Процессы, регулирующие вторжения рака мочевого пузыря представляют возможности для биомаркеров и терапевтические развития. Здесь мы представляем модели вторжения рака мочевого пузыря, которая включает 3-D культуры сфероидов опухоли, покадровой изображений и confocal микроскопии. Этот метод полезен для определения особенностей процесса инвазивных и скрининг терапевтических агентов.
Рак мочевого пузыря является проблемой значительного здравоохранения. Предполагается, что более чем 16.000 человек умрет в этом году в Соединенных Штатах от рака мочевого пузыря. В то время как 75% рака мочевого пузыря, неинвазивная и вряд ли могут метастазировать, около 25% прогресс для инвазивного роста. До половины пациентов с инвазивным раком будет развивать смертоносного метастатического рецидива. Таким образом понимание механизма инвазивных прогрессии рака мочевого пузыря имеет решающее значение для прогнозировать исходы и предотвращения смертоносных метастазов. В этой статье мы представляем трехмерной рака вторжения модель, которая позволяет включение опухолевых клеток и стромы компонентов для имитации условий в vivo происходящих в микроокружения опухоли мочевого пузыря. Эта модель обеспечивает возможность наблюдать инвазивных процесс в режиме реального времени с использованием промежуток времени визуализации, допрашивать молекулярные пути, связанные с помощью конфокальной immunofluorescent изображений и экран соединений с потенциалом для блока вторжения. Хотя этот протокол фокусируется на рак мочевого пузыря, вполне вероятно, что подобные методы могут использоваться для изучения вторжения и подвижности в других типов опухолей, а также.
Вторжение является важнейшим шагом в прогрессии рака, который необходим для метастазов и связан с нижней выживания и плохим прогнозом у больных. В человеческой мочевого пузыря рак, наиболее распространенных злокачественных мочевых путей, которое вызывает около 165 000 смертей в год во всем мире, непосредственно связаны с наличие или отсутствие вторжения1стадия рака, лечение и прогноз. Около 75% случаев рака мочевого пузыря мышц инвазивных и являются управляемые с местными резекции. Напротив неинвазивного мышц мочевого пузыря рак (около 25% всех случаев) являются агрессивные опухоли с высокой метастатических и обрабатываются с агрессивным мультимодальность терапии2,3. Таким образом важно понимание того молекулярные пути, которые вызывают вторжения лучше характеризуют риска инвазивного прогрессии и разработать терапевтические вмешательства, которые могут предотвратить инвазивное прогрессии.
Инвазивные прогрессии опухоли происходит в среде сложной трехмерной (3-D) и включает в себя взаимодействие клеток опухоли с другие опухолевые клетки, строма, базальной мембраны и других типов клеток, в том числе иммунных клеток, фибробластов, мышечных клеток и сосудов эндотелиальные клетки. Проницаемых поддержки (например, Transwell) анализа систем обычно используются, чтобы quantitate раковых клеток вторжения4, но эти системы ограничены, потому что они не позволяют микроскопических мониторинг процесса вторжения в режиме реального времени и получение образцов для дальнейшего окрашивания и молекулярный анализ является сложной задачей. Разработка системы сфероида опухоли 3-D мочевого пузыря для изучения вторжения желательно, потому что она позволяет включение определенных microenvironmental компонентов с удобством в vitro системах.
В этом протоколе, мы описать систему допросить инвазивных процессов человека пузыря раковых клеток с помощью пробирного вторжения 3-D сфероида, включающих матрицы геля на основе коллагена и confocal микроскопии позволяет следователям для мониторинга клетки моторики и вторжение в режиме реального времени (рис. 1А). Эта система является универсальным и может быть изменено для допроса различных стромальные опухоли/параметры. Это может включать большинство линий клеток рака мочевого пузыря или опухоли мочевого пузыря первичных и дополнительных стромальные клетки, таких, как рак, связанные фибробластов и иммунные клетки5,6,7. Этот протокол описывает матрицы состоит из коллагена типа-1, но может быть изменен для включения других молекул, например, фибронектин, Ламинин или других белков коллагена. Инвазивных процессов может следовать за 72 ч или больше в зависимости от возможности микроскопа и используемой системы. Фиксация и иммунофлюоресценции окрашивание опухоли, встроенные в матрице 3-D до, во время и после вторжения позволяет допроса upregulated белков в инвазивных клеток, обеспечивая тем самым важную информацию, которая обычно отсутствует или собрать трудно использование других моделей 3-D культуры. Эта система также может использоваться для экрана соединений, которые блокируют вторжение и разграничить сигнальных путей, пострадавших от таких соединений.
Здесь мы описываем 3-D опухоли сфероида модель, которая позволяет в реальном времени наблюдения вторжения рака мочевого пузыря, которая имеет решающее значение для прогрессии рака и метастаз. Эта система поддается включение различных стромы и клеточных компонентов разрешить следовате…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить лаборатории д-р Ховард Кроуфорд (Мичиганский университет) для технической поддержки и предоставление материалов и оборудования для этого исследования и Алан Kelleher для технической поддержки.
Эта работа финансировалась грантов из университета Мичигана с Рак центр Core Грант CA046592-26S3, низ K08 CA201335-01A1 (ПЛП), BCAN YIA (ПЛП), низ R01 CA17483601A1 (DMS).
Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
ProLong Diamond | Mounting medium |