Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य पूरे extracellular मैट्रिक्स घाव की मरंमत जो एक अपक्षयी पाड़ प्रत्यारोपण के भाग के रूप में नैदानिक मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है के लिए लक्षित फाइबर का उत्पादन होता है । इन तंतुओं खोखले फाइबर झिल्ली पर fibroblasts की संस्कृति द्वारा उत्पादित कर रहे है और झिल्ली के विघटन के द्वारा निकाले ।
Abstract
extracellular मैट्रिक्स (ECM) से व्युत्पंन इंजीनियर पाड़ तेजी लाना घाव बंद करने और उपचार में अपनी क्षमता के लिए चिकित्सा में महत्वपूर्ण रुचि प्रेरित किया है । इन विट्रो में fibrogenic सेल संस्कृतियों से extracellular मैट्रिक्स के निष्कर्षण मानव से ECM की पीढ़ी के लिए क्षमता है और संभावित रोगी-विशिष्ट सेल लाइनों, xenogeneic epitopes की उपस्थिति जो नैदानिक बाधा है ंयूनतम कुछ मौजूदा ECM उत्पादों की सफलता । में एक महत्वपूर्ण चुनौती ECM के इन विट्रो उत्पादन आरोपण के लिए उपयुक्त है कि सेल संस्कृति द्वारा ECM उत्पादन आमतौर पर अपेक्षाकृत कम उपज है । इस काम में, प्रोटोकॉल ECM के उत्पादन के लिए वर्णन कर रहे है प्रसंस्कृत कोशिकाओं द्वारा बलि खोखले फाइबर झिल्ली पाड़ के भीतर । खोखले फाइबर झिल्ली एक पारंपरिक कोशिका माध्यम में fibroblast सेल लाइनों के साथ संस्कृति और कोशिका संस्कृति के बाद भंग ECM के निरंतर धागे उपज रहे हैं । परिणामस्वरूप ECM इस विधि द्वारा उत्पादित तंतुओं और lyophilized जा सकता है, यह भंडारण और आरोपण के लिए उपयुक्त प्रतिपादन ।
Introduction
प्रत्यारोपित शल्य पाड़ों घाव की मरंमत के एक दृढ़ रहे हैं, के साथ १,०००,००० से अधिक सिंथेटिक बहुलक अकेले पेट की दीवार की मरंमत1के लिए दुनिया भर में प्रत्यारोपित जाल । हालांकि, आरोपण सिंथेटिक सामग्री पारंपरिक रूप से इन पाड़ों के निर्माण में इस्तेमाल किया पॉलिमर के लिए एक विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया को भड़काने के लिए करते हैं, प्रत्यारोपण और 2 ऊतक के scarring के समारोह के लिए सूजन बचके में जिसके परिणामस्वरूप . इसके अलावा, प्रमुख सिंथेटिक मेष सामग्री (यानी, के रूप में) appreciably शरीर द्वारा remodeled नहीं कर रहे हैं, वे आम तौर पर जहां scarring सहन किया जा सकता है ऊतकों को लागू कर रहे हैं, के उपचार की ओर उनके नैदानिक उपयोगिता सीमित उच्च आदेश के साथ ऊतकों ऐसे मांसपेशी के रूप में समारोह । हालांकि नैदानिक सफलता के साथ लागू किया गया है, जो कई सर्जिकल मेष उत्पादों रहे हैं, हाल के निर्माता सिंथेटिक सर्जिकल जाल की याद करते हैं और एक से अधिक प्रजातियों के ऊतकों प्रत्यारोपण से जटिलताओं को बढ़ाने के महत्व को उजागर , सर्जिकल मेष निर्माताओं3,4पर नियमों को कसने के लिए एफडीए शीघ्र रोगियों के अपने ऊतकों से व्युत्पंन पाड़ के आरोपण इस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया कम कर देता है, लेकिन महत्वपूर्ण दाता-साइट रुग्णता5में परिणाम कर सकते हैं । Extracellular मैट्रिक्स (ECM) इन विट्रो में उत्पादित पाड़ों एक संभव विकल्प हैं, के रूप में विसेलुलर ECM पाड़ों विशेष रूप से ऑटोलॉगस ECM प्रत्यारोपण6के मामले में उत्कृष्ट असंगति प्रदर्शन, ।
रोगी ऊतक की सीमित उपलब्धता के कारण ऑटोलॉगस आरोपण के लिए फसल के लिए और दाता साइट पर समारोह में बाधा का खतरा, मानव कोशिका लाइनों की संस्कृति से इन विट्रो में ECM पाड़ों का उत्पादन करने की क्षमता या, यदि संभव हो तो, एक मरीज की खुद की कोशिकाओं को एक आकर्षक विकल्प है । इन विट्रो में ECM की पर्याप्त मात्रा के निर्माण में प्राथमिक चुनौतियों इन मुश्किल से कब्जा अणुओं की ज़ब्ती है. पिछले काम में, हम ने दिखा दिया है कि ECM संवर्धन ECM-बलि बहुलक फोम कि संस्कृति अवधि के बाद भंग कर रहे है उपज के लिए ECM जो आरोपण7के लिए विघटित किया जा सकता है में स्रावित fibroblasts द्वारा उत्पादित किया जा सकता है, 8,9,10. के रूप में फोम में उत्पादित ECM फोम के आंतरिक वास्तुकला को अपनाने के लिए करते हैं, खोखले फाइबर झिल्ली (HFMs) ECM के धागे के उत्पादन के लिए एक बलि पाड़ के रूप में पता लगाया गया । यहां वर्णित तरीके सेल संस्कृति गुणवत्ता खोखले फाइबर झिल्ली और fibroblast संस्कृति की एक अवधि के बाद एक ही से थोक extracellular मैट्रिक्स फाइबर के निष्कर्षण के प्रयोगशाला पैमाने पर निर्माण के लिए काम कर रहे हैं । यह स्थिर संस्कृति दृष्टिकोण मानक स्तनधारी सेल संस्कृति उपकरणों युक्त प्रयोगशालाओं द्वारा आसानी से अपनाने है । ECM इस दृष्टिकोण द्वारा उत्पादित नैदानिक अनुप्रयोगों की एक किस्म की ओर लागू किया जा सकता है.
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Protocol
1. Extracellular मैट्रिक्स का उत्पादन त्याग खोखले फाइबर झिल्ली का उपयोग
चेतावनी: N-मिथाइल-2-pyrrolidone एक चिढ़ विलायक और प्रजनन विषैले है । एनएमपी के लिए जोखिम त्वचा, आंखों, नाक, और गले में जलन पैदा कर सकता है । एनएमपी हैंडलिंग जब विलायक प्रतिरोधी व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । एनएमपी का प्रयोग एक धुएं हुड के भीतर किया जाना चाहिए ।
- खोखले फाइबर झिल्ली के लिए polysulfone बहुलक समाधान की तैयारी
- एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग कर एक वजन नाव में polysulfone छर्रों (३५ केडी के आणविक वजन) के ७० ग्राम वजन ।
- N-मिथाइल-2-pyrrolidone (एनएमपी) के ३१४ एमएल (३२३.३ ग्राम) का स् वच् borosilicate कुप्पी तक अंतरण ।
- एनएमपी के साथ कुप्पी में एक हलचल बार प्लेस और सरगर्मी पर कुप्पी जगह है । रोटेशन के एक उदारवादी दर के लिए सरगर्मी सेट ।
- एक सूखी कीप का प्रयोग धीरे एनएमपी के साथ कुप्पी में polysulfone के तैयार ७० जी डालने के लिए ।
- बहुलक "डोप" समाधान के लिए कमरे के तापमान पर तीन दिनों के लिए हलचल, या homogenized तक की अनुमति दें ।
- स्थापना गाढ़ा और खोखले फाइबर झिल्ली spinneret की सफाई
नोट: Spinnerets व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं; सही spinneret आयामों सफल झिल्ली निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है और सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं । संभाल spinneret बहुत धीरे, के रूप में spinneret सुई विशेष रूप से नाजुक है ।- ध्यान से spinneret जुदा करने के लिए एक उपयुक्त पेचकश बिट के साथ एक पेचकश या ड्रिल का प्रयोग करें ।
- धीरे spinneret के प्रवेश और आउटलेट के माध्यम से एसीटोन प्रवाह, निपटान के लिए एक गिलास चोंच में किसी भी एसीटोन और अवशिष्ट बहुलक का संग्रह ।
- एक मेज वाइज में ऊपर की ओर का सामना करना पड़ सुई के साथ spinneret के ऊपरी शरीर को सुरक्षित ।
- ऊपरी शरीर पर आउटलेट (नीचे) spinneret के शरीर प्लेस ।
- बाद में spinneret के आउटलेट शरीर हटो, जबकि ऊपरी पकड़ जब तक spinneret सुई दुकान शरीर के केंद्र में सीधे है पर तय शरीर ।
- ध्यान और धीरे से spinneret के दो निकायों को जोड़ने शिकंजा जबकि सुनिश्चित करना है कि सुई spinneret आउटलेट पर दिखाई केंद्रित रहता है ।
- polysulfone खोखले फाइबर झिल्ली का निर्माण
- एक "बोर समाधान" N के ४५ मिलीलीटर-मिथाइल-2-pyrrolidone और जल के २५५ मिलीलीटर, एनएमपी के एक 15% मिश्रण के गठन से युक्त तैयार पानी ।
- एक कमरे के तापमान नल जल स्नान की सतह से ऊपर एक गाढ़ा खोखले फाइबर झिल्ली spinneret 8 सेमी माउंट ।
- spinneret के बहुलक प्रवेश कनेक्ट और दो अलग इस्पात दबाव कम ३५० मिलीलीटर की एक भीतरी मात्रा होने वाहिकाओं को spinneret के बोर प्रवेश । दोनों जहाजों उनकी दुकानों पर वाल्व की जांच करनी चाहिए ।
- अलग एन2 गैस सिलिंडरों के नियामकों के लिए दबाव वाहिकाओं के प्रत्येक कनेक्ट
- एक कीप का प्रयोग करें तैयार डोप समाधान (~ ३१५ एमएल) spinneret के बहुलक प्रवेश से जुड़े दबाव पोत में डालने के लिए । सुनिश्चित करें कि पोत के ऊपर कसकर सील है ।
- spinneret के बोर प्रवेश से जुड़े दबाव पोत में तैयार बोर समाधान (३०० एमएल) डालने के लिए एक कीप का प्रयोग करें । सुनिश्चित करें कि पोत के ऊपर कसकर सील है ।
- पहले बोर पोत के लिए जांच वाल्व खोलो, तो बहुलक पोत दूसरा । यदि spinneret पर्याप्त रूप से साफ है, बोर समाधान spinneret आउटलेट से बाहर स्ट्रीम करने के लिए शुरू हो जाएगा ।
- दबाव दोनों जहाजों 1 साई के लिए । नेत्रहीन की पुष्टि करें कि दोनों बहुलक और बोर समाधान spinneret बाहर निकल रहे हैं, एक सतत सफेद रेशा के साथ तेज़ी के रूप में संयुक्त धाराओं जल स्नान से संपर्क करें ।
- उपयोग लंबे समय संदंश स्नान के केंद्र में रोलर्स के तहत नवजात फाइबर गाइड, और फिर एक घूर्णन एक मोटर से जुड़े पहिया के आसपास नवजात फाइबर हवा ।
- लो-अप व्हील और मोटर को लगभग दो मीटर प्रति मिनट की दर से घुमाने के लिए सेट करें ।
- नियामकों को मामूली समायोजन करें या एक स्थिर राज्य प्रवाह प्राप्त होने तक आवश्यकतानुसार व्हील गति लें । नवजात फाइबर पानी स्नान की सतह के साथ एक ९० ° कोण फार्म चाहिए ।
- बंद एन2 सिलेंडर नियामकों और दबाव पोत वाल्व की जांच करें और ले पहिया मोटर छुड़ाने के बाद सभी बहुलक और बोर समाधान जहाजों से बाहर निकाला गया है ।
- तैयार खोखले फाइबर झिल्ली निकालें और उन्हें तीन दिनों के लिए एक जल स्नान में जगह, अवशिष्ट विलायक हटाने के लिए प्रति दिन एक बार पानी का आदान प्रदान ।
- उंहें 30 मिनट के लिए १२१ ° c पर autoclaving द्वारा या ७०% इथेनॉल में एक दिन के लिए विसर्जित करके खोखले फाइबर झिल्ली निष्फल ।
- खोखले फाइबर झिल्ली की कोशिका सीडिंग
नोट: सभी सेल संस्कृति प्रक्रियाओं एक सुरक्षा कैबिनेट के भीतर किया जाना चाहिए ।- एक 20 µ जी/एमएल पंजाब में गोजातीय प्लाज्मा fibronectin के समाधान के साथ खोखले फाइबर झिल्ली का इलाज (पीएच = ७.४) सेल लगाव को बढ़ावा देने के लिए ।
- वजन 1 एक वजन नाव में पाउडर गोजातीय प्लाज्मा fibronectin के मिलीग्राम और यह बाँझ पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में भंग (पीएच = ७.४) एक बाँझ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ।
- मशीन में 30 मिनट के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय प्लाज्मा fibronectin समाधान । एक बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में बाँझ पंजाबियों के ४९ मिलीलीटर के लिए समाधान जोड़ें ।
- 1 घंटे के लिए 5% CO2 के साथ ३७ ° c में एक मशीन में गोजातीय प्लाज्मा fibronectin के तैयार ५० मिलीलीटर में फाइबर मशीन । 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में बाद में उपयोग और दुकान के लिए fibronectin समाधान recollect ।
- उपयोग बाँझ microscissors फाइबर के लिए इच्छित लंबाई में कटौती करने के लिए (< 6 सेमी).
- बीज fibroblast कोशिकाओं को सीधे खोखले फाइबर झिल्ली के lumina में फाइबर प्रति १००,००० कोशिकाओं के एक बीज का घनत्व पर एक 21 गेज सुई के साथ 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर ।
नोट: सिरिंज में लोडिंग के लिए सेल-सस्पेंशन तैयार करने के लिए एक व्यवहार्य लक्ष्य मध्यम के प्रत्येक 30 microliters के लिए १००,००० कोशिकाओं का एक निलंबन घनत्व है । - एक 6 सेमी व्यास पेट्री डिश में छह वरीयता प्राप्त तंतुओं प्लेस । बोने की मशीन के लिए 5% CO2 के साथ ३७ ° c में पांच मिनट के लिए गर्मी की अनुमति दें ।
- ५० µ जी/एमएल एल-ascorbic एसिड और १५० µ जी की अंतिम सांद्रता युक्त DMEM/एफ 12 में 3 सप्ताह तक के लिए उंहें मशीन और संस्कृति से बीज निकाला फाइबर-ascorbic एसिड 2-फॉस्फेट (हौसले से तैयार है और छान बाँझ), 5 एनजी/एमएल TGF-β1 (बाँझ से फ़िल्टर्ड aliquots पर संग्रहित-20 ° c), और 1% पेनिसिलिन-streptomycin में एक 6 सेमी पेट्री डिश के भीतर एक 5% CO2 मशीन ३७ ° c । विनिमय सेल माध्यम हर दो दिन ।
- एक 20 µ जी/एमएल पंजाब में गोजातीय प्लाज्मा fibronectin के समाधान के साथ खोखले फाइबर झिल्ली का इलाज (पीएच = ७.४) सेल लगाव को बढ़ावा देने के लिए ।
- extracellular मैट्रिक्स के निष्कर्षण से कल्चरल खोखले फाइबर झिल्ली
- प्लेस संदंश का उपयोग कर व्यक्तिगत जुटा शीशी में प्रसंस्कृत फाइबर ।
- एक गिलास पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक शीशी में एनएमपी के 5 मिलीलीटर तक रखें ।
- एनएमपी में खोखले तंतुओं विसर्जित, एनएमपी के तीन बाजारों की कुल प्रदर्शन । धीरे महाप्राण पुराने एनएमपी का उपयोग कर एक 1 मिलीलीटर पिपेट निकाले ECM के आंसू रोकने के लिए ।
नोट: ताजा एनएमपी जोड़ते समय, यह शीशी झुकाव और एनएमपी नीचे पक्षों चलाने की अनुमति मददगार है, अंयथा शेष ECM पाड़ कतरनी जो फाड़ कारण हो सकता है के अधीन है । - एनएमपी निकालें और जिसके परिणामस्वरूप ECM धागे 3 बार पानी में से कुल्ला ।
- 3 इंच, 1 इंच की चौड़ाई और रबर की लंबाई के केंद्र में 4 मिमी आयताकार मोल्ड द्वारा एक 8 मिमी कटौती की लंबाई के लिए सिलिकॉन रबर की एक 1/32 इंच मोटी चादर में कटौती ।
- एक मानक 3 इंच पर रबर के तैयार टुकड़ा प्लेस 1 इंच माइक्रोस्कोपी स्लाइड और आटोक्लेव १२१ ° c पर 30 मिनट के लिए ।
- 4 मिमी सिलिकॉन मोल्ड द्वारा 8 मिमी में पक्ष द्वारा प्रत्येक ECM फाइबर पक्ष रखना जब तक कोई दिखाई खुली जगह नहीं है.
- एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में मोल्ड प्लेस और फ्रीज में-80 ° c जब तक पूरी तरह से जमे हुए ।
- Lyophilize जमे हुए ECM मेष रात भर या पूरी तरह से शुष्क जब तक । decellularization के लिए तैयार जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर जाल की दुकान ।
2. Extracellular मैट्रिक्स का Decellularization
- जल में 1% (w/w%) सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) का समाधान तैयार करें ।
- 1% एसडीएस में मोल्ड में extracellular मैट्रिक्स निकाले गर्मी कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए कोमल आंदोलन के साथ एक झूली कुरसी पर ।
- कुल्ला निकाले extracellular मैट्रिक्स बाँझ फॉस्फेट में तीन बार-सौंय आंदोलन के साथ खारा (पंजाब), कुल्ला प्रति पंजाब के 3 मिलीलीटर का उपयोग कर ।
नोट: कुल्ला धीरे से किया जाना चाहिए तैयार पाड़ों के फाड़ को कम करने के लिए । - DNAse/RNAse पाचन बफर के 1 एल तैयार ।
नोट: DNAse/RNAse पाचन बफर 4 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।- Tris एचसीएल के १.५४ जी का वजन, ३०८ मिलीग्राम की MgCl2, और CaCl2 के ५६ मिलीग्राम अलग बकरों की नावों में ।
- Tris एचसीएल, MgCl2, और CaCl2 के साथ एक बड़ी कुप्पी में एक बार हलचल और जब तक सभी घटकों को भंग कर रहे है हलचल के साथ 1 एल का मिश्रण ।
- बाँझ फिल्टर एक बाँझ 1 L borosilicate बोतल में एक ०.२२ µm फिल्टर के साथ पाचन बफर और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
- DNAse/RNAse पाचन समाधान के 5 मिलीलीटर तैयार करें ।
नोट: पाचन समाधान तैयार करने के 24 घंटे के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।- वजन ०.१२५ मिलीग्राम (५० कू) DNAse मैं एक वजन नाव में और पाचन बफर के 5 मिलीलीटर में जोड़ें ।
- जोड़ें ७५ µ के एल RNAse पाचन बफर करने के लिए एक स्टॉक समाधान ।
- पाचन समाधान के साथ प्रत्येक मोल्ड भरें और 6 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
- महाप्राण पाचन समाधान और कुल्ला तीन बार बाँझ पंजाबियों में ।
- पंजाब में 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब में 10% पेनिसिलिन-streptomycin में रातोंरात महाप्राण और मशीनी पाड़ ।
- महाप्राण को पेनिसिलिन-streptomycin और कुल्ला मचाने वाले बाँझ पंजाबियों में तीन बार.
- एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में मोल्ड प्लेस और फ्रीज-80 ° c ।
- Lyophilize ECM मेष रात भर या पूरी तरह से शुष्क जब तक ।
- 4 ° c लंबित उपयोग में एक बाँझ कंटेनर के लिए एक सुरक्षा हुड के भीतर lyophilized पाड़ों स्थानांतरण.
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Representative Results
बलि मचान से extracellular मैट्रिक्स के सफल उत्पादन उचित पाड़ निर्माण, सेल संस्कृति, और विलायक कुल्ला प्रक्रियाओं पर आकस्मिक है । खोखले फाइबर झिल्ली का निर्माण एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्टील के वलय के माध्यम से बहुलक समाधान के बाहर निकालना का उपयोग करता है जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घटकों (चित्रा 1) से इकट्ठे एक सूखी जेट गीला कताई प्रणाली का उपयोग किया जाता है spinneret (भीतरी व्यास = ०.८ मिमी, बाहरी व्यास = १.६ मिमी) बहुलक समाधान का एक नवजात ट्यूब उत्पन्न करने के लिए जो एक खोखले फाइबर झिल्ली में एक पानी स्नान के साथ संपर्क पर हाला.
HFMs से ECM निष्कर्षण के लिए एक उदाहरण प्रक्रिया चित्र 2में सचित्र है । 3 ए चित्रा एक अनुप्रस्थ पार polysulfone HFMs की धारा इस प्रोटोकॉल के तहत गढ़े से पता चलता है, बाहरी और उंगली की भीतरी परतों का प्रदर्शन की तरह एक असममित झिल्ली की विशेषता pores । इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को झिल्ली के भीतरी लुमेन में विशेष रूप से वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और 6 सेमी व्यास पेट्री व्यंजन (चित्र 3 बी) में संस्कृति, झिल्ली के सभी सतहों पर पैदा करना करने के लिए करते हुए कोशिकाओं के साथ. कल्चरल झिल्ली तो ECM (चित्रा 3 डी) के पारदर्शी धागे का निर्माण, मानक ग्लास जुटाना शीशियों (चित्रा३ सी) में धोने के बैच एनएमपी और पानी में कुल्ला करने के लिए अधीन किया जा सकता है. ECM-उत्पादक कोशिकाओं 3-संस्कृति के सप्ताह की अवधि (चित्रा 4) भर में HFMs के अंदर व्यवहार्य रहते हैं ।
प्राथमिक चूहे कंकाल मांसपेशी fibroblasts (RSMF) के साथ तीन सप्ताह के लिए HFMs कल्चरल एन मिथाइल-2-pyrrolidone के तीन आदान-प्रदान के माध्यम से भंग कर दिया गया, जिसके बाद वे तीन बार पानी में कुल्ला किया गया । निकाले मैट्रिक्स, आम तौर पर उपस्थिति में पारदर्शी जा रहा है जब हाइड्रेटेड (आंकड़ा 5), जलयोजन पर बादल अगर उपयुक्त विलायक के कारण अवशिष्ट बहुलक की उपस्थिति के लिए नहीं कर रहा होगा । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि झिल्ली के विघटन के बाद शेष ECM कुछ नाजुक है, ठीक संदंश से निपटने में देखभाल की आवश्यकता होती है । ECM जाल में इकट्ठे हुए तंतुओं और फिर lyophilized एक सकल अनुदैर्ध्य संरेखण (चित्रा 5B) के साथ एक बंद सफेद रंग और रेशेदार उपस्थिति का प्रदर्शन ।
चित्रा 1: खोखले फाइबर झिल्ली कास्टिंग के लिए सचित्र प्रक्रिया प्रवाह । खोखले फाइबर झिल्ली विशिष्ट सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घटकों से तैयार एक प्रणाली का उपयोग सर्वव्यापी गैर विलायक प्रेरित चरण जुदाई विधि (NIPS) का उपयोग कर निर्मित कर रहे हैं । एनएमपी में Polysulfone (१७.८ w/w%) और एनएमपी बोर समाधान (15 w/w% एनएमपी पानी में) एक spinneret में दबाव एन2 द्वारा अलग स्टेनलेस स्टील के जहाजों से बाहर निकाले जाते हैं, spinneret आउटलेट पर एक नवजात खोखले फाइबर झिल्ली पैदा जो पूरी तरह से हाला नल जल वर्षा स्नान के साथ संपर्क करने पर । नवजात खोखले फाइबर मैनुअल के तहत और गाइड पर मार्गदर्शन किया जाता है और एक घूर्णन मोटर ले अप २.३ मीटर प्रति मिनट की दर से पहिया लेने पर इकट्ठा करने की अनुमति दी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: कल्चरल खोखले फाइबर झिल्ली से ECM का सचित्र उत्पादन। खोखले फाइबर झिल्ली fibroblasts के साथ वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और तीन सप्ताह के लिए प्रसंस्कृत, एनएमपी 3x के आदान प्रदान के बाद और पानी 3x के विनिमय । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: ECM की संस्कृति और निष्कर्षण। असममित mesoporous खोखले फाइबर झिल्ली (एक) पूरक ascorbic एसिड और TGF-β (बी)के साथ DMEM/एफ-12 में RSMF कोशिकाओं के साथ तीन सप्ताह के लिए प्रसंस्कृत थे । प्रसंस्कृत खोखले तंतुओं (सी, डी शीर्ष) n-मिथाइल-2 में 3 बाजारों के माध्यम से भंग कर रहे थे pyrrolidone तो पानी में तीन बार कुल्ला, ECM के निरंतर धागे में जिसके परिणामस्वरूप (डी, नीचे) । ECM फाइबर सतह (ई)के उच्च आवर्धन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी micrograph । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: खोखले फाइबर झिल्ली पर कोशिका व्यवहार्यता । प्रतिनिधि खोखले फाइबर तीन सप्ताह के लिए RSMF कोशिकाओं के साथ प्रसंस्कृत झिल्ली longitudinally HFMs की चमकदार सतह प्रकट करने के लिए एक ठीक उस्तरा का उपयोग कर खोदी गई थी और जीने के अधीन-Calcein AM और EthD-1 के साथ मृत धुंधला । व्यवहार्यता धुंधला नगण्य EthD-1 प्रतिदीप्ति के साथ व्यवहार्य कोशिकाओं की एक धाराप्रवाह परत का पता चला । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: ECM प्रत्यारोपण के विधानसभा । व्यक्तिगत extracellular मैट्रिक्स धागे (एन = 30) RSMF कोशिकाओं की संस्कृति से व्युत्पंन एक सिलिकॉन मोल्ड में लंबाई रखा गया था (क) और 1% द्वारा सेलुलर DNAse मैं, RNAse एक, और पेनिसिलिन-streptomycin के साथ उपचार के बाद एसडीएस । सेलुलर ECM तो lyophilized, एक रेशेदार रूप और अनुदैर्ध्य वास्तुकला (बी)के साथ एक बंद सफेद जाल उपज थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
प्रक्रियाओं में थोक ECM के उत्पादन को सक्षम वर्णित इन विट्रो खोखले फाइबर झिल्ली का उपयोग कर एक सूखी-जेट गीला कताई प्रणाली झिल्ली की सस्ती थोक उत्पादन के लिए अनुमति के रूप में अच्छी तरह से मानक सेल संस्कृति उपकरण द्वारा डाली । जबकि इस प्रोटोकॉल में गढ़े झिल्ली कोशिका संस्कृति में उपयोग के लिए इरादा कर रहे हैं, जुदाई प्रयोजनों के लिए झिल्ली के उत्पादन के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता वर्णित प्रणाली, ताकना आकार वितरण और खोखले फाइबर के साथ स्वरित्र आयाम अलग से spinneret आयामों, बहुलक इस्तेमाल किया, डोप और बोर प्रवाह दर, ले लो गति, और पर्यावरण की स्थिति । 13 हालांकि प्रोटोकॉल विस्तृत खोखले फाइबर झिल्ली को रोजगार, सिद्धांत में किसी भी dissolvable सेल संस्कृति पाड़ जैसे खुले सेल फोम के रूप में उपयुक्त परिवहन संपत्तियों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में पिछले7काम में प्रदर्शन किया, 8,9. यह सामांय दृष्टिकोण बलि पाड़ों जो और अधिक ईमानदारी से ऊतकों की आंतरिक वास्तुकला की नकल कर सकते है द्वारा ECM पाड़ों के उत्पादन के लिए उपयोगी प्रतीत होता है । विशेष रूप से प्रदर्शन में इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित प्रत्यारोपण एक सकल संरेखण (चित्रा 5B), जो इस तरह के tendons, बंधन और कंकाल की मांसपेशी के रूप में उच्च गठबंधन के ऊतकों के पुनर्निर्माण की ओर विशेष रूप से लाभ हो सकता है ।
मध्यम के नियमित रूप से विनिमय और, विशेष रूप से, ascorbic एसिड और TGF के साथ मध्यम के पूरक-β ECM का उत्पादन करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में ascorbic एसिड कोलेजन में एक आवश्यक एंजाइम है-संश्लेषण, और TGF-β कई ECM प्रोटीन के संश्लेषण लाती है10 . इसके अतिरिक्त, एनएमपी के साथ ECM की पूरी तरह से धोने किया जाना चाहिए, अंयथा अवशिष्ट बहुलक निकाले ECM में रहना होगा, पानी कुल्ला के दौरान एक सफेद फिल्म के रूप में प्रदर्शित होने । ध्यान से झिल्ली विघटन के दौरान पीढ़ी ECM आंदोलन नहीं करने के लिए लिया जाना चाहिए, के रूप में यह अपेक्षाकृत नाजुक है । एकत्र ECM पाड़ आरोपण के लिए इरादा एक decellularization कदम के रूप में xenogeneic epitopes हटाने के लिए एक संभावित मेजबान विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया को कम करने के लिए वर्णित के अधीन किया जाना चाहिए ।
इस तकनीक का महत्व पूरे extracellular मैट्रिक्स के एक जटिल पाड़ जो शरीर की खुद की घाव भरने प्रक्रियाओं द्वारा remodeled किया जा सकता है के अपने उत्पादन में निहित है । इस दृष्टिकोण का उपयोग करके एक लक्ष्य प्रजातियों के लिए विशिष्ट कोशिकाओं से ECM उत्पादन करने के लिए, यह विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया है जो इस वर्ग के इस श्रेणी के नैदानिक प्रभाव को कम करने के लिए संभव हो सकता है; एक व्यक्ति के लिए विशिष्ट कोशिकाओं का उपयोग करके, विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया आगे कम किया जा सकता है । यह दृष्टिकोण भी विशेष ऊतकों की ओर लक्षित ECM के उत्पादन के लिए अनुमति देता है, हाल ही में सुझाव है कि ऊतक विशिष्ट ECM विशेष रूप से कुछ अनुप्रयोगों12में प्रभावी हो सकता है रिपोर्टों के साथ । के रूप में इस प्रोटोकॉल विभिंन सेल लाइनों में ECM के उत्पादन के लिए अनुमति देता है, कई प्रकार के सेल से ECM संयोजन प्रत्यारोपण (जैसे मांसपेशी, तंत्रिका, endothelial) अधिक ईमानदारी से अनुमानित संरचना और रासायनिक करने के लिए प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लक्ष्य ऊतकों की जटिलता । जबकि ECM जाल यहां प्रस्तुत मूल घाव मरंमत के लिए पाड़ के रूप में इरादा कर रहे थे, वे भी सेल में जांच के लिए प्लेटफार्मों के रूप में उपयोग कर सकते है ECM बातचीत, durotaxis, और संवेदन । विशेष रूप से, यह दृष्टिकोण अन्वेषक के विशिष्ट कोशिका प्रकार से ECM का उत्पादन करने की क्षमता को उधार देता है जो ऊतक-विशिष्ट ECM संरचना, संरचना और कार्य के जैविक महत्व में नई अंतर्दृष्टि के लिए अनुमति दे सकता है ।
ECM उत्पादन तकनीक के लिए संभावित सुधार यहां प्रस्तुत स्केल-गतिशील और पूर्व कंडीशनिंग के साथ ही वैकल्पिक बलि पाड़ सामग्री और वास्तुकला के अंवेषण के उपयोग के माध्यम से शामिल हो सकते हैं । विशेष रूप से, एक विलायक पाड़ हटाने की प्रक्रिया में संक्रमण निष्कर्षण प्रक्रिया की सुरक्षा में सुधार होगा; बलि के मचान सामग्री है जो एंजाइमों, जैसे पुनर्जीवित फाइबर के द्वारा सड़ रहे है से बना, विलायक ECM निष्कर्षण14के लिए अनुमति दे सकता है । जबकि इन सामग्रियों की तंयता ताकत सिंथेटिक सामग्री के उन नीचे है, वहां विभिंन संस्कृति की स्थिति, मीडिया योगों, और बलि पाड़ geometries की खोज सहित इन पाड़ों के सुधार के लिए कई रास्ते मौजूद हैं । हाल ही में आनुवंशिक इंजीनियरिंग अग्रिमों के लिए प्रो fibrotic सेल लाइनों, जो ECM कब्जा के लिए प्लेटफार्मों के साथ संयोजन में नैदानिक मांगों संतोषजनक पाड़ों के उत्पादन को सक्षम कर सकता है उत्पादन leveraged किया जा सकता है । इसके अलावा, सतत प्रवाह के रूप में मौजूदा गतिशील संस्कृति प्रणालियों-पाश खोखले फाइबर झिल्ली प्रतिक्रियाएं पोषक तत्व विनिमय की उच्च दर की सुविधा अधिक से अधिक तेजी से ECM उत्पादन के लिए अनुकूल है, और इस लाभ में विशेष रुचि का हो सकता है जैविक अनुसंधान और नैदानिक उपयोग के लिए ECM की बड़ी मात्रा के उत्पादन के लिए तकनीक ।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
अनुसंधान के इस प्रकाशन में सूचना दी राष्ट्रीय गठिया और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस और त्वचा रोगों के राष्ट्रीय संस्थान पुरस्कार संख्या R15AR064481, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (CMMI-१४०४७१६) के तहत, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Arkansas विज्ञान संस्थान ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
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