Summary
このプロトコルの目的は傷の修復のために目標として再生足場インプラントの臨床評価のために適している全体細胞外マトリックス繊維の生産。これらの繊維は中空糸膜の線維芽細胞の培養による生産、膜の分解によって抽出されました。
Abstract
細胞外マトリックス (ECM) から派生した組み換え足場創傷閉鎖と癒しを迅速にその潜在的な医学の駆動の重要な興味があります。人間・潜在的患者固有細胞、臨床を妨げ、異種抗原の存在を最小限に抑えることから ECM の世代の線維形成性細胞培養体外からの細胞外マトリックスの抽出を秘めてください。いくつかの既存の ECM 製品の成功。ECM 注入に適したの体外生産の重要な課題は、細胞培養による ECM 生産が通常比較的低い収率であります。この作品でいけにえの中空糸膜足場内培養細胞による ECM の生産のためのプロトコルを説明します。中空糸膜は従来セル中で線維芽細胞を培養、ECM の継続的なスレッドを生成する細胞培養後、解散しました。このメソッドによって生成される結果の ECM 繊維を脱し、凍結乾燥できるストレージと着床に適したレンダリングします。
Introduction
植込み手術足場は、注入世界的腹壁修復だけで1年以上 100 万の合成高分子メッシュの傷の修復の治具です。ただし、移植後これらの足場の作製で合成材料ポリマーが伝統的に使用する異物反応、インプラントの機能に有害な炎症の結果と2 組織の瘢痕化を引き起こす傾向があります。.さらに、優勢な合成メッシュ素材 (ポリプロピレンなど) が体内にかなり改造されないと一般的に適用される、瘢痕は容認することができます、組織の治療に対する臨床的有用性を制限すること筋肉などの高次機能を持つ組織。最近メーカー リコール合成手術の臨床成功と適用されている多くの手術用メッシュ製品中は、メッシュと種間組織インプラントの合併症インプラントを最大化することの重要性を強調生体適合性、手術に関する規制を強化する FDA を求めるメッシュ メーカー3,4。患者の組織から派生した足場の注入この免疫反応を抑えるが重要なドナーサイト罹患率5があります。細胞外マトリックス (ECM) 足場生成体外は、可能な代替脱 ECM 足場を示す優れた生体適合性と自己の ECM の場合は特にインプラント6。
収穫自家移植患者組織の限られた可用性とドナーのサイトで機能に支障を及ぼすリスクのための in vitroひと細胞の培養から骨格の ECM を生産する能力や、可能であれば、患者さんの独自のセルは魅力的な代替手段です。体外ECM のかなりの量の製造に主な課題は、これら捕獲困難の分子の隔離です。ECM を ECM 分泌線維芽細胞注入7,の ECM 脱できる等の収量に培養期間後に溶け込んでいるいけにえの高分子発泡体を培養によって作り出すことが、できた前作、8,9,10。ECM が産発泡体発泡体の内部アーキテクチャを採用する傾向がある、中空糸膜 (HFMs) は ECM のスレッドの生産のためのいけにえの足場として検討しました。記載方法使命を帯びているラボ スケール細胞培養品質中空糸膜と同じ次の間の線維芽細胞培養からの一括細胞外マトリックス繊維の抽出の製造のため。この静置培養方法は、標準的な哺乳類の細胞培養関連装置を含む研究所によって容易に採用可能なです。このアプローチによって生成される ECM は、さまざまな臨床応用に向けて適用でした。
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Protocol
1. いけにえの中空糸膜を用いた細胞外のマトリックスの生産
注意: N-メチル-2-ピロリドンは刺激性の溶媒と生殖毒性物質です。NMP への露出は皮膚、目、鼻、のどに炎症を引き起こす可能性があります。耐溶剤性の保護具は、NMP を処理するときに使用必要があります。NMP の使用は、ヒューム フード内で実行する必要があります。
- 中空糸膜のポリスルホン高分子溶液の調製
- ポリスルホン ペレット 70 g の重量を量る (分子量 35 kD) 分析用天秤を使用して重量を量る、ボートで。
- N-メチル-2 - ピロリドン (NMP) 314 mL (323.3 g) をきれいなホウケイ酸フラスコに転送します。
- 攪拌に NMP と場所のフラスコをフラスコに攪拌棒を配置します。かくはんを適度な回転数に設定します。
- NMP でフラスコにポリスルホンの準備 70 g をゆっくり挿入するのに乾燥漏斗を使用します。
- 3 日、室温でまたは均質になるまで撹拌するポリマー「ドープ塗料」ソリューションを許可します。
- 同心度を設定し、中空繊維膜用ノズルの洗浄
注: ノズルが市販です。正しいスピナレット寸法は成功した膜作製に重要と材料の表に一覧表示されます。スピナレット針は特に壊れやすい、非常に優しく、紡糸を処理します。- ドライバーを使用してまたは紡糸を慎重に分解する適切なドライバー ビットとドリルします。
- そっと入口と処分のためのガラス ビーカーで、アセトンと残留ポリマーを収集、紡糸の出口を通してアセトンを流れ。
- 紡糸の上半身をテーブル万力で上向き針で固定します。
- 上半身にスピナレットの出口 (下) 体を配置します。
- 上半身スピナレット針は直接コンセント本体の中心部まで、万力に固定を押した紡糸のコンセント本体を横方向に移動します。
- 丁寧にゆっくりとスピナレット アウトレットで目に見える針の中心を保持しながら本スピナレットの 2 つのボディを接続するネジを取り付け直します。
- ポリスルホン中空糸膜の作製
- 255 mL の脱イオン水、脱イオン水で NMP の 15% の混合物を形成し、N-メチル-2-ピロリドンの 45 mL を含む「ボア ソリューション」を準備します。
- 同心中空糸膜スピナレット常温水道水のお風呂の表面の上の 8 cm をマウントします。
- 紡糸の高分子入口と紡糸の穴入口を少なくとも 350 mL の内容積を持つ 2 つの独立した鋼圧力容器に接続します。両方の船は、チェック バルブをコンセントが必要です。
- 各圧力容器を別 N2ガス シリンダーのレギュレータに接続します。
- 紡糸の高分子入口に接続して圧力容器に準備されたドープ液 (~ 315 mL) を挿入するのに漏斗を使用します。容器の上部は密閉を確認します。
- 使用準備を挿入する目標到達プロセスは、紡糸の穴入口に接続して圧力容器にソリューション (300 mL) を産んだ。容器の上部は密閉を確認します。
- ボア容器用弁最初に開くし、高分子容器 2 番目。紡糸は十分にきれい、ボア ソリューション スピナレット コンセントからストリームに開始されます。
- 1 PSI に両方の容器を加圧します。視覚的にポリマーとボアの両方のソリューションと組み合わせたストリームお風呂の水を沈殿させる連続白フィラメントの紡糸を終了することを確認します。
- お風呂の中央にローラーの下で初期の繊維をガイドし、回転ホイールの周りの初期の繊維を風に長い鉗子を使用は、モーターに接続されています。
- 巻き取りホイールと毎分約 2 メートルの速度で回転するモータを設定します。
- 規制当局または定常流れを達成するまで必要に応じて取ホイールの速度を微調整してください。初期の繊維は、風呂の水の表面に 90 ° の角度を形成します。
- N2シリンダー レギュレータおよび圧力容器、周辺のチェック バルブと後すべてのポリマーとボアのソリューションと血管から押し出されてきた巻き取りホイール モーターを外します。
- 準備された中空糸膜を削除し、3 日間、一日一回、残留溶媒を除去する脱イオン水を交換、脱イオン水のお風呂。
- 中空糸膜をオートクレーブに入れることによって殺菌しなさい 121 ° c 30 分あるいは 1 日 70% エタノールでそれらを浸すことによってそれら。
- セルは中空糸膜の播種
注: すべての細胞培養プロシージャは、バイオ セーフティ キャビネット内で行わなければなりません。- PBS でウシ血漿フィブロネクチンの 20 μ g/mL の溶液に中空糸膜を扱う (pH 7.4 を =) 細胞接着を促進します。
- 重量を量るボートで粉末のウシ血漿フィブロネクチンの 1 mg の重量を量るし、滅菌 PBS の 1 mL に溶かす (pH 7.4 を =) 滅菌 1.5 mL 遠心チューブに。
- インキュベーターの 1 Mg/ml 牛血漿フィブロネクチン解決 30 分間インキュベートします。49 mL の滅菌 50 mL の円錐形遠心チューブの滅菌 PBS にソリューションを追加します。
- 5% CO2と 37 ° C でインキュベーターでウシ血漿フィブロネクチンの準備 50 mL で繊維間 1 時間インキュベートします。後で使用とストア 4 ° C で 50 mL の滅菌円錐形遠心管中のフィブロネクチン ソリューションを思い出す
- 繊維を好みの長さにカットする滅菌刀を使用 (< 6 cm)。
- 種子繊維 21 g 針を用いた注射器 1 mL あたり 100,000 細胞の播種密度中空糸膜のルミナに直接の線維芽細胞。
注: 細胞懸濁液を注射器で読み込みを準備するための実用的な目標は 100,000 ごとの 30 マイクロリットル中の細胞の懸濁液の密度です。 - 6 cm 径シャーレに六つのシード繊維を配置します。5% CO2と 37 ° C で 5 分間インキュベートするシードの繊維を許可します。
- 孵化からシードの繊維を外し、DMEM/F-12 最終濃度 50 μ G/ml L-アスコルビン酸および 150 μ G/ml L-アスコルビン酸 2-リン酸の含有で最大 3 週間それらを文化 (新鮮な準備と滅菌フィルター)、5 ng/mL TGF-β 1 (から滅菌-20 ° C で保存する因数をフィルタ リング) と 1% ペニシリン-ストレプトマイシン 6 cm シャーレ 37 ° C で 5% CO2インキュベーター内でExchange 細胞培地ごとに 2 日間。
- PBS でウシ血漿フィブロネクチンの 20 μ g/mL の溶液に中空糸膜を扱う (pH 7.4 を =) 細胞接着を促進します。
- 培養の中空糸膜からの細胞外マトリックスの抽出
- 場所は、鉗子を使用して個々 のシンチレーション バイアルに繊維を培養しました。
- ガラス ピペットを使用して各バイアルに NMP の 5 mL までを配置します。
- NMP の 3 つの交流の合計を実行する NMP で中空糸を浸します。ゆっくりと抽出された ECM のテアリングを防ぐため 1 mL ピペットを使用して古い NMP を吸い出しなさい。
注: 新鮮な NMP を追加すると、それがバイアルを傾けるに役立つ、NMP は側面の下の実行を許可するそれ以外の場合残りの ECM 足場が受けたせん断裂が発生する可能性があります。 - NMP を削除し、結果の ECM スレッド脱イオン水で 3 回洗浄します。
- 3 インチ、1 インチの幅の長さとシリコーンゴムの 1/32 インチの厚いシートをカットし、カット 8 mm 4 mm 長方形型で、ゴムの長さの中心。
- 30 分の 121 ° C で標準的な 3 インチ 1 インチ顕微鏡スライド、オートクレーブにゴムの準備の部分を配置します。
- 目に見えるオープン スペースがなくなるまで 4 mm シリコーン型で各 ECM 繊維 8 mm 側を置きます。
- 50 mL の円錐形遠心チューブに金型を置き、完全に冷凍されるまで-80 ° C で凍結します。
- 完全に乾燥するまで、または一晩冷凍 ECM メッシュを凍結乾燥します。Decellularization の準備ができるまで 4 ° C でメッシュを保存します。
2。 細胞外マトリックスの decellularization
- (W/w%) 1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 脱イオン水のソリューションを準備します。
- 1 %sds の金型で抽出した細胞外マトリックスは穏やかな攪拌とロッカーに室温で 24 時間インキュベートします。
- すすぎは 3 回滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) リンスあたり 3 mL の PBS を使用して穏やかな攪拌とにおける細胞外マトリックス抽出。
注: リンスを優しくで実行して準備された足場の断裂を最小限に抑える必要があります。 - DNAse/RNAse 消化バッファーの 1 L を準備します。
注意: DNAse/RNAse 消化バッファーは、4 ° C で数ヶ月間保存します。- トリス塩酸 1.54 g、MgCl2, 308 mg および CaCl2個別計量ボートでの 56 mg の重量を量る。
- 攪拌棒の大きなフラスコに脱イオン水 1 リットルとトリス塩酸、MgCl2、および CaCl2を組み合わせるし、すべてのコンポーネントが溶けるまでかき混ぜます。
- 滅菌 1 リッターボトル ホウケイ酸と 4 ° C でストアに 0.22 μ m のフィルターで滅菌フィルター消化バッファー
- DNAse/RNAse 消化液 5 mL を準備します。
注: 消化ソリューションは、準備の 24 時間以内に使用ください。- DNAse の 0.125 mg (50 区) の重量を量る重量を量るでボートし、5 mL の消化バッファーに追加します。
- RNAse A ストック溶液 75 μ L を消化バッファーに追加します。
- 消化ソリューションで各型を記入し、, 4 ° C で 6 時間。
- 分解酵素液を吸引し、滅菌 PBS で 3 回をすすいでください。
- PBS を吸引し、一晩に 10% ペニシリン-ストレプトマイシン PBS で 4 ° C で足場を孵化させなさい
- ペニシリン-ストレプトマイシンを吸引し、滅菌 PBS で 3 回足場をすすいでください。
- 50 mL の円錐形遠心チューブに金型を置き、-80 ° C で凍結
- 完全に乾燥するまで一晩、または decellularized の ECM メッシュを凍結乾燥します。
- バイオ セーフティ フード内凍結乾燥の足場を使用保留中の 4 ° C で滅菌した容器に転送します。
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Representative Results
いけにえの足場からの細胞外マトリックスの成功した生産は、適切な足場の作製、細胞培養および溶剤洗浄手順に偶発的です。市販のスチールのアニュラスを通じて高分子溶液の押出しを使用してドライ ジェット湿式紡糸システム市販コンポーネント (図 1) から組み立てを用いて中空糸膜の作製スピナレット (内径 0.8 mm の外径を = = 1.6 mm) 水浴との接触時に中空糸膜に沈殿させるポリマー溶液の初期チューブを生成します。
HFMs から ECM 抽出処理の例を図 2に示します。図 3 a非対称膜の特徴的な指のような毛穴の外側と内側の層を示すこの議定書の下で作製したポリスルホン HFMs の横断面図を示しています。このプロトコルでセルを膜の内部ルーメンで具体的にシードして 6 cm 径シャーレ (図 3 b) 培養細胞膜のすべての表面に増殖する傾向があります。培養膜をバッチ NMP と脱イオン水洗浄標準ガラス シンチレーション バイアル (図 3) にさらされること (図 3 D) の ECM の半透明のスレッドを生産します。ECM 産生細胞培養 (図 4) の 3 週間の期間中 HFMs 中実行可能に残る。
HFMs の初代ラット骨格筋線維芽細胞 (RSMF) は、その後彼らは脱イオン水で 3 回が洗浄された N-メチル-2-ピロリドンの 3 つの交流による分解した 3 週間培養します。抽出されたマトリックス、通常外観で半透明に水和される (図 5 a)、残留高分子の存在のために適切な溶剤洗浄を受けるがいない場合、雲の水分補給時にする傾向があります。また、膜の分解の後残りの ECM がやや壊れやすい微細鉗子での取扱を必要とすることをする必要があります。ECM 繊維メッシュに組み立てられるし、して凍結乾燥は、オフホワイトの色と総縦配置 (図 5 b) と繊維状の外観を示します。
図 1: 鋳造中空糸膜の示すプロセス フローします。中空糸膜は、特定の材料の表に市販のコンポーネントからシステムを用いたユビキタス非溶媒誘起相分離法 (生理学研究所) を使用して製造されています。NMP のポリスルホン (17.8 w/w%) NMP ボア ソリューション (15 w/w% 水に NMP) 別ステンレス タンクから加圧 N2スピナレット、完全に沈殿させるスピナレット アウトレットで初期の中空糸膜を生成するのに押し出されると水道水の降水風呂と接触。初期の中空糸手動で誘導ガイドの 2.3 メートル毎分の割合で回転電動巻き取りホイールを収集します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 培養中空糸膜から ECM の生産を示す。中空糸膜は、線維芽細胞を播種、培養 3 週間、NMP の交換に続いて 3 x 3 の脱イオン水の交換 x。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 文化や ECM の抽出。非対称型メソ多孔質中空糸膜(A)は、補われたアスコルビン酸と TGF-β (B)DMEM/F-12 の RSMF セルで 3 週間培養しました。培養中空ファイバー (C, D上) n-メチル-2-ピロリドンの 3 交流による溶解、脱イオン水、ECM (D下) の継続的なスレッドの結果の 3 回を洗浄します。ECM 繊維表面(E)の電子顕微鏡顕微鏡高倍率。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 中空糸膜の生存率をセルします。代表的な中空糸膜 3 週間あった罰金かみそりを使用して、HFMs の内腔の表面を明らかにする区分で縦の RSMF 細胞の培養し、住んでいる死者染色カルセイン AM と EthD 1 を受けます。染色無視 EthD 1 蛍光と合流可能な細胞層の生存率。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ECM インプラントのアセンブリです。個々 の細胞外マトリックスのスレッド (n = 30) 派生した RSMF の文化からセル シリコーン型(A)に縦に置かれ、私は、RNAse A、およびペニシリン-ストレプトマイシン DNAse 処理後 1 %sds によって脱します。ECM の脱がして凍結乾燥、線維性外観と縦アーキテクチャ(B)オフホワイト メッシュを降伏します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
説明するプロセスは、一括 ECM バイオマテリアル体外膜として標準的な細胞培養器具の安価な大量生産を可能にするドライ ジェット湿式紡糸システムによってキャスト中空糸膜を使用しての生産を有効にします。説明システムが分離を目的として、細孔サイズ分布と中空ファイバーの寸法を変えることによって可変の膜の生産のため対応も可能このプロトコルで作製した膜は、細胞培養で使用中、スピナレット寸法、ポリマー使用、ドープし、流量、巻取り速度、および環境条件を退屈させます。13詳細なプロトコルは、中空糸膜を採用し、しかしオープンセルなど適切なトランスポート プロパティを持つ任意の溶ける細胞培養足場原則として発泡される可能性があります、以前作業7、に示すよう8,9。この一般的なアプローチは組織の内部アーキテクチャを模倣することができますより忠実にいけにえの足場で ECM 足場の生産のために有用であります。特にこのプロトコルによって生成されるインプラントの展示総配置 (図 5 b)、腱、靭帯、筋などの配向度の組織の再構築に向けて特定の利点があります。
定期的な交換媒体と、特に、アスコルビン酸と TGF β 中の摂取は ECM の生産に重要なコラーゲンの生合成に必要な酵素であり、TGF-β は、いくつかの ECM 蛋白質10 の合成を誘導するアスコルビン酸.また、NMP で ECM の徹底した洗浄を行う必要があります、それ以外の場合残留高分子水リンスの中に白のフィルムとして登場、抽出された ECM のままになります。それは比較的壊れやすい、過度に膜溶解中に ECM を扇動するために注意する必要があります。前述の潜在的なホストの異物反応を最小限に抑えるために異種のエピトープを削除する decellularization ステップに収集された ECM 足場向けの移植を受ける必要があります。
この手法の意義は、体の自身の創傷治癒プロセスによって改造することができます全体の細胞外マトリックスの biocomplex 足場の生産にあります。対象種に特定の細胞から ECM を生成するこの方法を使用することが可能; 生体材料のこのクラスの臨床的有効性を妨げる異物反応を最小限に抑える個人に特定のセルを使用して、さらに異物反応を軽減可能性があります。このアプローチは、組織固有の ECM が特定アプリケーション12で特に有効であるかもしれないことを示唆している最近のレポートで特定組織を対象の ECM の生産もできます。これはいくつかのセル型 (例えば筋肉、神経、血管内皮) から ECM を組み合わせることインプラント プロトコルは、様々 な細胞間で ECM の生産としては、構造と化学をより忠実に近似するインプラントを合わせてされる可能性があります。ターゲット組織の複雑さ。紹介 ECM メッシュは、もともと傷の修復のための足場として意図されていた、一方、彼らの細胞外マトリクス相互作用、durotaxis とバイオセンシングへの調査のためのプラットフォームとして使用場合もあります。特に、このアプローチは、組織特異 ECM の構造、構成および機能の生物学的意義への新しい洞察を可能にすることができる興味の特定の細胞型から ECM を生産する能力捜査官を貸します。
ここで紹介する ECM 生産手法改善の可能性は、代替のいけにえ足場材料およびアーキテクチャの調査と同様、ダイナミックな中古エアコン バイオリアクターの使用経由でスケール アップを含めることができます。特に、無溶剤型足場除去プロセスへの移行は抽出プロセスの安全性を向上無溶剤型 ECM 抽出14再生セルロースなどの酵素によって分解される材料から成るいけにえの足場ができます。これらの材料の引張強さは、合成材料の下ですが、様々 な培養条件があり、メディア製剤といけにえ足場形状の探査を含むこれらの足場の改善のためのいくつかの手段があります。最近の遺伝子工学の進歩は、ECM キャプチャのためのプラットフォームとの組み合わせで、臨床試験を要求を満たす足場の生産を有効にすることができるプロ線維細胞の生成に利用できます。さらに、既存の連続的なフロー ループ中空糸膜バイオリアクターよりとより迅速な ECM の生産を助長の栄養交換の率を促進し、これを活用することに特に興味がありますなど動的文化システム生物学的研究および臨床の ECM の大量生産の技術を使用します。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この出版物で報告された研究は、国立研究所の関節炎、筋骨格系および受賞番号 R15AR064481、国立科学財団 (CMMI-1404716) の下で健康の国民の協会の皮膚疾患によって支えられただけでなく、アーカンソーの生物科学研究所。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
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