Summary
Målet med detta protokoll är produktionen av hela extracellulära matrix fibrer måltavlan för såret reparation som är lämpliga för preklinisk utvärdering som en del av en regenerativ byggnadsställning implantatet. Dessa fibrer är producerad av kulturen av fibroblaster på ihålig fiber membran och utvinns av upplösningen av membranen.
Abstract
Bakåtkompilerade ställningar härrör från extracellulär matrix (ECM) har driven betydande intresse i medicin för sin potential påskynda sår stängning och helande. Utvinning av extracellulär matrix från fibrogenic cell kulturer i vitro har potential för generering av ECM från mänskliga- och potentiellt patientspecifika cellinjer, minimera förekomsten av xenogena epitoper som har hindrat den kliniska framgången för vissa befintliga ECM-produkter. En stor utmaning i in vitro- produktion av ECM lämpliga för implantation är att ECM produktion av cellodling är vanligtvis relativt låg avkastning. I detta arbete beskrivs protokoll för produktion av ECM av celler odlade inom uppoffrande ihålig fiber membran ställningar. Ihålig fiber membran är odlade med fibroblast cellinjer i konventionella cell medium och upplöstes efter cellkultur att ge kontinuerlig trådar av ECM. Den resulterande ECM-fibrer som framställs med denna metod kan cell-lösa och frystorkade, gör den lämplig för lagring och implantation.
Introduction
Implanterbara kirurgiska ställningar är en fixtur av såret reparation, med över en miljon syntetisk polymer maskor implanteras i världen varje år för bukväggen reparation ensam1. Men efter implantation syntetmaterial polymererna traditionellt används vid tillverkning av dessa ställningar tenderar att provocera en främmande kropp som svar resulterar i inflammation skadliga till funktionen av implantatet och ärrbildning i vävnad2 . Ytterligare, eftersom de dominerande syntetiska nät material (dvs polypropen) inte är märkbart remodeled av kroppen, de är allmänt tillämpliga på vävnader där ärrbildning kan tolereras, vilket begränsar deras kliniska nyttan mot behandling av vävnader med högre ordningens funktion såsom muskel. Medan det finns många kirurgiska mesh-produkter som har tillämpats med klinisk framgång, senaste tillverkaren påminner om av syntetiska kirurgiska maskor och komplikationer från SAR vävnad implantat betona vikten av att maximera implantat biokompatibilitet, föranledde FDA att skärpa bestämmelserna om kirurgiska mesh tillverkare3,4. Implantation av ställningar som härrör från patienternas egna vävnader minskar detta immunsvar, men kan resultera i betydande givare-site sjuklighet5. Extracellulär matrix (ECM) ställningar som producerats in vitro- är ett möjligt alternativ, som cell-lösa ECM ställningar uppvisar utmärkt biokompatibilitet, särskilt när det gäller autolog ECM implantat6.
På grund av den begränsade tillgången av patientens vävnad att skörda för autolog implantation och risken för hindrar funktionen på webbplatsen givare, förmågan att producera ECM ställningar i vitro från kulturen av mänskliga cellinjer eller, om möjligt, en patients egna celler är ett attraktivt alternativ. De viktigaste utmaningarna för tillverkning av betydande mängder av ECM i vitro är beslagtagande av dessa svårt-att-capture molekyler. I tidigare arbete, vi har visat att ECM kan produceras av odlingsskålar ECM-utsöndrar fibroblaster i uppoffrande polymera skum som löses efter perioden kultur till kapacitet ECM som kan vara decellularized för implantation7, 8,9,10. Som ECM som produceras i skum tenderar att anta interna arkitekturen av skum, ihålig fiber membran (HFMs) undersöktes som en uppoffrande byggnadsställning för produktion av trådar av ECM. Beskrivs häri metoder i uppdrag att för lab skala tillverkning av cellmembranen kultur kvalitet ihålig fiber och utvinning av bulk extracellulärmatrix fibrer från samma efter en period av fibroblast kultur. Denna statiska kultur strategi är lätt adoptable av laboratorier som innehåller standard däggdjursceller kultur utrustning. ECM produceras av detta synsätt skulle kunna tillämpas mot en mängd kliniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. produktion av extracellulärmatrix med uppoffrande ihålig Fiber membran
FÖRSIKTIGHET: N-metyl-2-pyrrolidon är en irriterande lösningsmedel och reproduktiv för människor. Exponering för NMP kan orsaka irritation på hud, ögon, näsa och hals. Lösningsmedel-resistenta personlig skyddsutrustning ska användas vid hantering av NMP. Användning av NMP bör utföras i dragskåp.
- Beredning av polysulfon polymer lösning för ihålig fiber membran
- Väger 70 g av polysulfon pellets (molekylvikt 35 kD) i en väger båten med en Analysvåg.
- Överföra 314 mL (323,3 g) av N-metyl-2-pyrrolidon (NMP) till en ren Borsilikat-kolv.
- Placera en uppståndelse bar i kolven med NMP och Placera kolven på omrörare. Ställ in omröraren på en måttlig klassa av rotation.
- Använd en torr tratt till långsamt in kolven med NMP den beredda 70 g av polysulfon.
- Låt polymer ”knark” lösningen rör för tre dagar i rumstemperatur, eller tills homogeniserade.
- Ställa in koncentricitet och rengöring av ihålig fiber membran spinndysor
Obs: Spinnerets är kommersiellt tillgängliga. rätt spinndysor dimensioner är avgörande för framgångsrik membran tillverkning och listas i Tabell för material. Hantera spinndysor mycket försiktigt, som spinndysor nål är särskilt ömtåliga.- Använd en skruvmejsel eller borra med en lämplig skruvmejsel bit försiktigt isär spinndysor.
- Försiktigt flöde aceton genom in- och utlopp av spinndysor, samla alla aceton och kvarvarande polymer i en glasbägare för bortskaffande.
- Säkra spinndysor övre kropp med kanylen pekandes uppåt i en tabell vise.
- Placera utlopp (nederst) kroppen av spinndysor på överkroppen.
- Flytta outlet kroppen av spinndysor sidled medan du håller överkroppen fast på vise tills spinndysor nålen är direkt i mitten av utlopp kroppen.
- Försiktigt och långsamt sätt tillbaka skruvarna ansluta de två organen av spinndysor samtidigt att nålen synlig vid utloppet spinndysor är centrerad.
- Tillverkning av polysulfon ihålig fiber membran
- Bered en ”hålet” som innehåller 45 mL N-metyl-2-pyrrolidon och 255 mL avjoniserat vatten, bildar en 15% blandning av NMP med avjoniserat vatten.
- Montera en koncentrisk ihålig fiber membran spinndysor 8 cm ovanför ytan av badkar rumstemperatur kranvatten.
- Anslut polymer inlopp spinndysor och spinndysor bore inloppet till två separata stål tryckkärl med en inre volym av minst 350 mL. Båda fartygen måste ha backventiler på deras verksamhetsställen.
- Ansluta varje av tryckkärl till tillsynsmyndigheterna för separat N2 gasflaskor
- Använd en tratt för att infoga beredda knark lösningen (~ 315 mL) i tryckkärlet ansluten till polymer inlopp spinndysor. Se till att toppen av fartyget är tätt tillsluten.
- Använd en tratt för att infoga det beredda bar lösning (300 mL) i tryckkärlet ansluten till bore inlopp spinndysor. Se till att toppen av fartyget är tätt tillsluten.
- Öppna backventilen för bore fartyget först, sedan polymer kärlet näst. Om spinndysor är tillräckligt rena, börjar bore lösningen strömma ur utloppet spinndysor.
- Trycksätta båda fartygen till 1 PSI. Visuellt bekräfta att både polymer- och bore lösningar spännande spinndysor, med en kontinuerlig vit glasfiber utfällning som kombinerade strömmar kontakta vattenbadet.
- Använd lång pincett för att vägleda den begynnande fibern under rullarna i mitten av badet, och sedan lindar den begynnande fibern runt ett roterande hjul ansluten till en motor.
- Ställ in utnyttjandet hjul och motor att rotera med en hastighet av cirka två meter per minut.
- Göra mindre justeringar till tillsynsmyndigheter eller utnyttjandet hjulens hastighet som behövs tills ett steady state flöde uppnås. Den begynnande fibern bör bilda en 90° vinkel med ytan av vattenbadet.
- Nära de N2 cylinder regulatorer och tryckkärl backventiler och lösgöra utnyttjandet hjul motorn efter alla polymer och bore lösning har varit pressad från fartygen.
- Ta bort de förberedda ihåliga fiber membran och placera dem i ett avjoniserat vattenbad i tre dagar, utbyte av avjoniserat vatten en gång per dag för att ta bort kvarvarande vätska.
- Sterilisera ihålig fiber membranen i autoklav dem vid 121 ° C i 30 minuter eller doppa dem för en dag i 70% etanol.
- Cell sådd av ihålig fiber membran
Obs: Alla cell kultur bör utföras inom en biosäkerhet skåp.- Behandla de ihåliga fiber membran med en 20 µg/mL lösning av nötkreatur plasma Fibronektin i PBS (pH = 7.4) att främja cell fastsättning.
- Väger 1 mg pulveriserad nötkreatur plasma Fibronektin i en väga båt och lös den i 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (pH = 7.4) i en steril 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Inkubera i 1 mg/mL nötkreatur plasma Fibronektin lösning i inkubatorn i 30 minuter. Tillsätt lösningen till 49 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning i ett sterilt 50 mL koniskt centrifugrör.
- Inkubera fibrerna i de förberedda 50 mL av nötkreatur plasma Fibronektin i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 i 1 timme. Minnas den Fibronektin lösningen för senare användning och förvaras i en steril 50 mL koniskt centrifugrör vid 4 ° C.
- Använd sterila microscissors att klippa fibrerna till önskad längd (< 6 cm).
- Utsäde fibroblast celler direkt in i lumina av ihålig fiber membran med en sådd täthet 100 000 celler per fiber med hjälp av en 21-gauge nål med 1 mL doseringsspruta.
Obs: Ett möjligt mål för att förbereda cellsuspensionen-lastning i sprutan är en suspension densitet av 100 000 celler för varje 30 mikroliter av medium. - Placera sex seedade fibrer i en 6 cm diameter petriskål. Tillåta de seedade fibrerna till Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 i fem minuter.
- Ta bort seedade fibrerna från inkubation och kultur dem i upp till 3 veckor i DMEM/F-12 innehålla slutliga koncentrationer av 50 µg/mL L-Askorbinsyra och 150 µg/mL L-ascorbic syra 2-fosfat (nymalen beredda och sterila filtreras), 5 ng/mL TGF-β1 (från steril filtrerad alikvoter som lagras vid-20 ° C), och 1% penicillin-streptomycin i en 6 cm petriskål inom en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C. Exchange cell medium varje två dagar.
- Behandla de ihåliga fiber membran med en 20 µg/mL lösning av nötkreatur plasma Fibronektin i PBS (pH = 7.4) att främja cell fastsättning.
- Utvinning av extracellulär matrix från odlade ihålig fiber membran
- Plats odlade fibrer till enskilda scintillation injektionsflaskan med pincett.
- Placera upp till 5 mL NMP injektionsflaska med glas pipett.
- Fördjupa de ihåliga fibrerna i NMP, utför totalt tre utbyten av NMP. Aspirera långsamt den gamla NMP med 1 mL pipett för att förhindra tårande extraherade ECM.
Obs: När du lägger färska NMP, det är bra att luta injektionsflaskan och tillåta den NMP köra ner sidorna, annars återstående ECM schavotten utsätts för skjuvning som kan orsaka sönder. - Ta bort NMP och sköljas resulterande ECM tråden 3 gånger i avjoniserat vatten.
- 1/32-tums tjocka pappersark silikongummi till en längd av 3 inches, bredd 1 tum och styckade en 8 mm av 4 mm rektangulär mögel i mitten av längden av gummi.
- Placera beredd pjäsen av gummi på en standard 3-tums med 1-tums mikroskopi bilden och autoklav vid 121 ° C i 30 minuter.
- Lägg varje ECM fiber sida vid sida i 8 mm av 4 mm silikon mögel tills det finns inga synliga öppet utrymme.
- Placera formen i en 50 mL konisk centrifugrör och frysa vid-80 ° C tills helt fryst.
- Lyophilize frysta ECM mesh över natten eller tills helt torr. Lagra mesh vid 4° C tills redo för decellularization.
2. decellularization av extracellulär Matrix
- Bered en lösning av 1% (w/w%) sodium dodecyl sulfate (SDS) i avjoniserat vatten.
- Inkubera extraherade extracellulära matrix i mögel i 1% SDS under 24 timmar i rumstemperatur på en rocker med försiktig skakning.
- Skölj extraherade extracellulär matrix tre gånger i steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) med mild agitation, med 3 mL PBS per skölj.
Obs: Sköljningar bör utföras försiktigt för att minimera tårande beredda ställningar. - Laga 1 L av DNAS/RNAse matsmältningen buffert.
Obs: DNAS/RNAse matsmältningen buffert kan lagras i flera månader vid 4° C.- Väga 1,54 g Tris HCl, 308 mg av MgCl2och 56 mg CaCl2 i separata väga båtar.
- Kombinera Tris HCl, MgCl2och CaCl2 med 1 L avjoniserat vatten i en stor kolv med uppståndelse bar och rör om tills alla komponenter är upplöst.
- Sterila filter matsmältningen bufferten med 0,22 µm filter i en steril 1 L Borsilikat flaska och förvaras vid 4° C.
- Förbereda 5 mL DNAS/RNAse matsmältningen lösning.
Obs: Matsmältningen lösning bör användas inom 24 timmar efter beredning.- Väga 0,125 mg (50 kU) av DNAS I en väga båt och lägga till 5 mL matsmältningen buffert.
- Tillsätt 75 µL av RNAse A stamlösning till matsmältningen bufferten.
- Fyll varje mögel med matsmältningen lösning och inkubera vid 4 ° C i 6 timmar.
- Aspirera matsmältningen lösningen och skölj tre gånger i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- Aspirera PBS och inkubera ställningar övernattning i 10% penicillin-streptomycin i PBS vid 4° C.
- Aspirera på penicillin-streptomycin och skölj ställningar tre gånger i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- Placera formen i en 50 mL konisk centrifugrör och frysa vid-80 ° C.
- Lyophilize cell-lösa ECM mesh över natten eller tills helt torr.
- Överföra de frystorkade ställningar inom biosäkerhet huva till en steril behållare vid 4° C i avvaktan användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrik produktion av extracellulärmatrix från uppoffrande ställningar är avhängigt lämpliga byggnadsställning fabrication, cellkultur och lösningsmedel skölj procedurer. Tillverkning av ihåliga fiber membranen utförs med hjälp av en torr-jet våt-spinning system monteras från kommersiellt tillgängliga komponenter (figur 1) som använder extrudering av polymer lösning genom annulus av en kommersiellt tillgänglig stål spinndysor (innerdiameter = 0,8 mm, ytterdiameter = 1,6 mm) att generera en begynnande tub av polymer lösning som påskyndar i en ihålig fiber membran vid kontakt med ett vattenbad.
En exempel process för ECM extraktion från HFMs illustreras i figur 2. Figur 3A visar ett tvärgående tvärsnitt av polysulfon HFMs tillverkade enligt detta protokoll, uppvisar yttre och inre skikten av finger-liknande porer kännetecknar en asymmetrisk membran. I detta protokoll, är celler seedade specifikt i inre lumen av membranet och odlade i 6 cm diameter petriskålar (figur 3B), med celler tenderar att föröka på alla ytor av membranet. Odlade membran kan då utsättas för batch NMP och avjoniserat vatten skölja av standardglas scintillation injektionsflaskor (figur 3 c), producerar genomskinliga trådar av ECM (figur 3D). ECM-producerande celler förbli livskraftig inuti HFMs under hela den 3-veckors perioden av kultur (figur 4).
HFMs odlade i tre veckor med primära råtta skelettmuskulaturen fibroblaster (RSMF) upplöstes via tre utbyten av N-metyl-2-pyrrolidon, varefter var de sköljs tre gånger i avjoniserat vatten. Extraherade matrisen, normalt är genomskinlig i utseende när hydrerade (figur 5A), tenderar att moln vid återfuktning om inte underkastas lämpliga lösningsmedel sköljning på grund av kvarstående polymer. Det bör också noteras att ECM återstår efter upplösningen av membranet är något ömtålig, som kräver vård i hantering med fin pincett. ECM fibrerna ihop till maskor och sedan frystorkade uppvisar en benvit färg och fibrösa utseende med en brutto längsgående justering (figur 5B).
Figur 1: illustrerad processflödet för gjutning ihålig fiber membran. Ihålig fiber membran tillverkas med allestädes närvarande icke lösningsmedels inducerad fas separationsmetod (NVP) använder ett system som utarbetats från kommersiellt tillgängliga komponenter som anges i tabellen i specifika material. Polysulfon i NMP (17,8 w/w%) och NMP bore lösningar (15 w/w% NMP i vatten) är extruderas från separata rostfria kärl av trycksatt N2 till ett spinndysor, generera ett begynnande ihålig fiber membran vid spinndysor utlopp som fullt påskyndar vid kontakt med kranvatten nederbörd badet. Begynnande ihålig fiber är manuellt guidad under och över guider och tillåtas att samla på ett roterande motoriserad utnyttjandet hjul uppgå till 2,3 meter per minut. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: illustrerad framställning av ECM från odlade ihålig fiber membran. Ihålig fiber membran är seedade med fibroblaster och odlade i tre veckor, följt av diskussion NMP 3 x och utbyte av avjoniserat vatten 3 x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kultur och utvinning av ECM. Asymmetrisk mesoporous ihålig fiber membran (A) odlades i tre veckor med RSMF celler DMEM/F-12 med kompletterade askorbinsyra och TGF-β (B). Odlade ihåliga fibrer (C, D överst) var upplöst via 3 utbyten i n-metyl-2-pyrrolidon då sköljs tre gånger i avjoniserat vatten, vilket resulterar i kontinuerlig trådar av ECM (D, botten). Hög förstoring scanning electron microscopy Mikrograf ECM fiber yta (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: cellviabilitet på ihålig fiber membran. Representativa ihålig fiber membran odlade med RSMF celler för tre veckor var längdriktningen sektioneras med en bra rakhyvel som avslöjar luminala ytan av HFMs och utsätts för levande döda färgning med Calcein AM och EthD-1. Livskraft färgning avslöjade ett konfluenta lager av viabla celler med försumbar EthD-1 fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: montering av ECM implantatet. Enskilda extracellulärmatrix trådar (n = 30) härrör från kultur av RSMF celler placerades på längden i en gjutform (A) och decellularized av 1% SDS följt av behandling med DNAS jag, RNAse A och penicillin-streptomycin. Cell-lösa ECM var sedan frystorkade, ger en benvit mesh med en fibrös utseende och längsgående arkitektur (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De processer som beskrivs möjliggör produktion av bulk ECM biomaterial i vitro med ihålig fiber membran kastades av en torr-jet våta spinning-system som möjliggör billiga huvuddelen produktion av membran samt standard cell kultur utrustning. Medan de membran som är fabricerade i detta protokoll är avsedda för användning i cellkultur, kan det beskrivna systemet även anpassas för produktion av membran för separation, med por storlek distribution och ihålig fiber mått avstämbara av varierande spinndysor dimensioner, polymer som används, knark och födde flöde, utnyttjandet hastighet och miljöförhållanden. 13 även om protokollet detaljerade sysselsätter ihålig fiber membran, i princip alla dissolvable cellkultur schavotten med lämplig transportegenskaper såsom öppen cell skum kan användas, som visat i tidigare arbete7, 8,9. Detta generella tillvägagångssätt visas användbar för produktion av ECM ställningar av uppoffrande ställningar som kan mer troget efterlikna den inre arkitekturen av vävnader. Implantaten tillverkas av detta protokoll i synnerhet uppvisar en grov justering (figur 5B), som kan vara av särskild nytta mot återuppbyggnaden av högt justerad vävnader såsom senor, ligament och skelettmuskulaturen.
Regelbundet utbyte av medium och, i synnerhet, tillskott av medium med askorbinsyra och TGF-β är avgörande för produktionen av ECM, som askorbinsyra är ett viktigt enzym i kollagen biosyntes och TGF-β inducerar syntesen av flera ECM proteiner10 . Dessutom noggrann sköljning av ECM med NMP måste utföras, annars kvarstående polymer förblir i extraherade ECM, som visas som en vit hinna under vatten sköljningar. Vara måste försiktig att inte alltför agitera ECM under membranet upplösning, eftersom det är relativt bräckliga. Insamlade ECM ställningar avsedda för implantation måste underkastas ett decellularization steg som beskrivs för att ta bort xenogena epitoper för att minimera potentiella värd främmande kropp svar.
Betydelsen av denna teknik ligger i sin produktion av en biocomplex byggnadsställning av hela extracellulär matrix som kan vara ombyggda av kroppens egna sårläkning processer. Genom att använda denna metod för att producera ECM från celler specifika till målart, kan det vara möjligt att minimera de främmande kropp svar vilket försvårar den kliniska effektiviteten av denna klass av biomaterial. med hjälp av celler som är specifika för en enskild, kan främmande kropp svaret minskas ytterligare. Detta tillvägagångssätt möjliggör också produktionen av ECM riktade mot speciella vävnader, med senaste rapporterna tyder på att vävnadsspecifika ECM kan vara särskilt effektiv i vissa applikationer12. Eftersom detta protokoll möjliggör produktion av ECM över olika cellinjer, implantat att kombinera ECM från flera celltyper (t.ex. muskler, nervös, endotel) kunde användas att skräddarsy implantat för att mer troget ungefärliga struktur och kemiska komplexiteten i målvävnaderna. Medan ECM maskorna presenteras här var ursprungligen tänkt som ställningar för såret reparation, kan de också ha användning som plattformar för utredningar av cell-ECM interaktioner, durotaxis och biosensing. I synnerhet lånar detta tillvägagångssätt prövaren förmågan att producera ECM från specifika celltyper sevärdheter som kan möjliggöra nya insikter i den biologiska betydelsen av vävnadsspecifika ECM struktur, sammansättning och funktion.
Potentiella förbättringar av ECM-produktionsteknik som presenteras här kan omfatta skala upp via användning av dynamiska och pre luftkonditionering bioreaktorer samt utforskning av alternativa uppoffrande byggnadsställning material och arkitekturer. I synnerhet skulle övergången till en lösningsmedels byggnadsställning borttagningsprocess förbättra säkerheten för extraheringen; uppoffrande ställningar består av material som är nedbrytbara av enzymer, såsom regenererad cellulosa, kan möjliggöra lösningsmedels ECM utvinning14. Medan den tänjbara styrkan av dessa material är lägre än de av syntetiska material, finns det flera vägar för förbättring av dessa ställningar, inklusive utforskning av olika odlingsbetingelser, media formuleringar och uppoffrande byggnadsställning geometrier. Senaste genteknik framstegen kan utnyttjas för att producera pro-fibrotiska cellinjer, som i kombination med plattformar för ECM fånga kunde möjliggöra produktion av ställningar uppfyller kliniska krav. Vidare, befintliga dynamiska kultur system såsom kontinuerlig flöde-slinga ihålig fiber membran bioreaktorer underlätta höga priser av näringsämnen utbyte bidrar till större och snabbare ECM produktion, och kan vara av särskilt intresse i att utnyttja detta teknik för produktion av större mängder ECM för biologisk forskning och kliniska använda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Institute of Arthritis och muskuloskeletala systemet och hudsjukdomar av det nationella Institutes of Health award nummer R15AR064481, National Science Foundation (CMMI-1404716), samt Arkansas Biosciences Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
- Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
- Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
- Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
- FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , Food and Drug Administration. (2016).
- Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
- Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
- Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
- Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
- Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
- Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
- Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
- Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
- Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
- Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. Handbook of Biodegradable Polymers. , CRC Press. (1998).
