Summary
이 프로토콜의 목표는 재생 비 계 임 플 란 트의 일환으로 전 임상 평가 위한 적당 한 상처 복구에 대 한 대상 전체 기질 섬유의 생산입니다. 이러한 섬유는 빈 섬유 막에 섬유 아 세포의 문화에 의해 생성 하 고 세포 막의 해체에 의해 추출.
Abstract
세포 외 기질 (ECM)에서 파생 된 설계 건설 기계 폐쇄 하 고 치유를 상처에 신속 하 게 그들의 잠재력에 대 한 의학에 구동된 상당한 관심을가지고. Fibrogenic 셀 문화에서 에 체 외에서 세포 외 매트릭스의 추출 임상 방해는 xenogeneic epitopes의 존재를 최소화 인간의-그리고 잠재적으로 환자 특정 셀 라인에서 ECM의 생성에 대 한 잠재력을가지고 일부 기존 ECM 제품의 성공입니다. ECM 이식 적합의 생체 외에서 생산에 중요 한 도전이 이다 ECM 생산 세포 배양에 의해 일반적으로 상대적으로 낮은 수익률의. 이 작품에서 셀 희생 빈 섬유 막 건설 기계 내에서 교양된으로 ECM의 생산에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 중공 사막은 fibroblast 세포 라인 전통적인 휴대 매체에 경작 그리고 ECM의 지속적인 스레드를 세포 배양 후 해산. 이 메서드에 의해 생성 결과 ECM 섬유 수 decellularized 고 동결 건조 된, 그것을 렌더링 하는 스토리지 및 이식에 적합.
Introduction
이식 외과 건설 기계는 상처 복구, 이식 복 벽 수리 혼자1매년 전세계 1 백만 이상의 합성 폴리머 메시의 정착 물. 그러나, 합성 물질 중합체는 전통적으로 이러한 장비의 제조에 사용 되는 주입에 따라 하는 경향이 이물질 응답, 이식의 기능에 해로운 염증의 결과로 및 조직2의 흉터를 자극합니다 . 또한, 주된 합성 메시 물자 (즉, 폴 리 프로필 렌)는 몸에 의해 분명 리 모델링 하지, 그들은 일반적으로 흉터을 어디 용납 될 수 있다, 조직에 적용 가능한 치료의 방향으로 그들의 임상 유용성을 제한 고차 함수 근육 같은 조직. 많은 외과 메쉬 제품을 임상 성공으로 적용 된 반면, 최근 제조 업체 회상 합성 수술의 극대화 임 플 란 트의 중요성을 강조 하는 메쉬 및 interspecies 조직 이식의 합병증 생체 적합성, 수술에 대 한 규제를 강화 하는 FDA 라는 메쉬 제조 업체3,4. 이식 환자 자신의 조직에서 파생 하는 장비의이 면역 반응을 감소 하지만 중요 한 기증자 사이트 사망률5에서 발생할 수 있습니다. 세포 외 기질 (ECM) 건설 기계 생산 체 외에 는 가능한 대안, decellularized ECM 건설 기계 전시 우수한 생체 적합성로 특히 헌 ECM의 경우 임 플 란 트6.
환자 조직 자가 이식에 대 한 수확의 한정 된 가용성 및 기증자 사이트에서 기능을 방해한의 위험, ECM 생산 능력을 생체 외에서 인간 세포 선의 문화에서 투어 또는, 만약에 가능 하다 면, 환자 자신의 셀 매력적인 대안 이다입니다. ECM에서 생체 외에서 의 상당한 금액의 제조에 있는 주요 과제는 이러한 어려운 캡처 분자의 격리. 이전 작품에서는, 우리는 증명 하고있다 ECM ECM 분 비 이식7, decellularized 수 있는 수익률 ECM 문화 기간 후 해산는 희생 폴리머 폼에서 섬유 아 세포를 배양 하 여 생산 될 수 있다 8,,910. ECM 생산에 폼은 폼의 내부 아키텍처를 채택 하는 경향이, 빈 섬유 막 (HFMs) ECM의 생산을 위한 희생 발판으로 탐구 했다. 여기에 설명 된는 방법 주어 실험실 규모 세포 문화 품질 빈 섬유 막과 같은 섬유 문화의 기간 뒤에에서 대량 기질 섬유의 추출의 제조에 대 한. 이 정적 문화 방식은 쉽게 채택할 수 있는 실험실 표준 포유류 세포 배양 장비를 포함 하 여입니다. ECM이 접근이 방식에 의해 생산은 다양 한 임상 응용으로 적용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 희생 중공 사막은 사용 하 여 세포 외 매트릭스의 생산
주의: N-메 틸-2-pyrrolidone는 자극 용 매 및 생식 toxicant. NMP에 노출 피부, 눈, 코과 목에 자극을 일으킬 수 있습니다. NMP를 처리할 때 용 매 저항 개인 보호 장비를 사용 해야 합니다. NMP의 사용 연기 후드 내에서 수행 되어야 합니다.
- 중공 사막은 polysulfone 폴리머 솔루션의 준비
- Polysulfone 펠 릿의 70 g의 무게 (35의 분자량 kD) 분석 균형을 사용 하 여 무게 보트에서.
- 깨끗 한 붕 규 산 플라스 크를 N-메 틸-2-pyrrolidone (NMP)의 314 mL (323.3 g)를 전송 합니다.
- 저 어 바를 교 반기에 NMP 그리고 장소 플라스 크와 플라스 크에 놓습니다. 교 반기 회전의 적당 한 속도를 설정 합니다.
- 건조 퍼 널을 사용 하 여 천천히 NMP와 함께 플라스 크에 polysulfone의 준비 70 g를 삽입.
- 3 일 동안 실내 온도에, 또는 무 균 때까지 저 어을 폴리머 "마약" 솔루션을 수 있습니다.
- 동심도 설정 하 고 빈 섬유 막 spinneret의 청소
참고: Spinnerets는 상업적으로 사용할 수; 올바른 spinneret 차원 성공적인 막 제조에 중요 한 고 자료의 테이블에에서 나열 됩니다. spinneret spinneret 바늘은 특히 허약으로 매우 부드럽게 처리 합니다.- 신중 하 게는 spinneret를 분해 하는 적절 한 드라이버 비트 드릴 또는 드라이버를 사용 합니다.
- 부드럽게 아세톤 입구와 출구의 수집 처리 유리 비 커에 어떤 아세톤 및 잔류 폴리머 spinneret 통해 흐름.
- 테이블 바이스에 위쪽으로 직면 하는 바늘은 spinneret의 상체를 보안 합니다.
- 상체에 spinneret의 콘센트 (아래) 본문을 놓습니다.
- 바이스에 고정 spinneret 바늘은 직접 콘센트 본문의 때까지 상체를 들고는 spinneret의 콘센트 시체를 옆으로 이동 합니다.
- 신중 하 고 천천히 spinneret 콘센트에서 보이는 바늘 중심으로 유지 하면서는 spinneret 두 개의 시체를 연결 하는 나사를 다시 삽입 합니다.
- Polysulfone 빈 섬유 막의 제조
- 45 mL N-메 틸-2-pyrrolidone의과 이온된 수, 이온된 수와 NMP의 15% 혼합물 형성의 255 mL를 포함 하는 "구멍 솔루션"을 준비 합니다.
- 동심 중공 섬유 막 spinneret 룸 온도 수돗물 목욕의 표면 위에 8 cm를 탑재 합니다.
- 적어도 350 mL의 내부 볼륨 있는 두 개의 별도 강철 압력 용기에는 spinneret의 폴리머 입구와는 spinneret의 구멍 입구를 연결 합니다. 두 배는 그들의 출구에 체크 밸브를가지고 있어야 합니다.
- 압력 용기의 각각 별도 N2 가스 실린더 조정기에 연결
- 준비 마약 솔루션 (~ 315 mL)을 삽입 하는 spinneret의 폴리머 입구에 연결 된 압력 용기에 깔때기를 사용 합니다. 그릇 상단의 단단히 밀폐 된 확인 하십시오.
- 사용 퍼 널은 준비를 삽입 하는 spinneret의 구멍 입구에 연결 된 압력 용기로 솔루션 (300 mL)를 낳았다. 그릇 상단의 단단히 밀폐 된 확인 하십시오.
- 열 구멍 선박에 대 한 체크 밸브 먼저, 다음 폴리머 선박 두 번째. spinneret 충분히 깨끗 한 경우에, 보어 솔루션 spinneret 콘센트에서 스트림 시작 됩니다.
- 두 배 1 psi 압력 시각적으로 폴리머와 보어 솔루션 결합 된 스트림을 문의 물 목욕으로 연속 화이트 필 라 멘 트 계기와 spinneret 종료 됩니다 확인 합니다.
- 목욕의 센터에서 롤러 아래 초기 섬유 안내 하 긴 집게를 사용 하 고 회전 바퀴는 모터에 연결 된 주위 초기 섬유를 바람.
- 감는 장치 바퀴와 분당 약 2 미터의 속도로 회전 하는 모터를 설정 합니다.
- 약간 조정 레 귤 레이 터 또는 정상 상태 흐름 달성 될 때까지 필요에 따라 감는 장치 바퀴 속도를 확인 합니다. 초기 섬유 물 목욕의 표면 가진 90 ° 각을 형성 한다.
- 닫기 N2 실린더 레 귤 레이 터 및 압력 용기 밸브를 확인 하 고 모든 고분자와 보어 솔루션 혈관에서 압출 된 후 감는 장치 바퀴 모터를 분리.
- 준비 된 중공 사막은 제거 하 고 교환 하는 이온된 수 잔여 용 매를 제거 하는 하루에 한 번씩 3 일 동안 이온된 물 욕조에 넣어.
- 압력가 마로 소독 하 여 중공 사막은 소독 30 분 또는 1 일 70% 에탄올에 대 한 그들을 immersing 하 여 121 ° C에서 그들.
- 셀 빈 섬유 막의 시드
참고: 모든 셀 문화 절차 biosafety 내각 내에서 수행 되어야 합니다.- PBS에서 소 플라즈마 fibronectin의 20 µ g/mL 솔루션 빈 섬유 막 치료 (pH = 7.4) 셀 첨부 파일 홍보 하.
- 분말된 소 플라즈마 fibronectin 무게 보트에서의 1 밀리 그램의 무게와 살 균 PBS의 1 mL에 용 해 (pH = 7.4) 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서.
- 30 분 동안 인큐베이터에서 1mg/mL 소 플라즈마 fibronectin 솔루션을 품 어. 살 균 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서 살 균 PBS의 49 mL에 솔루션을 추가 합니다.
- 1 시간 동안 5% CO2 와 37 ° c 배양 기에서 소 플라즈마 fibronectin의 준비 50 mL에 섬유를 품 어. 나중에 사용 및 4 ° c.에 살 균 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 저장소 fibronectin 솔루션을 가라앉 히 다
- 살 균 microscissors를 사용 하 여 섬유 원하는 길이로 잘라 (< 6 cm).
- 시드 1 mL 주사기 21-게이지 바늘을 사용 하 여 섬유 당 100000 세포 밀도에 빈 섬유 막의 루미나에 직접 씨앗 fibroblast 세포.
참고: 로드 주사기에 세포 현 탁 액을 준비 하기 위한 실용적인 대상 매체의 모든 30 microliters 100000 셀 서 스 펜 션 밀도입니다. - 6 시드 섬유 6 cm 직경 페 트리 접시에 놓습니다. 5% CO2 와 37 ° C에서 5 분 동안 품 어 하 시드 섬유를 허용 합니다.
- 부 화에서 시드 섬유를 제거 하 고 DMEM/F-12 포함 된 50 µ g/m l L-아 스 코르 빈 산 및 150 µ g/m l L-아 스 코르 빈 산 2 인산 염의 최종 농도에서 최대 3 주 동안 그들을 문화 (갓 준비 하 고 살 균 필터링), 5 ng/mL TGF-β1 (에서 살 균 필터링-20 ° C에 저장 된 aliquots), 그리고 6 cm 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 배양 접시에에서 1% 페니실린-스 Exchange 셀 중간 매 2 일입니다.
- PBS에서 소 플라즈마 fibronectin의 20 µ g/mL 솔루션 빈 섬유 막 치료 (pH = 7.4) 셀 첨부 파일 홍보 하.
- 교양된 빈 섬유 막에서 세포 외 매트릭스의 추출
- 장소는 집게를 사용 하 여 개별 섬광 유리병으로 섬유를 경작.
- NMP의 최대 5 mL 유리 피 펫을 사용 하 여 각 유리병에 넣으십시오.
- NMP, NMP의 3 개의 교류의 총 수행에서 빈 섬유를 담가. 천천히 1 mL 피 펫을 사용 하 여 추출 된 ECM의 찢 어 방지 하기 위해 오래 된 NMP 발음.
참고: 신선한 NMP를 추가할 때 그것은 도움이 유리병을 기울기 고 NMP, 측의 아래 실행 허용 그렇지 않으면 나머지 ECM 발판을 복종 된다 전단이 찢 어 될 수 있습니다. - NMP를 제거 하 고 씻어 서 이온된 수에 3 번 결과 ECM 스레드.
- 3 인치, 1 인치 폭의 길이에 실리콘 고무의 1/32 인치 두꺼운 시트 고는 8 m m 4mm 고무의 길이의 중앙에 직사각형 형에 의해 잘라.
- 30 분 동안 121 ° C에서 표준 3-인치 1 인치 현미경 슬라이드와 압력솥에 고무의 준비 조각을 놓습니다.
- 오픈 공간을 볼 수 있을 때까지 각 ECM 섬유를 8 m m에서 나란히 4 m m 실리콘 몰드로 하다.
- 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 금형을 놓고 완전히 고정 될 때까지-80 ℃에서 동결 합니다.
- 하룻밤 또는 완전히 건조 될 때까지 냉동된 ECM 메쉬를 lyophilize. Decellularization에 대 한 준비까지 4 ° C에서 메쉬를 저장 합니다.
2입니다. 세포 외 매트릭스의 decellularization
- 1% (w/w%) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 이온된 수에의 한 솔루션을 준비 합니다.
- 부드러운 동요와 로커에 실 온에서 24 시간 동안 1 %SDS 있는 형에서 추출 된 기질을 품 어.
- 린스는 세 번에 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 린스 당 PBS의 3 mL를 사용 하 여 부드러운 동요와 세포 외 기질을 추출.
참고: 린스 준비 장비의 찢을 최소화 하기 위해 부드럽게 수행 되어야 한다. - DNAse/RNAse 소화 버퍼 1 리터를 준비 합니다.
참고: DNAse/RNAse 소화 버퍼는 4 ° c.에 몇 달 동안 저장 될 수 있습니다.- Tris HCl의 1.54 g, MgCl2, 308 mg 및 별도 무게 보트에서 CaCl2 의 56 밀리 그램 무게.
- 저 어 바 큰 플라스 크에 이온을 제거 된 물 1 l Tris HCl, MgCl2및 CaCl2 를 결합 하 고 모든 구성 요소는 해산 때까지 휘저어.
- 멸 균 1 L 붕 병 및 4 ° c.에가 게에는 0.22 μ m 필터와 살 균 필터 소화 버퍼
- 5 mL DNAse/RNAse 소화 솔루션의 준비.
참고: 소화 솔루션 준비의 24 시간 안에 사용 되어야 한다.- 0.125 mg (50 구) DNAse의 무게는 무게에 나 보트 및 소화 버퍼의 5 mL을 추가.
- 소화 버퍼에 RNAse A 재고 솔루션의 75 µ L를 추가 합니다.
- 소화 솔루션 각 몰드를 6 시간 동안 4 ° C에서 품 어.
- 소화 솔루션을 발음 하 고 메 마른 PBS에 세 번 씻어.
- PBS를 발음 하 고 10% 페니실린-스 PBS에 4 ° c.에 하룻밤 사이에 건설 기계를 품 어
- 페니실린-스를 발음 하 고 메 마른 PBS에 건설 기계 세 번을 씻어.
- 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 금형을 놓고-80 ° c.에 동결
- 하룻밤 또는 완전히 건조 될 때까지 decellularized ECM 메쉬를 lyophilize.
- 사용 중인 4 ° C에서 살 균 컨테이너 biosafety 후드 내에서 건설 하는 동결 건조 된 기계를 전송 합니다.
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Representative Results
희생 건설 기계에서 세포 외 매트릭스의 성공적인 생산은 적절 한 비 계 제조, 세포 배양, 그리고 용 린스 절차에 관 하 우발적 이다. 빈 섬유 막의 제조는 상용 철강의 환대를 통해 폴리머 솔루션의 돌출을 사용 하 여 상업적으로 사용 가능한 구성 요소 (그림 1)에서 조립 드라이-제트 젖은 회전 시스템을 사용 하 여 수행 spinneret (내부 직경 0.8 m m, 외경 = = 1.6 m m) 물 목욕과 접촉 시 빈 섬유 막으로 침전 폴리머 솔루션의 초기 튜브를 생성 하기 위해.
HFMs에서 ECM 추출 예제 과정은 그림 2에 나와 있습니다. 그림 3A 는 손가락 같은 모는 비대칭 막의 특성의 외부 및 내부 레이어를 전시 polysulfone HFMs의 가로 단면 조작에서이 프로토콜을 보여 줍니다. 이 프로토콜에서 세포 막의 내부 루멘에 특히 시드 하 고 막의 모든 표면에 증식 하는 세포에서 6 cm 직경 접시 (그림 3B), 교양. 경작된 세포 막 수 다음 수 받게 일괄 NMP 표준 유리 섬광 튜브 (그림 3C)에 이온된 수 rinsing ECM (그림 3D)의 반투명 스레드를 생산. ECM 생산 세포 문화 (그림 4)의 3 주 기간에 걸쳐 HFMs 내부 가능한 남아 있습니다.
HFMs 기본 쥐 골격 근육 섬유 아 세포 (RSMF) N-메 틸-2-pyrrolidone의 3 개의 교류 통해 해산 했다 후 세 번 이온된 수에는 씻어 서 했다 그들은 3 주 동안 경작. 추출 된 매트릭스, 일반적으로 수 화 된 때 외관에 반투명 되 고 (그림 5A), 수 화에 따라 클라우드 경향이 있을 것 이다 하지 않을 경우 잔류 폴리머의 존재로 인해 적절 한 용 매 세 정 대상. 도 막의 해산 후 남은 ECM은 다소 연약한 좋은 집게와 취급에 주의 요구 주목 한다. ECM 섬유 메쉬로 조립 및 다음 동결 건조 된 전시는 오프 화이트 색상 및 총 경도 맞춤 (그림 5B)으로 섬유 외관.
그림 1: 중공 사막은 주조에 대 한 그림된 프로세스 흐름. 중공 사막은 특정 자료의 테이블에 나열 된 상업적으로 사용 가능한 구성 요소에서 준비 시스템을 사용 하 여 유비 쿼터 스 비 용 유도 단계 분리 방법 (일본군)를 사용 하 여 제조 된다. NMP에 Polysulfone (17.8 w/w%) 및 NMP 보어 솔루션 (15 w/w% 물에 NMP) 초기 빈 섬유 막 spinneret 콘센트는 완전히 침전 물에서 생성 하는 spinneret로 가압된 N2 에 의해 별도 스테인레스 스틸 선박에서 돌출 되어 따라 수돗물 강수량 목욕과 접촉. 초기 빈 섬유 가이드 가이드 동안 수동으로 이며 분당 2.3 미터의 속도로 회전 동력된 감는 장치 바퀴에 수집을 허용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 교양된 빈 섬유 막에서 ECM의 생산 그림. 빈 섬유 막 섬유 아 세포와 시드 및 교양 3 주 동안, NMP의 교환에 의해 따라 3 x와 교환 이온된 수 3의 x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 문화 및 추출 ECM의. 비대칭 mesoporous 빈 섬유 막 (A)는 RSMF 셀 DMEM/F-12에 TGF-β (B)와 보충된 의약품 3 주 동안 배양 되었다. 교양된 빈 섬유 (C, D 위) n-메 틸-2-pyrrolidone 3 교류 통해 해산 다음 세 번 연속 스레드 ECM (D, 하단)의 결과로 이온된 물에 씻어 서. 높은 확대 ECM 섬유 표면 (E)의 현미경 사진 전자 현미경 스캐닝. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 빈 섬유 막에는 가능성을 셀. 3 주 경도 HFMs의 luminal 표면 공개 좋은 면도기를 사용 하 여 구분 했다에 대 한 RSMF 세포와 함께 배양 하 고 살고 죽은 Calcein 오전 및 EthD-1 얼룩을 복종에 막을 대표 빈 섬유 생존 얼룩 무시할 수 EthD-1 형광으로 가능한 셀 confluent 레이어를 공개 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: ECM 임 플 란 트의 조립. 개별 세포 외 기질 스레드 (n = 30) 파생 된 RSMF의 문화에서 셀 실리콘 몰드 (A) 에 세로로 배치 하 고 나, RNAse A 및 페니실린 스 DNAse 치료 뒤 1 %SDS 의해 decellularized. Decellularized ECM은 다음 동결 건조 된, 섬유 모양와 경도 아키텍처 (B)미색 메쉬 저조한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
설명 하는 프로세스의 대량 ECM 생체 재료에서 생체 외에서 중공 사막은 표준 셀 문화 장비 뿐만 아니라 세포 막의 저렴 한 대량 생산을 위한 수 있도록 드라이-제트 젖은 회전 시스템에 의해 캐스팅을 사용 하 여 생산 가능 이 프로토콜에서 조작 막 사용 하기 위한 세포 배양에서 하는 동안 설명 하는 시스템 또한 목적을 위해 분리, 기 공 크기 분포 및 빈 섬유 크기 가변 변화 하 여 막의 생산을 위해 적용할 수 있습니다. spinneret 크기, 폴리머 사용, 마약 하 고 보어 유량, 감는 속도, 그리고 환경 조건. 13 상세 프로토콜 중공 사막은 고용, 하지만 원칙적으로 어떤 분해할 수 있는 세포 배양 발판 오픈 셀 등 적절 한 전송 속성을 폼 사용할 수, 이전 작업7, 에서 같이 8,9. 이 일반적인 접근 방식을 나타납니다 더 충실 하 게 조직의 내부 아키텍처를 흉내낼 수 있는 희생 건설 기계에 의해 ECM 장비의 생산에 유용. 특히이 프로토콜에 의해 생산 하는 임 플 란 트 전시 총 정렬 (그림 5B), 힘 줄, 인 대 및 골격 근육 등 매우 정렬 된 조직의 재건을 향해 특정 혜택의 수 있습니다.
일반 교환 매체의 및, 특히, 의약품 및 TGF-β와 매체의 보충은 ECM의 생산에 중요 한 의약품은 콜라겐 생 합성에 필수적인 효소와 여러 ECM 단백질10의 합성을 유도 하는 TGF-β . 또한, NMP와 ECM의 철저 한 rinsing를 수행 해야 합니다, 그리고 그렇지 않으면 잔류 폴리머 물 린스 중 흰색 필름으로 나타나는 추출 된 ECM에 유지 됩니다. 그것은 상대적으로 취약 하지 지나치게 막 해산, 동안 ECM를 선동 하 배려를가지고 한다. 잠재적인 호스트 이물질 반응을 최소화 하기 위해 xenogeneic epitopes를 제거 하려면 설명 된 대로 decellularization 단계를 주입을 위한 수집된 ECM 건설 기계를 받게 해야 합니다.
이 기술의 중요성 신체의 자신의 상처 치유 과정에 의해 개장 될 수 있는 전체 세포 외 매트릭스의 biocomplex 발판의 생산에 있다. 를 사용 하 여이 접근 대상 종에 특정 세포에서 ECM 생산 하 수도 바이오;의이 클래스의 임상 효과 방해 하는 이물질 응답을 최소화 하기 위해 개인에 게 특정 셀을 사용 하 여 이물질 응답을 더 줄일 수 있습니다. 이 방법은 또한 조직 전용 ECM12특정 응용 프로그램 특히 효과가 있을 수 있습니다 제안 하는 최근 보고서를 대상으로 특정 조직, ECM의 생산에 대 한 수 있습니다. 이 ECM을 결합 하 여 여러 가지 세포 유형 (예: 근육, 신경, 내 피)에서 임 플 란 트 프로토콜을 통해 다양 한 셀 라인, ECM의 생산에 대 한 사용으로 구조와 화학을 더 충실 하 게 임 플 란 트에 맞게 사용 될 수 있습니다. 대상 조직의 복잡성입니다. 여기에 제시 된 ECM 메시 상처 복구에 대 한 건설 기계로 원래 예정 되었다, 그러나 그들은 또한 상호 작용 세포-ECM, durotaxis, 및 바이오 센 싱에 대 한 조사를 위한 플랫폼으로 사용 하 여가 있을 수 있습니다. 특히,이 이렇게 ECM에 대 한 새로운 조직 ECM 구조, 구성 및 기능의 생물학 의미 수 있습니다 관심의 특정 세포 유형에서 생산 하는 능력을 조사를 준다.
여기에 제시 된 ECM 생산 기술에 잠재적인 개선 스케일 업 대체 희생 비 계 재료와 아키텍처의 탐사로 서 역동적이 고 미리 에어컨 bioreactors의 사용을 통해 포함할 수 있습니다. 특히, 무용제 비 계 제거 프로세스 전환 추출 과정;의 안전을 개선 하는 것 재생된 셀 룰 로스와 같은 효소에 의해 분해 되는 물질의 구성 희생 건설 기계 무용제 ECM 추출14에 대 한 수 있습니다. 이러한 재료의 인장 강도 합성 물질의 아래, 다양 한 문화, 미디어 공식, 조건과 희생 비 계 형상의 탐사를 포함 한 이러한 장비의 개선에 대 한 여러도 존재 한다. 최근 유전 공학 발전 프로 거리 셀 라인, ECM 캡처 플랫폼 함께에서 임상 요구를 만족 하는 장비의 생산을 가능 하 게 수 있습니다.를 생산 하기 위해 활용 될 수 있습니다. 또한, 기존 연속 흐름 루프 빈 섬유 막 bioreactors 영양소 exchange 더 중대 하 고 더 빠른 ECM 생산에 공헌의 높은 속도 촉진 하 고 이것을 활용에 특히 관심이 있을 수 있습니다 같은 동적 문화 시스템 대량 ECM의 생물 학적 연구와 임상의 생산을 위한 기술을 사용 합니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 간행물에 보고 된 연구 국립 연구소의 관절염과 Musculoskeletal 및 보너스 번호 R15AR064481, 국립 과학 재단 (CMMI-1404716)에서 국립 보건원의 피부 질환에 의해 지원 되었다 뿐만 아니라 아칸소 생물 과학 연구소입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
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