Summary
Denne protokol beskriver en monolayer, serum-fri metode til effektivt at generere hepatocyte-lignende celler fra humane pluripotente stamceller (hPSCs) i 18 dage. Dette indebærer seks trin som hpscs sekventielt differentiere til mellemliggende celle-typer såsom primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut og lever opløbet forfædre før dannelse hepatocyte-lignende celler.
Abstract
Leveren afgifte skadelige stoffer, udskiller vitale proteiner, og udfører vigtige metaboliske aktiviteter, dermed opretholde livet. Derfor leversvigt — som kan være forårsaget af kronisk indtagelse af alkohol, hepatitis, akut forgiftning, eller andre fornærmelser — er en alvorlig tilstand, der kan kultivere i blødning, gulsot, koma, og i sidste ende døden. Men, tilgange til behandling af leversvigt, samt undersøgelser af leverfunktion og sygdom, er blevet forpurret delvis af manglen på en rigelig forsyning af humane leverceller. Med henblik herpå indeholder denne protokol en detaljeret beskrivelse af den effektive differentiering af humane pluripotente stamceller (hPSCs) i hepatocytter-lignende celler, som styres af en udviklings køreplan, der beskriver, hvordan lever skæbnen specificeres i seks på hinanden følgende differentierings trin. Ved at manipulere udviklingsmæssige signalerings veje for at fremme lever differentiering og eksplicit undertrykke dannelsen af uønskede celle skæbner, genererer denne metode effektivt populationer af humane lever opløbet progenitorer og hepatocytter-lignende celler ved dage 6 og 18 i henholdsvis PSC-differentieringen. Dette opnås gennem den tidsmæssigt præcise kontrol af udviklingsmæssige signalerings veje, der udøves af små molekyler og vækstfaktorer i et serumfrit kulturmedium. Differentiering i dette system forekommer i monolag og udbytter hepatocyt-lignende celler, der udtrykker karakteristiske hepatocyt enzymer og har evnen til at forankret en musemodel af kronisk leversvigt. Evnen til effektivt at generere et stort antal humane leverceller in vitro har forgreninger til behandling af leversvigt, for Drug screening, og for Mekanistiske undersøgelser af leversygdom.
Introduction
Formålet med denne protokol er effektivt at differentiere humane pluripotente stamceller (hpscs) til berigede populationer af lever opløbet forfædre og hepatocyte-lignende celler2. Adgang til en klar levering af humane lever progenitorer og hepatocyte-lignende celler vil fremskynde bestræbelserne på at undersøge leverfunktion og sygdom og kunne muliggøre nye cellulære transplantations terapier for leversvigt3,4, 5. Dette har vist sig udfordrende i fortiden, da hPSCs (som omfatter embryonale og inducerede pluripotente stamceller) kan differentiere i alle celle-typer af den menneskelige krop; Det har derfor været vanskeligt udelukkende at skelne dem til en ren population af en enkelt celletype, såsom leverceller6.
For præcist at differentiere hPSCs i leverceller, først er det afgørende at forstå ikke kun hvordan leverceller er specificeret, men også hvordan ikke-lever celle-typer udvikle. Viden om, hvordan ikke-leverceller udvikle er vigtigt at logisk undertrykke dannelsen af ikke-leveren nedstamningens under differentiering, og dermed udelukkende vejlede hpscs i retning af en lever skæbne2. For det andet er det vigtigt at afgrænse de mange udviklingsmæssige trin, hvorigennem hPSCs differentierer mod en lever skæbne. Det er kendt, at hpscs sekventielt differentiere i flere celle-typer kendt som primitive streak (APS), definitive endoderm (de), posterior foregut (PFG) og lever bud forfædre (lb) før danner hepatocyte-lignende celler (HEP). Tidligere arbejde afslørede de signaler, der specificerer leveren skæbne og de signaler, som undertrykt dannelsen af alternative ikke-leveren celle-typer (herunder mave, bugspytkirtel, og tarm progenitors) på hver udviklingsmæssige Lineage valg2, 7 , 8.
Kollektivt, disse indsigter har givet anledning til en serum-fri, enkeltlags metode til at differentiere hpscs mod primitive streak, definitive endoderm, posterior forgut, lever bud forfædre og endelig, hepatocyte-lignende celler2. Samlet metoden indebærer såning af hpscs i en enkeltlags i en passende tæthed, forbereder seks cocktails af differentiering medier (indeholdende vækstfaktorer og små molekyler, der regulerer forskellige udviklingsmæssige signalering veje), og sekventielt tilføje disse medier til at inducere differentiering i løbet af 18 dage. Under processen, ingen passaging af celler er nødvendig. Bemærk, fordi denne metode eksplicit omfatter signaler, der undertrykker dannelsen af ikke-lever celle-typer, denne differentiering tilgang1 mere effektivt genererer lever progenitorer og hepatocyte-lignende celler i forhold til eksisterende differentierings metode2,9,10,11,12. Desuden giver den protokol, der er beskrevet i denne tekst, mulighed for hurtigere generering af hepatocytter, som i sidste ende udtrykker højere niveauer af hepatiske transkriptionsfaktorer og enzymer end dem, der produceres af andre protokoller9,10 , 11 , 12.
Den her beskrevne protokol har visse fordele i forhold til de nuværende differentierings protokoller. For det første, det indebærer enkeltlags differentiering af hpscs, som er teknisk enklere i forhold til tredimensionelle differentierings metoder, såsom dem, der er afhængige af embryooide organer13. For det andet udnytter denne metode et nyligt fremskyndet, hvorved definitive endoderm-celler (en tidlig forløber for leverceller) kan genereres effektivt og hurtigt inden for 2 dage efter hpsc-differentiering på2,7, hvilket gør det muligt at fremstilling af hepatocytter med øget renhed. For det tredje, i side-by-side sammenligninger, hepatocyte-lignende celler produceret af denne metode2 PRODUCERE mere ALBUMIN og udtrykke højere niveauer af hepatiske transkriptionsfaktorer og enzymer i forhold til hepatocytter produceret i andre metoder10, 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af differentierings medier
Bemærk: Der henvises til tabellen over materialer for producentens oplysninger om de anvendte materialer og reagenser.
-
Klargøring af base kemisk definerede medier (CDM)
Bemærk: CDM2, CDM3, CDM4 og CDM5 er kemisk definerede medier, der bruges som base medier til at differentiere hPSCs til leverceller på forskellige stadier. Sammensætningen af disse medier kan findes i tabel 1.- For at lave CDM2 eller CDM3 skal du tilberede en stamopløsning, der indeholder polyvinylchlorid alkohol (PVA). 0,5 g PVA pulver opløses i 50 mL Iscove modificerede Dulbecco's medium (IMDM) for at generere en 10 mg/mL PVA-bestand.
Bemærk: Da PVA ikke let opløses, forberedes PVA/IMDM-blandingen i en konisk kolbe med kontinuerlig omrøring ved ~ 50 °C på en varmepude; omrøring kan nemt opnås ved hjælp af en magnetisk omrører. - Når PVA er homogent opløst i IMDM, skal PVA-opløsningen fjernes fra varmepuden, og den kan afkøles til stuetemperatur.
- Brug et sterilt 0,2 μm filter til at filtrere PVA-opløsningen.
- Forbered CDM2 og CDM3 ved at kombinere den filtrerede PVA fra trin 1.1.1 og forskellige kommercielt købte komponenter som beskrevet i tabel 1 og tabellen over materialer. Brug sterile 0,2 μm filterenheder til at filtrere alle medier.
Bemærk: Base mediet kan opbevares ved 4 °C, men ikke længere end 2 måneder. - Forbered de resterende base medier CDM4 og CDM5 efter tabel 1.
- For at lave CDM2 eller CDM3 skal du tilberede en stamopløsning, der indeholder polyvinylchlorid alkohol (PVA). 0,5 g PVA pulver opløses i 50 mL Iscove modificerede Dulbecco's medium (IMDM) for at generere en 10 mg/mL PVA-bestand.
-
Forberedelse af differentierings medier
- At forberede stamopløsninger for de små molekyler og vækstfaktorer, rekonstruere dem som pr producentens anbefalinger. Til opbevaring, alikvot til sterile rør til at reducere fryse-tø cyklusser og holde ved-20 °C eller som anbefalet.
Bemærk: Sammensætningen af det differentierings medium, der skal anvendes ved forskellige differentierings stadier, er beskrevet i tabel 2 og i de følgende trin. - For at forberede differentierings mediet skal du først tø de frosne små molekyler og/eller vækstfaktorerne ved stuetemperatur. Dernæst skal den nødvendige mængde af basis mediet alikvot. Endelig forberedes de endelige differentierings medier ved at tilføje de specificerede små molekyler og vækstfaktorer til basis mediet ved de relevante koncentrationer (tabel 2).
Bemærk: Frisk tilberedt differentierings medium bør ideelt set anvendes samme dag; ellers kan den opbevares ved 4 °C og anvendes inden for tre dage. - Brug en pipettespids til at blande differentierings mediet flere gange for at sikre, at kosttilskud er homogent fordelt, før du tilføjer mediet til cellerne (f. eks. tilsættes 1 mL differentierings medium til hver brønd af en 12-brønd plade.)
- At forberede stamopløsninger for de små molekyler og vækstfaktorer, rekonstruere dem som pr producentens anbefalinger. Til opbevaring, alikvot til sterile rør til at reducere fryse-tø cyklusser og holde ved-20 °C eller som anbefalet.
2. frøhpscs på plader i definerede tæthedsgrader til differentiering
- Coat cellekultur plast, der vil blive brugt til såning med hPSCs.
- Tø matricen (f. eks. Geltrex) ved 4 °C natten over før brugs dagen.
- Den næste dag fortyndes matrixen 1:100 ved at lægge 500 μL af matrixen i 50 mL kold Dulbecco's modificerede ørne medium (DMEM)/F12. Da matrixen er en hydrogel, der irreversibelt polymeriserer ved udsættelse for stuetemperatur, når du arbejder med matrixen, skal du altid holde matrix rørene og medierne på isen.
- Bemærk: Matrixen opløst 1:100 i DMEM/F12 kan opbevares ved 4 °C, men bør anvendes inden for 2 måneder.
- For at belægge en kultur plade med matrixen, pipetteres den fortyndede matrix i det påkrævede antal brønde ved hjælp af lige nok volumen af matrix opløsning til at dække overfladen af brønden (f. eks. tilsættes 0,5 mL matrix til en brønd af en 12-brønd plade eller 1 mL til en brønd af en 6- brønd plade). Hvis det er nødvendigt, rystes pladen forsigtigt for at sikre, at matrix opløsningen fuldt ud har dækket bunden af brønden.
- Læg den matrix belagte plade i en 37 °C-inkubator i mindst 60 min. Ved denne temperatur polymeriserer matrixen til dannelse af en tynd film i bunden af brønden.
- Bemærk: Matrix belagte plader kan opbevares i 37 °C inkubator og anvendes inden for 3 dage, så længe matrixen ikke er tørret op.
- Indsug den resterende matrix opløsning fra de coatede brønde umiddelbart før såning af brøndene med hPSCs.
- Passaging og såning af de coatede plader med hPSCsNOTE: dissociations midlet indeholder enzymer, der dissocierer celler, og det er vigtigt at lade hPSCs i dissociations agenten være så kort som muligt.
- For at lægge matrix belagte kultur plader med hPSCs før differentiering, skal du dyrke udifferentierede hPSCs for at > 70% konfluency i kommercielt tilgængelig mTeSR1 medium (tabel over materialer) i henhold til producentens protokol. Det er vigtigt at passere hPSCs, før de bliver fuldt ud flydende, da hPSCs spontant kan skelne ved høj sammenløbet.
Bemærk: hpscs skal karyoskrives for at sikre, at der ikke er kromosomale abnormaliteter, før de anvendes til eksperimenter. De hpscs, der anvendes til denne differentiering protokol blev opretholdt i mTeSR1 medier og urerne som klumper med EDTA at minimere karyotypiske abnormiteter. Karyotypisk-unormale hPSCs bør ikke anvendes til differentiering, da de kan formere sig unormalt hurtigt; således den celle-såning tætheder anbefales her er ikke egnet til karyotypisk-unormale celler. - For at lægge hPSCs til differentiering, aspirere mTeSR1 fra stort set-confluent hPSC kulturer plade og tilføje kommercielt købte dissociations middel (tabel over materialer) at adskille hpscs, ved hjælp af lige nok dissociations middel til at dække overfladen af brønd eller fad, hvor cellerne vokser (f. eks. tilsættes 0,5 mL dissociations middel pr. brønd af en 12-brønd plade, 1 mL pr. brønd af en 6-brønd plade eller 3 mL pr. 10 cm skål).
- Inkubér hPSCs i dissociations midlet ved 37 °C i 5 minutter, eller indtil nogle kolonier begynder at løsne sig. Tryk forsigtigt bunden af brønden/pladen flere gange; efter flere minutters dissociation bør de fleste hPSC-kolonier frit komme i suspension.
- For at adskille hPSCs fra pladen tilsættes 2 mL/brønd af DMEM/F12, hvis der arbejdes med en 6-brønd plade (eller 1 mL/brønd, hvis der arbejdes med en 12-brønd plade) for at fortynde dissociations midlet. Brug en 5 mL serologisk pipette til forsigtigt at pipettere op og ned flere gange for at vaske alle cellerne fra brøndens overflade. Saml opslæmmede enkeltceller i et 50 mL konisk rør. Vask pladen en gang til med det samme volumen DMEM/F12 for at sikre, at alle Hpsc'er er genbrugt.
- Til det 50 mL koniske rør, der indeholder cellerne, tilsættes DMEM/F12 for at fortynde den oprindelige volumen af dissociations midlet med 1:5-1:10 (f. eks. Hvis det oprindelige volumen af dissociations midlet var 1 mL, justeres det totale volumen af cellesuspensionen til 10 mL med DMEM/F12 for at fortynde dissociations agenten ved 1:10)
- De indsamlede hPSCs centrifugeres i et 50 mL konisk rør ved 350 x g i 3 minutter ved 4 °c til pellet celler.
- Mens du venter på cellerne til at pille, aspirere matrix fra pladen, hvor hPSCS vil blive seedet. Dernæst tilsættes tilstrækkelige mængder af mTesR1 suppleret med 1 μM kommercielt opnået thiazovivin (en farmakologisk klippe hæmmer) til recipient brønde til at dække dem (f. eks tilsæt 0,5 mL mTeSR1 pr brønd af en 12-brønd plade eller 1 mL mTeSR1 pr brønd af en 6-brønd plade).
Bemærk: Thiazovivin ved en lav koncentration er inkluderet på dette trin for at øge enkelt cellens overlevelse og dermed den efterfølgende såning tæthed af hPSCs. - Efter centrifugering af hPSCs, aspirerer du forsigtigt supernatanten og forlader de pelleterede hPSCs i bunden af det koniske rør. Supernatanten indeholder dissociations middel, som vil hæmme efterfølgende adhæsion af hPSCs, og det er derfor vigtigt at aspirere det store flertal af supernatanten, før du fortsætter.
- Resuspension af celle pellet i mTeSR1 suppleret med 1 μM thiazovivin. Med en P1000-pipette, triturere forsigtigt 2-3 gange for jævnt at resuspendere celle pellet i en enkelt cellesuspension. Må ikke over-triturate celle pellet som overdreven mekanisk kraft vil beskadige hPSCs og føre til dårlig celle overlevelse.
- Efter opblanding af hpscs, pipette straks 10 μl af suspensionen til et hemocytometer og tælle antallet af celler. Det er vigtigt at pipettere celler til optælling så hurtigt som muligt, som tyngdekraften vil føre til hPSCs naturligt at bosætte sig i bunden af 50 mL røret, som vil tolerere nøjagtig celletælling.
- Juster lydstyrken på de opslæmmede hPSCs med thiazovivin-suppleret mTeSR1 for at opnå den ønskede celle koncentration til plating. For eksempel, efter justering af volumen af opslæmmede hPSCs, tilsættes 0,5 mL af cellesuspensionen pr brønd til frø 160000-250000 celler i hver brønd af en 12-brønd plade, således at opnå en samlet volumen på 1 mL i hver brønd (0,5 mL af medierne blev tilføjet til brønden i trin 2.2.7). Hvis der anvendes større eller mindre brønde, skalerer celle numrene/medie volumener op eller ned i overensstemmelse hermed.
Bemærk: Det er vigtigt at frøhpscs ved den angivne celletæthed. Overdreven-confluent hPSCs vil ikke skelne effektivt og under-confluent hPSCs vil ikke overleve godt under differentiering. - Ryst pladen i et Krydsmønster (venstre og derefter til højre; fremad og bagud) flere gange for at sikre, at cellerne er jævnt fordelt over pladen/brønden. Undlad at hvirvle pladen i en cirkulær bevægelse, da cellerne vil bosætte sig i midten af pladen/brønden. Typisk, hPSCs vil begynde at overholde overfladen af brønden inden ~ 3-30 min. Lad cellerne vokse i mindst 24 timer, før differentieringen påbegyndes.
- For at lægge matrix belagte kultur plader med hPSCs før differentiering, skal du dyrke udifferentierede hPSCs for at > 70% konfluency i kommercielt tilgængelig mTeSR1 medium (tabel over materialer) i henhold til producentens protokol. Det er vigtigt at passere hPSCs, før de bliver fuldt ud flydende, da hPSCs spontant kan skelne ved høj sammenløbet.
3. differentiering af hPSCs i Endodermal celler og lever Progenitorer
- Efter at hPSCs er blevet belagt i mindst 24 timer (som beskrevet i trin 2.2.12), skal du kontrollere morfologien af celler under en fasekontrast mikroskop med særlig vægt på diameteren og tætheden af de belagte hPSC-kolonier.
Bemærk: Ideelt set bør klumper være let fordelt og af passende størrelse og tæthed i brønden før trin 3,2. Store (ca. > 400 μm) eller små kolonier (ca. < 200 μm) af hPSCs er ikke brugbare til differentiering (figur 4). Differentierings signalerne vil ikke virke jævnt i store hPSC-kolonier, hvilket fører til ineffektiv differentiering. Kolonier, der er for små, overlever ikke godt i de første 3 dage af hPSC-differentieringen i denne differentierings protokol. Hvis tætheden af seedede hPSCs er korrekt, vil hPSC kolonier ofte danne "broer" af celler mellem dem, og den samlede sammenløbet vil være ~ 30-50% før du tilføjer dag 1 differentiering medium (figur 4). - Hvis koloni størrelser er ideelle i trin 3,1, Fortsæt til dag 1 af differentiering, hvilket indebærer differentiering af hpscs i forreste primitive streak (APS).
- Forbered dag 1 APS differentierings medium ved at blande alle reagenser, som er skitseret i tabel 2 , med CDM 2 (tabel 1 og punkt 1,2) som basis medium. Pipet til at blande flere gange for at sikre jævn fordeling af komponenterne i medierne.
- Aspirer til at fjerne thiazovivin suppleret mTeSR1 fra de belagte hPSCs og kortvarigt vaske hPSCs med IMDM medier. Må ikke vaskes med fosfat bufferet saltvand (PBS) i stedet for IMDM, da PBS mangler calcium ioner (ca2 +) og er derfor giftigt for hPSCs; det vil forstyrre celle morfologi.
- Efter den korte IMDM vask, tilsæt dag 1 medium til hPSCs. Registrer tiden og Placer cellerne tilbage i 37 °C-inkubator
- Fortsæt med de efterfølgende differentierings trin ved at forberede (tabel 2) og tilføje det respektive differentierings medium til cellerne på de respektive dage (med 24 timers intervaller) for differentiering omkring samme tidspunkt på dagen (figur 1). Udskift med friske medier dagligt, selv om sammenhængende dage med differentiering bruger de samme differentierings medier. Mellem medieændringer, vaske celler én gang med IMDM medier til at fjerne døde celler og rester af tidligere medium komponenter.
- Som differentiering skrider ud over leveren opløbet fase, cellenumre stige og dermed tilføje flere medier til hver brønd af pladen for at sikre, at mængden af differentiering faktorer og næringsstoffer ikke er begrænsende. For eksempel tilsættes 1 mL differentierings medium til hver brønd på 12-godt i første omgang på dag 1 til 6 af differentiering, men Tilsæt 1,5-2 mL af efterfølgende differentierings medier på senere dage med differentiering (dag 7 til 18 i differentiering).
4. karakterisering af Endodermal celler og lever Progenitorer ved immun farvning
- Forbered blokerende buffer: 10% æsel serum + 0,1% Triton X100 i deioniseret fosfat bufferet saltvand (DPBS).
- Forbered farvnings buffer: 1% æsel serum + 0,1% Triton X100 i DPBS.
- Aspirere medium fra celler i 12-brønd plade.
- Tilsæt 4% PARAFORMALDEHYD (i DPBS) i 15 minutter ved stuetemperatur for at fastsætte cellerne, og vask derefter cellerne to gange med DPBS.
- Tilføj blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur for at blokere og permeabilisere de faste celler.
- Opsug blokerings opløsningen, og tilsæt primært antistof fortyndet i farvnings bufferen. (Se tabel over materialer til fortyndingsforhold af antistoffer.)
- Pletter cellerne natten over ved 4 °C.
- Vask cellerne tre gange med 0,1% Triton X100 i DPBS.
- Tilsæt sekundær antistof bejdsning i farvnings bufferen i 1 time ved stuetemperatur. (Se tabel over materialer til fortyndinger af sekundære antistoffer.)
- Fjern det sekundære antistof og tilsæt DAPI i 5 minutter ved stuetemperatur for at udføre nuklear kontra bejdning.
- Vask to gange med 0,1% Triton X100 i DPBS for at fjerne overskydende antistof og DAPI.
- Udfør Fluorescens mikroskopi med en Zeiss-observatør D1. Alternativt kan du opbevare pladen i 4 °C, indtil der udføres billeddannelse. For forventede resultater, se figur 3.
5. karakterisering af lever Progenitorer ved fluorescens aktiveret Cell-sortering (FACS) analyse
Bemærk: Brug FACS til præcist at kvantificere procentdelen af AFP + differentierede LB-celler, der opstår ved dag 6 af differentiering. Følg de samme trin for at kvantificere procentdelen af ALB + differentierede hepatocytter efter dag 18 af differentiering.
- Konjugat anti-AFP-antistoffer.
- Der tilsættes R-phycoerythrin til anti-AFP-antistoffer i en koncentration på (0,55 μg/μL) ved hjælp af R-phycoerythrin konjugering Kit (Se tabel over materialer).
Bemærk: Sørg for, at antistofferne er renset og rekonstitueres i buffere, der ikke indeholder aminer. Sørg for, at mængden af antistof, der anvendes i en mærknings reaktion, skal være mindre end mængden af PE (dvs. 60 μg antistof med 100 μg PE). Dårlig konjugering af antistoffer kan føre til upålidelige resultater. - Der tilsættes 1 μL modifikatorreagens for 10 μL antistof, som skal mærkes. Bland forsigtigt.
- Fjern R-PE-blandingen (100 μL) og afpipettere ovennævnte blanding direkte i det frysetørede R-PE-materiale.
- Anbring hætten tilbage, og lad hætteglasset stå i 3 timer i mørke ved stuetemperatur.
- Efter inkuberet i 3 timer eller mere tilsættes 1 μL QUENCHER-reagens til 10 μL af det anvendte antistof. Konjugaten kan anvendes efter 30 min.
- Opbevar konjugeret antistof ved 4 °C.
- Vask differentierede eller udifferentierede hPSCs i 6-Well-format med DMEM/F12.
- Behandl kortvarigt med dissociations middel (1 mL/brønd i en 6-brønd plade) i 5 minutter ved stuetemperatur, indtil cellerne løsnes. Høst og pletter både udifferentieret hPSC og differentierede leverprogenitorceller identisk og analysér parallelt i det samme eksperiment for at sikre specificitet af antistof farvning.
- Tap forsigtigt på Petri skålen for at frigøre cellerne. Brug en P1000-pipette til at fjerne cellerne fra pladen og samle cellerne i et 50 mL konisk rør. Sørg for, at cellerne for det meste er løsrevet, før du fortsætter med næste trin. Derefter vaskes brønde to gange mere med 1xDPBS buffer til at indsamle resterende celler.
- I det 50 ml koniske rør, fortyndet dissociations middel i ~ 5 volumener af 1x DPBS buffer. Triturate strengt 3-4 gange med en P1000 pipette for at sikre, at alle celler adskilles i enkeltceller.
Bemærk: Det er bydende nødvendigt at generere enkeltceller før centrifugering eller klumper efterfølgende ikke kan adskilles med lethed. Men, ikke over-triturate da dette kan beskadige celle integritet. Tæl antallet af celler og brug den anbefalede andel af celler til antistof ratio, som tidligere er optimeret til minimal baggrund og maksimal signaldetektering. - Centrifuge konisk slange indeholdende cellesuspensionen ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °c.
- Aspirer supernatanten med omhu for ikke at forstyrre celle pellet.
- Resuspendere celle pellet grundigt i fiksering/Perm buffer til at generere en enkelt cellesuspension og Fix på is ved 4 °C i 20 min. Bemærk at overføre til et 2 mL mikrocentrifuge glas. Desuden gør brugen af et 2 mL mikrocentrifuge glas på dette trin celle pellet til deponering ved det V-formede hjørne af røret, hvilket minimerer celltab under skylningen.
- Hver pille vaskes med 1,8 mL Perm/vaskebuffer to gange. Resuspension celle pellet grundigt i Perm/vask buffer ved pipette blande 6 gange med en P1000 pipette. Derefter centrifugeres, fjernes supernatanten, og vaskeprocessen gentages med 1,8 mL Perm/vaskebuffer.
- Resuspension celle pellet i Perm/vask buffer, således at der vil være 100 μL/individuel plet og derefter overføre cellesuspensionen til en 2 mL mikrocentrifuge tube.
Bemærk: Det er bydende nødvendigt at generere en enkelt cellesuspension på dette trin forud for antistof farvning. Aggregater af celler vil ikke blive plettet og dermed vil forvirre FACS analyse. Desuden gør brugen af et 2 mL mikrocentrifuge glas på dette trin celle pellet til deponering ved det V-formede hjørne af røret, hvilket minimerer celltab under skylningen. - Efter suspension celler i FACS buffer, alikvotere i individuelle 2 mL rør (for både uplettet kontrol og antistof-farvede prøver).
- Pletten med anti-AFP-PE 0,33 μL pr. 150.000 celler i 30 minutter ved stuetemperatur i mørket. For eksempel for en 100 μL individuel bejdning, plet som følger: 0,33 μL a-AFP PE og 100 μL Perm/vaskebuffer. Resuspendere celler med P200 pipette godt for at sikre selv farvning.
Bemærk: Kun pipette-mix og ikke vortex, da dette kan reducere protein stabiliteten. - Vask, resuspension cellerne to gange i 1-2 mL Perm/vask buffer (1,9 mL/individuel bejdning) og centrifugeres ved 800 x g i 5 min ved 4 °c. Vask celler med ikke mindre end 1-2 mL Perm/vaskebuffer for at sikre tilstrækkelig vask.
Bemærk: Kun pipette blandes og ikke vortex, da dette kan reducere protein stabiliteten. Efter centrifugering, Aspirér supernatanten omhyggeligt for at forhindre celler i at blive opløst og fjern så meget supernatanten som muligt for at minimere antistof fremførsel og sikre en mere komplet vask. - Hver vasket pellet opslæmmes i 300 μL Perm/vaskebuffer, og den belastes gennem et 100 μm-filter i et FACS-rør for at udstamme store klumper af celler før FACS-analysen.
- Analysér celler på en FACS ARIA flow cytometri på PE-kanalen. Analysér mindst 10.000 hændelser for hver enkelt plet, og parse begivenheder i kraft af FSC-a/SSC-a-analyse, Vælg celle undertrøjer ved at gating på FSC-w/FSC-h efterfulgt af SSC-h/SSC-w.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter 24 timers differentiering vil kolonier generelt indtage en anden morfologi end udifferentierede kolonier samtidig med tab af den lyse grænse, der typisk omgår hPSC-kolonier. Morfologisk, primitive streak celler generelt har Ragged grænser og er mere spredt og mindre kompakt end hPSCs-dette er stemningsfulde af en epitelial-til-mesenchymal overgang som pluripotente epiblast celler differentiere og indtrængning i den primitive stribe in vivo. Hvis koloni størrelsen af hPSCs før differentiering var for stor, vil der være en åbenlyst-hævet Center, der omfatter udifferentierede celler. Kulturer, der indeholder sådanne store klumper bør kasseres, da disse udifferentierede koloni Centre vil tolerere efterfølgende differentiering. Hvis klumper af den korrekte størrelse og tæthed blev belagt, APS differentiering er meget reproducerbare og ensartet, genererer en 99.3 ± 0,1% MIXL1-Gfp+ primitive streak POPULATION (MIXL1 er en primitiv stribe markør)7. Bemærk, at nogle celledød observeres efter 24 h APS differentiering.
Ved dag 2 af differentiering, primitive streak celler har differentieret i dag 2 definitive endoderm celler, langt de fleste af hvilke udtrykker SOX17 (figur 2) og FOXA2. I snesevis af uafhængige eksperimenter med 14 hESC og hiPSC linjer (herunder H1, H7, H9, HES2, HES3, BJC1, BJC3, HUF1C4 og HUF58C4), denne fremgangsmåde skalably, konsekvent og effektivt genereret ren definitive endoderm populationer (94,0% ± 3,1%)7. Denne metode til at generere definitive endoderm fra hpscs giver højere procenter af CXCR4+PDGFRA- epitel populationer sammenlignet med andre endoderm-dannende tilgange2,14.
Ved dag 3 af differentiering, endoderm har differentieret i forgut forfædre, der synes polygonal i form (figur 1). Senere, ved 6 dage af differentiering, fortarmen afkom differentiere i leveren bud forfædre udtrykker AFP, TBX3, og HNF4A (figur 3). På tværs af tre hESC linjer (H1, H7, H9 hESCs), genererer denne metode dag 6 AFP+ lever progenitorer form med en effektivitet på 89.0 ± 3,1% (figur 2). Endelig, efter 18 dage med lever differentiering fra hPSCs, ALBUMIN+ hepatocyte-lignende celler vises. Morfologisk, de vises epitelial, danner lyse grænser, der minder om galde eller (figur 1). På dette stadium, cytoplasmaet af dag 18 hPSC-afledte hepatocytter synes mørkere end kernen (figur 1).
Figur 1: skematisk differentiering strategi og morfologi af udifferentierede hPSCs, differentiere endoderm og hepatocyte-lignende celler. Differentierings proces og tidslinje blev vist. Forkortelser: d = dag, hpsc = humane pluripotente stamceller, ApS = forreste primitiv stribe, de = definitiv endoderm, PFG = posterior foregut, LB = lever opløbet progenitors, HP = hepatocyt progenitors, HEP = hepatocyt lignende celler. Scale bar = 400 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: procentdel af dag 1 MIXL1 + primitive streak, dag 2 SOX17 + definitive (def) endoderm, dag 6 AFP + lever opløbet forfædre og Alb + hepatocytter populationer som vist af FACS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Immunofarvnings analyse af dag 6 lever progenitorer. hPSC blev først differentieret i leveren bud progenitors, som var immun plettet for leveren bud transkriptionsfaktorer HNF4A (rød), TBX3 (grøn) samt cytoplasmisk lever bud markør AFP (rød). Kerner blev modfarvet med DAPI (blå) for at vurdere det samlede celle nummer. Scale bar = 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: celle såning tæthed af hPSCs. Lav (venstre) og passende (midterste og højre) tæthed af celler seedet. Scale bar = 1.000 μm. Pil peger på "broer" mellem kolonier af celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Base medium | Sammensætning af basis medium |
| CDM2 | 1:1 IMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% koncentrerede lipiderne, 0,7 μg/mL humant rekombinant insulin, 15 μg/mL transferrin, 18 nM 1-thioglycerol |
| CDM3 | 1:1 IMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% koncentrerede lipiderne, 10% KOSR |
| CDM4 | 1:1 IMDM/F12, 1% koncentrerede lipiderne, 15 μg/mL transferrin |
| CDM5 | CMRL, 10% KOSR, 1% Glutamax |
Tabel 1: sammensætning af kemisk definerede medier CDM2, CDM3, CDM4 og CDM5.
| Differentierings stadier | Varighed | Faktorer | Doser | Base medium |
| Dag 1 primitiv stribe | 1 dag | Aktivin | 100 ng/mL | |
| CHIR99201 | 3 μM | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| Dag 2 endelig endoderm | 1 dag | Aktivin | 100 ng/mL | |
| DM3189 | 250 nM | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| Dag 3 posterior foregut | 1 dag | A83-01 | 1 μM | |
| TTNPB | 75 nM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| Dag 6 lever opløbet forfædre | 2 dage | Aktivin | 10 ng/mL | |
| C59 | 1 μM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskolin | 1 μM | |||
| 1 dag | Aktivin | 10 ng/mL | ||
| CHIR99201 | 1 μM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskolin | 1 μM | |||
| Dag 12 hepatiske progenitorer | 6 dage | BMP4 | 10 μg/mL | |
| Osm | 10 ng/mL | |||
| Dexamethason | 10 μM | |||
| Forskolin | 10 μM | CDM4 | ||
| Ro4929097 | 2 μM | |||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| Insulin | 10 μg/mL | |||
| dag 18 hepatocytter | 6 dage | Dexamethason | 10 μM | |
| Forskolin | 10 μM | CDM4 eller | ||
| Ro4929097 | 2 μM | CDM5 | ||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| Insulin | 10 μg/mL |
Tabel 2: sammensætningen af differentierings mediet.
| Problem | Mulig årsag | Proffered Solution |
| Celler i centrum af koloni skelner ikke | i) koloni størrelse var alt for stor, celler i midten af store kolonier var ikke tilgængelige for differentiering signaler | i) kontrollere celle optælling technqiue. |
| II) ujævn fordeling af klumper, der fusioneret sammen i midten af brønden (eller dens periferi), danner meget store kolonier | II) Ryst pladen i en tværgående måde for jævnt at distribuere klumper under plating, og tjek under et mikroskop, før du placerer det i inkubator | |
| III) celler modtog utilstrækkelige differentierings signaler | III) Tilsæt passende mængder af differentierings medier: Tilsæt 1 mL medium pr. brønd i en 12-brønd plade og 3 mL pr. brønd i en 6-brønd plade | |
| Ringe effektivitet af differentiering | i) begyndende cellekultur delvis differentieret | i) bruge en ny, høj kvalitet batch af udifferentierede hPSCs |
| II) kolonierne var for tæt seedede og dannede et konfluent-ark af celler | II) Frøceller og tælle celler præcist til differentiering, og ryste jævnt for at distribuere dem | |
| III) resterende medier og uønskede signaler blev ikke vasket af på grund af utilstrækkelig vask | III) resterende mTeSR1 eller induktions medier fra den foregående fase af differentiering vil blokere differentiering; vask celler med IMDM før tilsætning af differentierings medium | |
| IV) vask for barsk; uhensigtsmæssige vaske betingelser vil alvorligt forstyrre cellernes morfologi | IV) før du tilføjer enten differentierings mediet, skal du kort varigt vaske med imdm. Brug af DPB'ER (eller medier med forskellige osmolaritet eller kolde medier) eller udvidet vask, vil kompromittere cellernes morfologi og levedygtighed | |
| v) forlænget eller forkortet periode med differentierings stadier, længere eller kortere end anbefalet. | v) overholde de anbefalede tidsindstillinger for hvert trin i differentieringen. |
Tabel 3: potentielle problemer og deres mulige årsager og løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode muliggør generering af berigede populationer af lever opløbet progenitors, og efterfølgende hepatocyte-lignende celler, fra hPSCs. Evnen til at generere berigede populationer af humane leverceller er vigtig for den praktiske anvendelse af sådanne celler. Tidligere metoder til at generere hepatocytter fra hPSCs gav uren cellepopulationer, der indeholder både leveren og ikke-leveren celler, der, ved transplantation til gnavere, gav knogle og brusk i tillæg til leveren væv15. Derfor er den eksplicitte undertrykkelse af ikke-lever differentiering afgørende for at generere beriget lever populationer, der kan være egnet til en række forskellige anvendelser.
Især er kontrolleret plating af hPSCs i første trin afgørende for en effektiv downstream-differentiering. Det er vigtigt præcist at plade hPSCs på en vis tæthed for differentiering, og at jævnt distribuere disse hPSCs over brønden eller pladen under processen med plating. For eksempel for hver brønd af en 12-brønd plade, frø 160.000 til 250.000 hPSCs per brønd; samlet set er det bydende nødvendigt at titrere celle såning tæthed og i sidste ende teste celletætheden, der er passende for hver cellelinje (figur 4). Hvis der er for mange Hpsc'er, vil de danne store kolonier, hvilket vil påvirke differentierings effektiviteten negativt, da celler midt i store kolonier er mindre tilgængelige for differentierings signaler sammenlignet med celler nær periferien; kolonier af heterogene størrelser vil også præsentere lignende problemer. Hvis celletætheden er for lav (f. eks. under 200.000 celler/brønd af en 12-brønd plade), kan der ikke være tilstrækkeligt materiale til differentiering, og omfattende celledød kan observeres. Metoden til passaging og såning, der er beskrevet ovenfor, genererer konsekvent hPSC-klumper af passende størrelse til downstream-differentiering.
En begrænsning af denne metode er, at de hepatocyte-lignende celler genereret ikke er identiske med voksne hepatocytter, som hPSC-afledte celler stadig udtrykker umoden lever markør AFP. Desuden er CYP3A4 enzymatisk aktivitet ca. 55 gange lavere i disse hPSC-afledte hepatocyte-lignende celler sammenlignet med primære voksne humane hepatocytter. En kommende udfordring vil være at modne disse hPSC-afledte hepatocyte-lignende celler til fuldt udbygget, voksen-lignende celler. En anden begrænsning er, at effektiv differentiering er yderst afhængig af cellernes start tæthed, og derfor er det meget vigtigt at lægge frø ved den anbefalede tæthed og at sprede dem jævnt over pladen (tabel 3).
Samlet, denne protokol producerer lever bud forfædre og hepatocyte-lignende celler på 89.0 ± 3,1% renhed i mindst 3 hpsc linjer. For det andet, hepatocyte-lignende celler udtrykt leverenzymer, udskillet humant ALBUMIN og udtrykte højere niveauer af lever gener end celler genereret ved hjælp af eksisterende differentiering tilgange. Endelig, de resulterende hepatocyt-lignende celler ikke kun udviser visse hepatocyt funktioner in vitro, men vigtigst af alt kan de fungere til en vis grad in vivo, da de kan forankret en musemodel af kronisk leverskade og forbedre kortsigtede overlevelse2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Bing lim for diskussioner og Stanford Institute for stamcelle biologi & regenerativ medicin til infrastruktur støtte. Dette arbejde blev støttet af California Institute for regenerative Medicine (DISC2-10679) og Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (til L.T.A. og K.M.L.) og Stanford Beckman Center for molekylær og genetisk medicin samt den anonyme, Baxter og DiGenova familier (til K.M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| Human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| Human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| Human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
References
- Bernal, W., Wendon, J.
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Fisher, R. A., Strom, S. C. Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results. Transplantation. 82, 441-449 (2006).
- Dhawan, A. Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges. Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).
- Salama, H., et al. Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases. Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).
- Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice. Differentiation. 98, 25-34 (2017).
- Loh, K. M., et al. Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Zhao, D., et al. Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects. Cell Research. 23, 157-161 (2012).
- Si Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 297-305 (2010).
- Carpentier, A., et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen. Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).
- Avior, Y., et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 62, 265-278 (2015).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).
- Haridass, D., et al. Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice. The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).
