução acima no buffer MES de 0,1 M (pH 6,0) 3 vezes usando um filtro de centrífuga (MWCO, 10 kDa). Centrifugar a 4 ° C e 1000 × g por 3 min cada tempo. Finalmente, aproximadamente 1 mL de nanopartículas MES-resolvido deve permanecer.
Nota: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento. Se não costumava conjugado peptídeos, as nanopartículas podem ser purificadas por tampão PBS (pH 7,4) e os DNPs purificados podem ser armazenados a 4° C, no escuro.
3. conjugação de peptídeos para DNPs
-
Ativação de éster
- Adicionar 0,4 mg de EDC (concentração final 2 mM) a 1 mL de DNPs.
- Adicionar 0,24 mg de NHS para a reação (concentração final de 2 milímetros).
Nota: Para fácil adição da quantidade correta de EDC e NHS, uma solução pode ser preparar os reagentes são dissolvidos e usados imediatamente. - Misturar os componentes de reação bem e colocar a reação num agitador; permita a reação por 30 min - 1 h à temperatura ambiente no escuro.
-
Reação de amina
- Aumentar o tampão pH 7,2-7,5 usando PBS (20 ×, pH 7,4).
- Adicione 0,5 mg de plCSA-direcionamento peptide (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) para a solução de reação.
Nota: Antes de adição, dissolva os peptídeos em 20% acetonitrila. Se não solúvel, peptídeos sonication em um sonicador de banho pode útil. - Misture a solução bem e coloque em uma coqueteleira; permitir que a reação proceder a 4 ° C durante a noite, no escuro.
- Coloque a solução de conjugado em sacos de diálise (MWCO, 3.500 Da) para urinar e purificar os DNPs-plCSA usando o tampão PBS (pH 7,4) à temperatura ambiente por 24 h no escuro.
Nota: Como alternativa, purificação pode ser executada como na etapa 2.4 para obter plCSA-DNPs. - Para aplicações de cultura de células, filtre a solução reconstituída através de um filtro de 0,22 µm seringa estéril para remover potenciais precipitados.
4. caracterização de lipídios plCSA-alvo-nanopartículas de polímero
-
Medição do tamanho hidrodinâmico de nanopartículas usando Difusão dinâmica da luz (DLS)
- Nanopartículas diluídas com água ultrapura (50-fold diluição). Carrega 500 µ l da amostra em uma cubeta de acordo com as instruções do instrumento potencial DLS ou zeta.
Nota: Potencial Zeta e cubetas DLS podem diferir com base nas especificações do instrumento. - Depois de concluída a medição, grave o diâmetro das partículas, índice de polidispersividade (PDI) e potencial zeta. Média dos resultados obtidos de 4 repetidas leituras e calcular o desvio padrão.
- Nanopartículas diluídas com água ultrapura (50-fold diluição). Carrega 500 µ l da amostra em uma cubeta de acordo com as instruções do instrumento potencial DLS ou zeta.
-
Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
Nota: A morfologia das nanopartículas foi observada pela TEM com o método da mancha negativa. 24- Nanopartículas diluídas com água ultrapura (400-fold diluição). Adicionar 20 µ l da amostra para um grid TEM e deixe para descansar por 5 min.
- Adicione 100 µ l de ácido fosfotúngstico a 2% (p/v) e deixe para descansar por 2 min. pavio fora da gota.
- Seque a grade TEM a temperatura de quarto.
- Definir a tensão de aceleração TEM 80 kV e ampliar a imagem para 100.000 × Visualizar as nanopartículas.
-
Determinação da eficiência de encapsulação (EE) e LE
- Geração da curva padrão. Dissolver a DOX em água ultrapura para preparar soluções DOX de cinco diferentes concentrações: 1 µ g/mL, 5 µ g/mL, 10 µ g/mL, 50 µ g/mL e 100 µ g/mL. Medir a absorção das soluções DOX em 480 nm com um espectrómetro de UV-VIS. Gere uma curva padrão baseada-se as concentrações de DOX.
- Dilua 25 µ l de nanopartículas com 500 µ l de água ultrapura. Medir a absorção no 480 nm com um espectrómetro de UV-VIS. Calcule as concentrações de droga pela curva padrão.
- Calcule o LE usando a seguinte equação:
LE = ((quantidade de drogas em nanopartículas) / (peso total dos materiais)) × 100%. - Calcule o EE usando a seguinte equação:
EE = ((quantidade de drogas em nanopartículas) / (quantidade de adicionado droga)) × 100%.
-
Medição da eficiência conjugação usando o bicinchoninic ácido (BCA) ensaio 25 , 26 , 27
- Pipete 25 µ l de soluções padrão de peptídeo (tabela 1) ou plCSA-DNPs em poços da microplaca em duplicado. Adicionar 200 µ l de reagente de trabalho para cada poço e misture a placa bem em um agitador de placa por 30 s.
- Cobrir a placa e incubar a 37 ° C por 30 min.
- Medir a absorvância a 562 nm em um leitor de placa. Use a curva padrão gerada para calcular as concentrações de plCSA de plCSA-DNPs.
- Calcule a eficiência de conjugação usando a seguinte equação:
Eficiência de conjugação = ((quantidade de peptídeo em nanopartículas) / (quantidade de adicionado do peptide)) × 100%.
| Tubo de ensaio | Volume de diluente (μL) | Volume e fonte de peptídeo (μL) | Concentração final do peptide (μg/mL) |
| A | 0 | 300 de estoque | 1000 |
| B | 250 | 250 do frasco uma diluição | 500 |
| C | 250 | 250 de diluição do frasco B | 250 |
| D | 250 | 250 de diluição frasco C | 125 |
| E | 300 | 200 de diluição frasco D | 50 |
| F | 250 | 250 de diluição do frasco E | 25 |
| G | 400 | 100 de diluição do frasco F | 5 |
| H | 500 | 0 | 0 |
Tabela 1. Preparação de peptídeos padrão
5. avaliação de microscopia de fluorescência de plCSA-alvo absorção de nanopartículas nas células Coriocarcinoma (JEG3)
- Semente de células em placas de 12 poços estéril em 1,0 × 104 células/poço com DMEM/F12 completa (cDMEM/F12, contendo 1% penicilina/estreptomicina e 10% fetal de soro bovino (FBS)). Permitir que as células a crescer a confluência de 60% a 37 ° C e 5% CO2 sob condições úmidas.
- Remova a mídia e adicionar 1 mL de mídia fresca fria com um teor baixo de soro (5% FBS) e DNPs ou plCSA-DNPs (5 µ g de equivalentes DOX).
- Incube a mistura de células e nanopartículas a 4 ° C, durante 1 h.
- Após a incubação, remova a mídia e lavar as células três vezes com PBS. Em seguida, adicione 1 mL de cDMEM fresco/F12 e incube as celulas a 37 ° C por 30 min.
- Retire a cDMEM/F12 e lave as células três vezes com PBS.
- Adicionar 2 mL de frio paraformaldeído 4% (PFA) e incubar a temperatura ambiente por 15 min consertar as células.
- Remova o PFA. As células com 2 mL de PBS lave uma vez. Adicionar 1 mL de PBS contendo DAPI (1 µ g/mL) para núcleos de coloração e incubar a temperatura ambiente por 10 min.
- Aspirar a PBS e lavar as células três vezes com PBS.
- Adicionar o meio de montagem e imagem a fluorescência com uma microscopia de fluorescência, utilizando canais verdes e azul para visualizar o DOX e núcleos, respectivamente.
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Representative Results
Neste protocolo, lecitina de soja, DSPE-PEG-COOH e PLGA são um polímero representativo, lipid-PEG-COOH conjugado e lipídios, respectivamente. A síntese de nanopartículas de lipid-polímero plCSA-alvo através de uma única etapa sonication método e uma técnica EDC/NHS é ilustrada na Figura 1. Primeiro, em condições de sonication, lecitina de soja, PLGA e DSPE-PEG-COOH auto-montagem para shell-núcleo de forma estruturada DNPs. O núcleo consiste de PLGA e DOX encapsulado, o shell é composto por DSPE-PEG-COOH e a monocamada de lecitina de soja situa-se na interface de shell e o núcleo. Em seguida, os grupos - COOH expostos na superfície de DNP foram conjugados com os grupos de2 -NH da peptídeo através da técnica EDC/NHS para sintetizar plCSA-DNPs.
Os DNPs preparados neste protocolo foram 82.3 ± 4,7 nm de diâmetro, e após a conjugação de plCSA-BP, o diâmetro dos DNPs primárias aumentou para 109,3 ± 5,9 nm (Figura 2). O PDI do DNPs e plCSA-DNPs foi 0.127±0.005 e 0.134 ± 0.065, respectivamente. Imagens de temperatura do DNPs e plCSA-DNPs também mostraram que partículas eram bem dispersos e geralmente tinham morfologias esféricas (Figura 3). O potencial zeta do DNPs e plCSA-DNPs foi de-20.1 ± 1,32 mV e-29.9 ± 3,56 mV, respectivamente (tabela 2). Portanto, essas nanopartículas são previstas para ser altamente estável.
| Nanopartículas | Diameter(nm) | PDI | Zeta potencial (mV) |
| DNPs | 82.3±4.7 | 0.127±0.005 | -20.1±1.32 |
| plCSA-DNPs | 109.3±5.9 | 0.134±0.065 | -29.9±3.56 |
| Índice de PDI:polydispersity. Os dados são apresentados a média ± SD (n = 3). | |||
Tabela 2. Caracterização de nanopartículas
A EE e LE de nanopartículas são importantes para aplicações clínicas. A EE de DOX pelo DNPs e plCSA-DNPs foi 40,3 ± 1,67% e 39,5 ± 1,94%, respectivamente. O LE da DOX no DNPs e plCSA-DNPs foi 6,2 ± 0,74% e 5,1 ± 0,42%, respectivamente. Estes dados mostraram que a extensão do carregamento de droga e encapsulamento de drogas foi mantida após a decoração plCSA-BP. A eficiência de decoração de plCSA-BP na superfície do DNPs foi determinada pelo ensaio de BCA (Figura 4). A eficiência de conjugação de plCSA-BP foi encontrada para ser 45,5 ± 3,7%.
O ensaio de absorção celular de JEG3 indicou que o plCSA-DNPs rapidamente acoplado a JEG3 células dentro de 30 min (Figura 5). Portanto, plCSA-BP foi eficientemente conjugado à superfície DNP no presente protocolo. Além disso, plCSA-BP rapidamente poderia vincular a JEG3 células e aumentar a absorção celular das nanopartículas.
Figura 1. Ilustração esquemática do método usado para sintetizar lipídios-polímero plCSA-alvo nanopartículas. Primeiro, um único passo sonication método foi usado para sintetizar lipídios-polímero nanopartículas (DNPs), e em seguida a técnica EDC/NHS foi usada para conjugar peptídeos para as superfícies de nanopartículas (plCSA-DNPs). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Distribuição das nanopartículas diferentes de tamanho. Tamanho hidrodinâmico do DNPs (A) e (B) medidos pelo DLS plCSA-DNPs. Números representativos são apresentados para demonstrar o tamanho de partícula e distribuição de tamanho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Morfologia de nanopartículas, caracterizada pela TEM. Imagem de temperatura típica do DNPs (A) e (B) observadas com coloração ácido fosfotúngstico de 2% plCSA-DNPs. Barra de escala = 100 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Medição da eficiência conjugação usando o ensaio BCA. Curva padrão dos peptides no 562 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Nanopartículas de absorção pelas células de JEG3. JEG3 células foram analisadas por microscopia de fluorescência após 30 min de incubação com nanopartículas diferentes de 5 µ g/mL. Vermelho: DOX, azul: núcleos de DAPI-rotulados. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo fornece um método eficiente e reproduzível para a síntese de nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-BP-conjugados. O método passo a passo sonication para preparar nanopartículas de lipídios-polímero é rápido, reprodutível e diferente do típico nanoprecipitation métodos que envolvem o aquecimento, evaporação ou num Vortex. Portanto, o método desenvolvido reduz significativamente o tempo de síntese. Além disso, a EDC/NHS bioconjugate utilizado neste protocolo é uma técnica comumente usada e conveniente conjugar peptídeos e anticorpos de nanopartículas. Portanto, a combinação do método sonication passo a passo com a técnica de bioconjugate EDC/NHS para sintetizar lipídios-polímero plCSA-direcionamento nanopartículas podem ser ampliadas para aplicações clínicas.
Certos procedimentos são essenciais para sintetizar e caracterizar plCSA-DNPs com êxito. Primeiro, as concentrações relativas de lecitina, PLGA e DSPE-PEG-COOH determinam o tamanho de nanopartículas de lipídios-polímero e polidispersividade. Quando a concentração de lecitina é fixo, uma maior concentração dos resultados DSPE-PEG-COOH em baixa polidispersividade e um tamanho menor de nanopartículas,13,15 , que consequentemente diminui a droga LE. Quando a concentração de PLGA é fixo, mais DSPE-PEG-COOH é substituído por lecitina, levando a maior polidispersividade de nanopartículas e nanopartículas de maior tamanho15. Nesta situação, as nanopartículas são mais instáveis e agregadas facilmente. Neste protocolo, a relação de peso DSPE-PEG-COOH/PLGA é 0,11 e a relação de massa lecitina/DSPE-PEG-COOH é de 0,43. O tamanho de nanopartículas de lipídios-polímero é aproximadamente 82 nm com um PDI de aproximadamente 0.127.
Em segundo lugar, o pH da solução durante a conjugação dos peptides que as nanopartículas é de extrema importância. O pH ideal da ativação de éster é 5.0-6.0, e a reação de amina é mais eficiente em pH 7,2-7,519,28,29. Para melhores resultados, a reação deve ser realizada em duas etapas. Primeiro, ocorre a ativação de éster no MES (ou outro noncarboxylate, buffer de nonamine) em pH 5,0-6,0. Então, o pH é ajustado para 7,2-7,5 usando PBS (ou outro nonamine buffer) imediatamente antes da reação com a molécula contendo amina19. Considerando que a meia-vida de ésteres de NHS é 4-5 h em pH 7.019, a duração da reação da amina excede 10 h a 4 ° C.
O último fator crítico é a captação de nanopartículas. Absorção de DNPs pelas células JGE3 foi eliminada em uma análise de função de captação alvo controlando o tempo de cultura e temperatura e a concentração de FBS no meio. Neste protocolo, JEG3 as células foram incubadas com 5% FBS a 4 ° C, durante 1 h e em seguida cultivadas a 37 ° C por 30 min para minimizar a absorção celular de DNP.
Caso surjam questões durante o procedimento, existem três principais etapas de solução de problemas relacionadas com a síntese e caracterização de plCSA-DNPs. Primeiro, nanopartículas de lipídios-polímero foram preparadas pela auto-montagem de PLGA e lecitina em condições sonication. PLGA só se dissolve em solventes orgânicos. Portanto, mediante a adição de um solvente hidrofílico, PLGA precipita-se rapidamente em pequenas nanopartículas. Para minimizar o efeito da velocidade da adição gota a gota e evitar a geração de partículas maiores, sonication da mistura para 1-2 min antes de adicionar PLGA é necessário. Em segundo lugar, embora a análise quantitativa da eficiência conjugação plCSA-BP usando o método BCA é rápido e conveniente, um ensaio de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) é mais preciso. Os detalhes HPLC experimentais tem sido descrito pelo nosso grupo11 e outros30,31,32. Finalmente, as condições ideais para a absorção celular de plCSA-DNP podem ser diferentes de outras células de câncer. Gradualmente, diminuindo a concentração de FBS e aumentando o tempo de incubação a 37 ° C podem ajudar a determinar as condições ideais.
Uma limitação do protocolo é que a hidrofobicidade das drogas determina o EE das drogas. Comparado com drogas hidrofílicas, hidrofóbicas drogas têm uma forte afinidade para PLGA, que resulta em uma maior droga EE. Nestes casos, os procedimentos para a síntese das nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-alvo terá de ser examinado experimentalmente para determinar o método mais eficiente de síntese que resulta na droga ideal LE e EE.
Como mencionado acima, o plCSA de glicosaminoglicano especificamente é expressa na maioria das células cancerosas e trophoblasts placentárias. Portanto, é importante notar que o NPs-plCSA deve ser usado para a entrega de alvo da terapêutica de células tumorais em apenas escancarados animais e seres humanos, e que estas partículas carregadas de drogas iria conduzir a efeitos secundários na placenta de animais grávidas e seres humanos.
Em resumo, descrevemos um método simples e conveniente para sintetizar nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-alvo. O significado do presente protocolo é que aumenta a disponibilidade de drogas em tumores e placenta, enquanto minimiza a toxicidade concomitante. Esta abordagem deve ser útil para a entrega de alvo de drogas para tumores e placenta e pode ser ampliada para preparar nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-alvo para aplicações clínicas no futuro.
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Disclosures
X.F. e B.Z. são os inventores sobre a patente PCT/CN2017/108646 e 201710906587.6 submetidos SIAT que abrange um método de síntese de nanopartículas plCSA-alvo e aplicação. Não há conflitos de interesse potenciais foram divulgados por outros autores.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações da pesquisa nacional de chave e programa de desenvolvimento da China (2016YFC1000402), Fundação Nacional de ciências naturais (81571445 e 81771617) e a ciência Natural Fundação da província de Guangdong (2016A030313178) para O fundo de investigação do Basic de Shenzhen (JCYJ20170413165233512) para X.F. e X.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid--polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Cancer Research. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Biochemistry. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
