Summary
Этот протокол детализирует монослой, метод без сыворотки для эффективного создания гепатоцитов, как клетки из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (HPSCs) в 18 дней. Это влечет за собой шесть шагов, как hPSCs последовательно дифференцировать в промежуточных клеточных типов, таких как примитивные полосы, окончательный эндодерм, задний предтечут и печень бутон прародителей до формирования гепатоцитов, как клетки.
Abstract
Печень детоксикации вредных веществ, выделяет жизненно важные белки, и выполняет ключевые метаболические деятельности, тем самым поддерживая жизнь. Следовательно, печеночная недостаточность, которая может быть вызвана хроническим потреблением алкоголя, гепатитом, острым отравлением или другими оскорблениями– является тяжелым заболеванием, которое может привести к кровотечению, желтухе, коме и, в конечном счете, смерти. Тем не менее, подходы к лечению печеночной недостаточности, а также исследования функции печени и болезни, были загнаны в тупик отчасти из-за отсутствия обильных поставок клеток печени человека. С этой целью в этом протоколе подробно описывается эффективная дифференциация плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) в гепатоцитные клетки, руководствуясь дорожной картой развития, которая описывает, как судьба печени определяется через шесть последовательных шагов дифференциации. Путем манипулировать путями сигнализации развития для того чтобы повысить дифференциацию печенки и точно подавить образование излишних судеб клетки, этот метод эффектно производит населенности потомков бутона печени человека и гепатоцит-как клетки днями 6 и 18 дифференциации PSC, соответственно. Это достигается за счет временно точного контроля путей сигнализации развития, оказываемого малыми молекулами и факторами роста в среде культуры, свободной от сыворотки. Дифференциация в этой системе происходит в монослойных и дает гепатоцитов, как клетки, которые выражают характерные ферменты гепатоцитов и имеют возможность привить мыши модель хронической печеночной недостаточности. Способность эффективно генерировать большое количество клеток печени человека in vitro имеет последствия для лечения печеночной недостаточности, для скрининга наркотиков, а также для механистических исследований заболеваний печени.
Introduction
Цель этого протокола заключается в эффективной дифференцировать человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) в обогащенных популяций печени бутон прародителей и гепатоцитов, как клетки2. Доступ к готовым поставкам человеческих протеже печени и гепатоцитов, как клетки ускорят усилия по исследованию функции печени и болезни и может позволить новые клеточные трансплантации терапии для печеночной недостаточности3,4, 5. Это оказалось сложной задачей в прошлом, так как hPSCs (которые включают эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток) может дифференцироваться во все клетки типов человеческого тела; следовательно, было трудно исключительно дифференцировать их в чистую популяцию одного типа клеток, таких как клетки печени6.
Для точнодифференцировать hPSCs в клетки печенки, сперва критическое для того чтобы понять not only как клетки печенки определены но также как non-liver клетк-типы превращаются. Знание как non-liver клетки превращаются важно логически подавить образование non-liver lineages во время дифференциации, тем самым исключительно направляя hPSCs к судьбе печенки2. Во-вторых, важно разграничивать многочисленные шаги развития, через которые hPSCs дифференцировать к судьбе печени. Известно, что hPSCs последовательно дифференцировать в несколько типов клеток, известных как примитивные полосы (APS), окончательный эндодерм (DE), задний предтечу (PFG) и печени зародытели (LB) до формирования гепатоцитов, как клетки (HEP). Более ранняя работа выявила сигналы, указывающие на судьбу печени и сигналы, которые подавляли образование альтернативных не-печенных клеточных типов (включая желудок, поджелудочной железы и кишечных прародителей) на каждом выборе линии развития2, 7 (г. , 8.
В совокупности, эти идеи привели к сыворотке свободной, монослой метод дифференцировать hPSCs к примитивной полосы, окончательный эндодерм, задний предтечу, печень бутон прародителей и, наконец, гепатоцитов, как клетки2. В целом метод включает в себя посев hPSCs в монослой при соответствующей плотности, подготовка шести коктейлей дифференциации средств (содержащих факторы роста и малых молекул, которые регулируют различные пути развития сигнализации), и последовательно добавляя эти средства массовой информации, чтобы вызвать дифференциацию в течение 18 дней. Во время процесса, не проходя клеток не требуется. Следует отметить, потому что этот метод явно включает в себя сигналы, которые подавляют образование не-печенных клеточных типов, этот подход дифференциации1 более эффективно генерирует печени прародителей и гепатоцитов, как клетки по сравнению с сохранившимся методы дифференциации2,9,10,11,12. Кроме того, протокол, описанный в этом тексте, позволяет быстрее выражать гепатоциты, которые в конечном счете выражают более высокие уровни печеночных транскрипционных факторов и ферментов, чем те, которые производятся другими протоколами9,10 , 11 Год , 12.
Описанный здесь протокол имеет определенные преимущества по сравнению с текущими протоколами дифференциации. Во-первых, это влечет за собой монослойную дифференциацию гПСК, что технически проще по сравнению с трехмерными методами дифференциации, такими как те, которые полагаются на эмбриональные тела13. Во-вторых, этот метод использует недавнее продвижение которой окончательные клетки эндодерма (ранний предшественник клеток печени) могут быть эффективно и быстро генерируется в течение 2 дней hPSC дифференциации2,7, таким образом, что позволяет последующее производство гепатоцитов с повышенной чистотой. В-третьих, в бок о бок сравнения, гепатоцитов, как клетки, производимые этим методом2 производят больше ALBUMIN и выразить более высокие уровни печеночной транскрипции факторов и ферментов по сравнению с гепатоцитов, производимых в других методах10, 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка дифференциации СМИ
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице материалов для получения информации о материалах и реагентах, используемых.
-
Подготовка базовых химически определенных носителей (CDM)
ПРИМЕЧАНИЕ: CDM2, CDM3, CDM4 и CDM5 являются химически определенными носителями, которые используются в качестве базовых носителей для дифференциации hPSCs на клетки печени на различных стадиях. Состав этих носителей можно найти в таблице 1.- Чтобы сделать CDM2 или CDM3, подготовить фондовый раствор, содержащий поливиниловый спирт (PVA). Растворите 0,5 г порошка ПВА в 50 мл модифицированного ульбека Компании Искова (IMDM) для генерации 10 мг/мл ПВА.
ПРИМЕЧАНИЕ: Так как ПВА не растворяется легко, приготовьте смесь PVA/IMDM в конической колбе с непрерывным перемешиванием при 50 градусах по грелке; перемешивание может быть легко достигнуто с помощью магнитного мешалки. - После того, как ПВА однородно растворяется в IMDM, снимите раствор ПВА с грелки и дайте ему остыть до комнатной температуры.
- Используйте стерильный фильтр 0,2 мкм для фильтрации решения PVA.
- Подготовьте CDM2 и CDM3, объединив отфильтрованную ПВА со ступени 1.1.1 и различные коммерчески купленные компоненты, изложенные в таблице 1 и таблицематериалов. Используйте стерильные, 0,2 мкм фильтра единиц для фильтрации всех носителей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Базовая среда может храниться при 4 градусах Цельсия, но не более 2 месяцев. - Подготовьте оставшиеся базовые носители CDM4 и CDM5 по таблице 1.
- Чтобы сделать CDM2 или CDM3, подготовить фондовый раствор, содержащий поливиниловый спирт (PVA). Растворите 0,5 г порошка ПВА в 50 мл модифицированного ульбека Компании Искова (IMDM) для генерации 10 мг/мл ПВА.
-
Подготовка дифференциационных носителей
- Чтобы подготовить фондовые решения для малых молекул и факторов роста, воссоздать их в рамках рекомендаций производителей. Для хранения, aliquot в стерильные трубки, чтобы уменьшить циклы замораживания оттепели и держать на уровне -20 градусов по Цельсию или в соответствии с рекомендациями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Состав среды дифференциации, используемой на различных стадиях дифференциации, описан в таблице 2 и в следующих шагах. - Для подготовки среды дифференциации сначала разморозьте замороженные мелкие молекулы и/или факторы роста при комнатной температуре. Далее, aliquot из необходимого количества базовой среды. Наконец, подготовить окончательную дифференциацию средств массовой информации, добавив указанные небольшие молекулы и факторы роста в базовой среде в соответствующих концентрациях (Таблица 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеподготовленная среда дифференциации в идеале должна использоваться в тот же день; в противном случае он может храниться при 4 градусах Цельсия и использоваться в течение трех дней. - Используя наконечник пипетки, смешайте среду дифференциации несколько раз, чтобы гарантировать, что добавки однородно распределены перед добавлением среды к клеткам (например, добавьте 1 мл среды дифференциации к каждой скважине 12-колодцвой пластины).
- Чтобы подготовить фондовые решения для малых молекул и факторов роста, воссоздать их в рамках рекомендаций производителей. Для хранения, aliquot в стерильные трубки, чтобы уменьшить циклы замораживания оттепели и держать на уровне -20 градусов по Цельсию или в соответствии с рекомендациями.
2. Семена hPSCs на пластины на Определенные плотность для дифференциации
- Пальто клеток культуры пластмасс, которые будут использоваться для посева с hPSCs.
- Оттепель матрицы (например, Geltrex) на 4 кв с ночь перед днем использования.
- На следующий день разбавить матрицу 1:100, добавив 500 л матрицы в 50 мл холодного диглобового среднего (DMEM)/F12. Так как матрица представляет собой гидрогель, который необратимо полимеризируется при воздействии комнатной температуры, при работе с матрицей всегда держите матричные трубки и носители на льду.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица, растворенные 1:100 в DMEM/F12, может храниться при 4 градусах По Цельсию, но должна использоваться в течение 2 месяцев.
- Чтобы покрыть культурную пластину матрицей, пипетка разбавленной матрицы в необходимое количество скважин, используя достаточно объем матричного раствора, чтобы покрыть поверхность скважины (например, добавьте 0,5 мл матрицы к одной скважине 12-колодской пластины или 1 мл к одному колодцу 6- хорошо пластины). При необходимости аккуратно встряхните тарелку, чтобы убедиться, что матричного раствора полностью покрыло дно колодца.
- Оставьте матричную пластину в инкубаторе с 37 градусов по Цельсию в течение не менее 60 минут. При такой температуре матрица полимеризируется, образуя тонкую пленку в нижней части колодца.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины с матричной покрытой могут храниться в инкубаторе 37 градусов по Цельсию и использоваться в течение 3 дней, пока матрица не высохнет.
- Призадыхать оставшийся матричной раствор из покрытых колодцев непосредственно перед посевом скважин с hPSCs.
- Проходя и посева покрытые пластины с hPSCsNOTE: Диссоциационный агент содержит ферменты, которые диссоциировать клетки и важно оставить hPSCs в диссоциации агента как не хватает времени, как это возможно.
- Для семян матричного покрытия культуры пластин с hPSCs до дифференциации, расти недифференцированных hPSCs до 70% выжимания в коммерчески доступных mTeSR1 среды (Таблица материалов) в соответствии с протоколом производителя. Очень важно пройти hPSCs прежде чем они будут полно стыково, по мере того как hPSCs могут самопроизвольно продифференцировать на высоком слиянии.
ПРИМЕЧАНИЕ: hPSCs должны быть кариотипированы, чтобы убедиться, что Есть нет хромосомных аномалий, прежде чем использовать их для экспериментов. HPSCs, используемые для этого протокола дифференциации, были сохранены в средствах массовой информации mTeSR1 и проходились как скопления с EDTA, чтобы свести к минимуму кариотипические аномалии. Кариотипично-аномальные hPSCs не должны использоваться для дифференциации, так как они могут размножаться аномально быстро; таким образом плотность клетк-посева порекомендованные здесь не соотвествующие для karyotypically-аномальных клеток. - Для семян hPSCs для дифференциации, аспирировать mTeSR1 от в значительной степени-слияние hPSC культур пластины и добавить коммерчески купил диссоциации агента (Таблица материалов) для разъединения hPSCs, используя достаточно диссоциации агента для покрытия поверхности хорошо или блюдо, на котором клетки растут (например, добавить 0,5 мл диссоциационного агента на колодец 12-хорошей пластины, 1 мл на колодец из 6-хорошей пластины или 3 мл на 10 см блюдо).
- Инкубация hPSCs в диссоциационизм агента при 37 кв. C в течение 5 мин или до тех пор, пока некоторые колонии начинают отделяться. Аккуратно коснитесь нижней части колодца/пластины несколько раз; после нескольких минут диссоциации, большинство колоний hPSC должны свободно вступить в подвеску.
- Чтобы выбить вытесняемые hPSCs из пластины, добавьте 2 мл/хорошо DMEM/F12 при работе с 6-колодецной пластиной (или 1 мл/хорошо, если работас с 12-коловидной пластиной), чтобы разбавить диссоциационный агент. Используйте серологический пипетку 5 мл, чтобы аккуратно пипетку вверх и вниз несколько раз смыть все клетки с поверхности колодца; собирать повторно одноклеточные ячейки в конической трубке 50 мл. Вымойте пластину второй раз с тем же объемом DMEM/F12, чтобы обеспечить восстановление всех hPSCs.
- К конической трубке 50 мл, содержащей клетки, добавьте DMEM/F12, чтобы разбавить первоначальный объем диссоциационизмовательного агента на 1:5-1:10 (например, если первоначальный объем диссоциационного агента составлял 1 мл, отрегулируйте общий объем клеточной подвески до 10 мл с Помощью DMEM/F12 для разбавления агент диссоциации в 1:10)
- Centrifuge собранные hPSCs в 50 мл конической трубки на 350 х г в течение 3 мин при 4 КК к клеткам гранул.
- В ожидании клетки гранулы, аспир матрицы из пластины, в которой hPSCS будут посеяны. Затем добавьте достаточное количество mTesR1, дополненного 1 мкм коммерчески полученного тиазовивина (фармакологический ингибитор ROCK), чтобы покрыть их (например, добавьте 0,5 мл мТеСР1 на скважину 12-колодцвой пластины или 1 мл мТеСР1 на скважину 6-хорошей пластины).
ПРИМЕЧАНИЕ: Тиазовивин при низкой концентрации включается на этом этапе для повышения выживаемости одиночных клеток и, следовательно, последующей плотности посева гПСК. - После центрифугии hPSCs, тщательно аспирируйте супернатант, оставляя гранулированные hPSCs на дне конической трубки. Супернатант содержит диссоциационный агент, который будет препятствовать последующему сцепления hPSCs и, таким образом, важно, чтобы аспирировать подавляющее большинство супернатанта, прежде чем продолжить.
- Отдохните клеточные гранулы в mTeSR1, дополненные 1 мкм тиазовивина. С p1000 пипетка, аккуратно triturate 2-3 раза, чтобы равномерно повторно гофелитных клеток в одной ячейки подвески. Не чрезмерно тритурировать клетки гранулы, как чрезмерная механическая сила повредит hPSCs и привести к плохой выживания клеток.
- После повторного приостановки hPSCs, немедленно пипетка 10 л подвески в гемоцитометр и подсчитать количество клеток. Важно, чтобы клетки пипетки для подсчета как можно быстрее, как гравитация приведет к hPSCs естественно оседают в нижней части 50 мл трубки, которая будет смущать точного подсчета клеток.
- Отрегулируйте объем перепровимых hPSCs с тиазовивином-дополненным mTeSR1 для достижения желаемой концентрации клеток для покрытия. Например, после регулировки объема перепровисаемых hPSCs, добавить 0,5 мл клеточной подвески на скважину, чтобы семена 160000-250000 клеток в каждой скважине 12-хорошо пластины, таким образом, достижение общего объема 1 мл в каждой скважине (0,5 мл средств массовой информации был добавлен в колодец в шаг2.2.7). Если используются большие или меньшие скважины, масштабируется количество клеток/медиа-объемов вверх или вниз соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы семена hPSCs при указанной плотности клеток. Чрезмерно-слияние hPSCs не будет дифференцировать эффективно и недопомогучий hPSCs не выживет наилучшим образом во время дифференциации. - Встряхните пластину в поперечном рисунке (слева, затем вправо; вперед, затем назад) несколько раз, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены по пластине / хорошо. Не закружайте пластину круговыми движениями, так как клетки оседают в центре пластины/колодца. Как правило, hPSCs начнет придерживаться поверхности скважины в течение 3-30 мин. Разрешить клетки расти, по крайней мере 24 ч до начала дифференциации.
- Для семян матричного покрытия культуры пластин с hPSCs до дифференциации, расти недифференцированных hPSCs до 70% выжимания в коммерчески доступных mTeSR1 среды (Таблица материалов) в соответствии с протоколом производителя. Очень важно пройти hPSCs прежде чем они будут полно стыково, по мере того как hPSCs могут самопроизвольно продифференцировать на высоком слиянии.
3. Дифференциация hPSCs в эндодермальные клетки и протеже печени
- После hPSCs были покрыты, по крайней мере 24 часов (как описано в шаге 2.2.12), прежде чем приступить к дифференциации, проверить морфологию клеток под фазовой контрастной микроскоп, с особым акцентом на диаметр и плотность покрытых hPSC колоний.
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, комки должны быть легко расставлены и соответствующего размера и плотности на протяжении всего задолго до шага 3.2. Большие (приблизительно йgt;400 мкм) или небольшие колонии (приблизительно lt;200 мкм) hPSCs не пригодны для дифференциации(рисунок 4). Сигналы дифференциации не будут действовать равномерно во всех крупных колониях hPSC, что приведет к неэффективной дифференциации. Колонии, которые слишком малы, не выживают хорошо в течение первых 3 дней дифференциации hPSC в этом протоколе дифференциации. Если плотность семян hPSCs является правильным, hPSC колоний часто образуют "мосты" клеток между ними и общее слияние будет 30-50% до добавления день 1 дифференциации среды (Рисунок 4). - Если размеры колоний идеальны в шаге 3.1, переходим к 1-му дню дифференциации, что влечет за собой дифференциацию hPSCs на переднюю примитивную полосу (APS).
- Подготовка день 1 APS дифференциации среды путем смешивания всех реагентов, изложенных в таблице 2 с помощью CDM 2 (Таблица 1 и раздел 1.2) в качестве базовой среды. Pipet смешивать несколько раз, чтобы обеспечить равномерное распределение компонентов в средствах массовой информации.
- Аспирировать для удаления тиазовивина, дополненного mTeSR1 из покрых hPSCs и кратко мыть hPSCs с IMDM-носителями. Не мыть с фосфатами буферного соления (PBS) вместо IMDM, как PBS не хватает ионов кальция (Ca2 ")и, таким образом, токсичны для hPSCs; это нарушит морфологию клеток.
- После краткого мытья IMDM, добавить день 1 средних hPSCs. Запись времени и место клетки обратно в инкубатор 37 градусов по Цельсию
- Продолжить последующие шаги дифференциации путем подготовки (Таблица 2) и добавления соответствующей среды дифференциации к клеткам на соответствующие дни (с интервалом 24 ч) дифференциации примерно в то же время дня (Рисунок 1). Заменяйте со свежими средствами массовой информации ежедневно, даже если последовательные дни дифференциации использовать те же средства дифференциации. Между изменениями мультимедиа, мыть клетки один раз с IMDM-носителями для удаления мертвых клеток и остатков предыдущих средних компонентов.
- По мере того как дифференциация развивает за этапбутаона печени, номера клетки увеличивают и следовательно, добавляют больше средств к каждому наилучшим образом плиты для того чтобы обеспечить что количество факторов дифференциации и питательных веществ не ограничивает. Например, добавить 1 мЛ дифференциации среды для каждой скважины 12-хорошо первоначально в дни 1 до 6 дифференциации, но добавить 1,5-2 мл последующей дифференциации средств массовой информации на более поздние дни дифференциации (дни 7 до 18 дифференциации).
4. Характеристика эндодермальных клеток и протеже печени с помощью иммуносовизации
- Подготовка блокирующий буфер: 10% сыворотки осла и 0,1% Тритон X100 в деионизированных фосфатов буферного солей (DPBS).
- Подготовка окрашивающий буфер: 1% сыворотки осла и 0,1% Тритон X100 в DPBS.
- Аспирная среда из клеток в 12-хорошей пластине.
- Добавьте 4% параформальдегида (в DPBS) в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы исправить клетки, а затем мыть клетки дважды с DPBS.
- Добавить блокирующий буфер на 1 ч при комнатной температуре, чтобы блокировать и пронизать фиксированные ячейки.
- Аспирировать блокирующий раствор и добавить первичные антитела, разбавленные в окрашивание буфера. (См. Таблицу Материалов для коэффициентов разбавления антител.)
- Пятно клеток на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Вымойте клетки трижды с 0,1% Тритон X100 в DPBS.
- Добавить вторичное пятно антитела в окрашивание буфера для 1 ч при комнатной температуре. (См. Таблицу Материалов для разбавления вторичных антител.)
- Удалить вторичные антитела и добавить DAPI в течение 5 минут при комнатной температуре для проведения ядерного противоядерного пятна.
- Вымойте дважды с 0,1% Triton X100 в DPBS, чтобы удалить избыток антител и DAPI.
- Проведите флуоресценцию с помощью наблюдателя D1. Кроме того, храните тарелку в 4 градусах Цельсия до тех пор, пока изображение не будет выполнено. Для ожидаемых результатов, см. Рисунок 3.
5. Характеристика протеже печени с помощью анализа активированной сортировки клеток (FACS)
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте FACS для точной количественной оценки процентной доли дифференцированных клеток LB, которые появляются к шестому дню дифференциации. Выполните те же шаги, чтобы количественно определить процент дифференцированных гепатоцитов ALB к 18-му дню дифференциации.
- Спрягните анти-AFP антитела.
- Добавьте R-phycoerythrin в анти-АФП антитела в концентрации (0,55 мкг / КЛ) с помощью R-фикоэритрина конъюгации комплект (см. Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что антитела очищены и воссозданы в буферах, которые не содержат аминов. Убедитесь, что количество антител, используемых в реакции маркировки должно быть меньше, чем количество ПЭ (т.е. 60 мкг антител с 100 мкг PE). Плохое спряжение антител может привести к ненадежным исходам. - Добавьте 1 зл реагента модификатора для 10 Л антител, которые будут помечены. Смешайте осторожно.
- Удалите смесь R-PE (100 л) и пипетку вышеупомянутую смесь непосредственно в лиофилизированный материал R-PE.
- Поместите крышку назад и оставьте флакон стоя в течение 3 ч в темноте при комнатной температуре.
- После инкубации в течение 3 ч или более, добавьте 1 злителя рекончера реагента для 10 Зл антител используется. Конъюгет можно использовать после 30 мин.
- Храните спряжение антител при 4 градусах Цельсия.
- Вымойте дифференцированные или недифференцированные hPSCs в формате 6-колодец с DMEM/F12.
- Кратко лечить с диссоциационным агентом (1 мл / хорошо в 6-колодец пластины) в течение 5 минут при комнатной температуре, пока клетки отделяются. Урожай и пятно как недифференцированные hPSC и дифференцированные клетки-прародители печени одинаково и анализировать параллельно в том же эксперименте, чтобы обеспечить специфичность окрашивания антител.
- Аккуратно нажмите Петри блюдо, чтобы отделить клетки. Используйте пипетку p1000, чтобы отсоединить клетки от пластины и собрать клетки в конической трубке 50 мл. Убедитесь, что клетки в основном отделяются, прежде чем приступить к следующему шагу. Впоследствии, мыть скважины в два раза больше с 1xDPBS буфердля для сбора остаточных ячеек.
- В конической трубке 50мЛ разбавленный агент диссоциации в 5 томах 1x буфера DPBS. Triturate строго 3-4 раза с p1000 пипетка для обеспечения всех клеток разделены на одиночные клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы генерировать одиночные клетки до центрифугации или скопления впоследствии не могут быть отделены с легкостью. Однако, не чрезмерно triturate по мере того как это может повредить герметичность клетки. Подсчитайте количество клеток и используйте рекомендуемую пропорцию клеток к антителу, которая ранее была оптимизирована для минимального фона и максимального обнаружения сигнала. - Коническая трубка Centrifuge, содержащая клеточную суспензию при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
- Пусть супернатант с осторожностью, чтобы не беспокоить клеточные гранулы.
- Resuspend клеточные гранулы тщательно в фиксации / пермский буфер для создания одноклеточной подвески и исправить на льду при 4 C в течение 20 мин. Обратите внимание на передачу на 2 мл микроцентрифугтрубки. Кроме того, использование микроцентрифуговой трубки 2 мл на этом этапе позволяет клеточной грануле откладывать в V-образном углу трубки, минимизируя потерю клеток во время стирок.
- Вымойте каждый гранулы с 1,8 мл пермь / мыть буфер дважды. Resuspend клетки гранулы тщательно в пермь / мыть буфер пипетки смешивания 6 раз с p1000 пипетка. Затем, центрифуга, удалить супернатант и повторить процесс мытья с 1,8 мл пермь / мыть буфера.
- Resuspend клеточные гранулы в пермь / мыть буфер так, что будет 100 Л / отдельных пятна, а затем передать подвески клетки в 2 мл микроцентрифуг трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы создать одноклеточную подвеску на этом этапе до окрашивания антител. Агрегаты клеток не будут окрашены и, таким образом, будут смущать анализ FACS. Кроме того, использование микроцентрифуговой трубки 2 мл на этом этапе позволяет клеточной грануле откладывать в V-образном углу трубки, минимизируя потерю клеток во время стирок. - После повторного отработки ячеек в буфере FACS, aliquot их в отдельные 2 мл труб (как для неокрашенных контроля и антител окрашенных образцов).
- Пятно с анти-AFP-PE 0,33 л на 150 000 клеток в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Например, для индивидуального пятна в размере 100 л, пятно следующим образом: 0,33 л г.л. а-АФП ПЭ и 100 л буфера пермь/мытья. Resuspend клетки с p200 пипетка хорошо, чтобы обеспечить даже окрашивание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только пипетки-микс и не вихрь, как это может снизить стабильность белка. - Вымойте, повторно подвешивать клетки дважды в 1-2 мл пермь / мыть буфер (1,9 мл / индивидуальное пятно) и центрифуги на 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию. Вымойте клетки с не менее 1-2 мл пермь / мыть буфер для обеспечения достаточной стирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только пипетки смешивают и не вихрь, так как это может снизить стабильность белка. После центрифугирования, аспирировать супернатант тщательно, чтобы предотвратить клетки от выбивания и удалить как можно больше супернатанта, как это возможно, чтобы свести к минимуму перенос антител и обеспечить более полную стирку. - Отрежь каждый промываемый гранулы в 300 л завивки/мытье буфера и процедите его через фильтр 100 мкм в трубку FACS, чтобы процедить большие скопления клеток до анализа FACS.
- Анализ клеток на ЦИтометрии faria Faria на канале PE. Проанализируйте минимум 10 000 событий для каждого отдельного пятна и разбирайте события в силу анализа FSC-A/SSC-A, выберите одноклеточные синглы, повышая на FSC-W/FSC-H, за которым следует SSC-H/SSC-W.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После 24 ч дифференциации APS, колонии, как правило, принимают различные морфологии, чем недифференцированные колонии сопутствующей с потерей яркой границы, которая обычно ограничивает hPSC колоний. Морфологически, примитивные полосы клетки, как правило, оборванные границы и более распространены и менее компактны, чем hPSCs-это флагов эпителиального к мезенхимальному переходу, как плюрипотентные эпибластские клетки дифференцировать и входить в примитивные полоса в vivo. Если размер колонии hPSCs до дифференциации был слишком велик, то будет открыто поднятый центр, который состоит из недифференцированных клеток. Культуры, содержащие такие большие скопления, должны быть отброшены, так как эти недифференцированные центры колонии смутят последующую дифференциацию. Если сгустки правильного размера и плотности были покрыты, apS дифференциации является весьма воспроизводимым и однородным, генерации 99,3 х 0,1% MIXL1-Gfp- примитивная полоса населения (MIXL1 является примитивным маркером полосы)7. Обратите внимание, что некоторые смерти клеток наблюдается после 24 ч дифференциации APS.
На второй день дифференциации, примитивные клетки полосы дифференцировали в день 2 окончательные клетки эндодерма, подавляющее большинство из которых выражают SOX17(Рисунок 2) и FOXA2. В десятках независимых экспериментов с 14 линиями hESC и hiPSC (включая H1, H7, H9, HES2, HES3, BJC1, BJC1, BJC4 и HUF58C4), этот подход масштабируемый,последовательно и эффективно генерируется чисто окончательным эндодермом населения (94,0% и 3,1%) 7. Этот метод для генерации окончательного эндодерма от hPSCs дает более высокие проценты CXCR4иPDGFRA- эндодермальных популяций по сравнению с другими эндодерм-образующих подходов2,14.
К 3-му дню дифференциации эндодерм дифференцирован в предтечу, которые появляются полигональные по форме(рисунок 1). Позже, на 6 дней дифференциации, предтечи проразличают в печени бутон прародителей, выражающих AFP, TBX3, и HNF4A (Рисунок 3). Через три линии hESC (H1, H7, H9 hESCs), этот метод генерирует день 6 AFPи печени прародителей форме с эффективностью 89,0 "3,1% (Рисунок 2). Наконец, после 18 дней дифференциации печени от hPSCs, ALBUMINи гепатоцитов, как клетки появляются. Морфологически они появляются эпителиальными, образуя яркие границы, напоминающие желчные каналикули(рисунок 1). На этом этапе цитоплазма дня 18 hPSC полученных гепатоцитов появляется темнее, чем ядро(рисунок 1).
Рисунок 1: Схема стратегии дифференциации и морфологии недифференцированных hPSCs, дифференцируя эндодерм и гепатоцит-подобные клетки. Были показаны процесс дифференциации и хронология. Аббревиатуры: d q день, hPSC - человеческие плюрипотентные стволовые клетки, APS - передняя примитивная полоса, DE - окончательный эндодерм, ПФГ - задний предтеж, LB - роднителей печени, HP и гепатоцитные потомки, HEP и гепатоциты, как клетки. Шкала бар 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Процент дня 1 MIXL1 "примитивная полоса, день 2 SOX17" окончательный (def) эндодерм, день 6 АФПЗ печени бутон прародителей и ALB' гепатоцитов населения, как показано на FACS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Иммуностоинг анализ дня 6-го дня рождения печени. hPSC были впервые дифференцированы в печени бутон прародителей, которые были immunostained для печени бутон транскрипционных факторов HNF4A (красный), TBX3 (зеленый), а также цитоплазматический маркер бутон печени AFP (красный). Ядра были противопоставлены DAPI (синий) для оценки общего числа клеток. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Плотность посева в ячейках hPSCs. Низкая (слева) и соответствующая (средняя и правая) плотность посеянных клеток. Шкала бар 1000 мкм. Стрелка указывает на «мосты» между колониями клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Базовая среда | Состав базовой среды |
| CDM2 | 1:1 IMDM/F12, 0.1% m/v PVA, 1% концентрированные липиды, 0.7 мкг/мл человеческий рекомбинантный инсулин, 15 мкг/мл Трансферин, 18 нМ 1-тиоглицерол |
| CDM3 | 1:1 IMDM/F12, 0.1% м/V PVA, 1% концентрированные липиды, 10% KOSR |
| CDM4 | 1:1 IMDM/F12, 1% концентрированных липидов, 15 мкг/мл Трансферрин |
| CDM5 | CMRL, 10% KOSR, 1% Glutamax |
Таблица 1: Состав химически определенных носителей CDM2, CDM3, CDM4 и CDM5.
| Этапы дифференциации | Длительность | Факторов | Дозы | Базовая среда |
| День 1 Примитивная полоса | 1 день | Активицин | 100 нг/мл | |
| CHIR99201 | 3 мкм | CDM2 | ||
| PI103 | 50 нм | |||
| FGF2 | 10 нг/мл | |||
| День 2 Окончательный Эндодерм | 1 день | Активицин | 100 нг/мл | |
| DM3189 | 250 нм | CDM2 | ||
| PI103 | 50 нм | |||
| День 3 Задняя Предыт | 1 день | A83-01 | 1 км | |
| TTNPB | 75 нм | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 нг/мл | |||
| FGF2 | 10 нг/мл | |||
| День 6 Теик Бад прародителей | 2 дня | Активицин | 10 нг/мл | |
| C59 | 1 км | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 нг/мл | |||
| Форсколин | 1 км | |||
| 1 день | Активицин | 10 нг/мл | ||
| CHIR99201 | 1 км | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 нг/мл | |||
| Форсколин | 1 км | |||
| День 12 генатных прародителей | 6 дней | BMP4 | 10 мкг/мл | |
| Osm | 10 нг/мл | |||
| Дексаметазон | 10 км | |||
| Форсколин | 10 км | CDM4 | ||
| Ro4929097 | 2 мкм | |||
| AA2P | 200 мкг/мл | |||
| Инсулина | 10 мкг/мл | |||
| день 18 Гепатоциты | 6 дней | Дексаметазон | 10 км | |
| Форсколин | 10 км | CDM4 или | ||
| Ro4929097 | 2 мкм | CDM5 | ||
| AA2P | 200 мкг/мл | |||
| Инсулина | 10 мкг/мл |
Таблица 2: Состав медиадифференциации.
| Проблема | Возможная причина | Предлагаемое решение |
| Клетки в центре колонии не различают | i) размер колонии был чрезмерно большим, клетки в средних крупных колониях были недоступны для сигналов дифференциации | i) Проверьте подсчет ячейки technqiue. |
| ii) Неравномерное распределение скоплений, которые слились в центре колодца (или его периферии), образуя очень большие колонии | ii) Встряхните пластину в перекрестной моды, чтобы равномерно распределить комки во время покрытия, и проверить под микроскопом, прежде чем поместить его в инкубатор | |
| iii) Клетки получили недостаточное количество сигналов дифференциации | iii) Добавить адекватные объемы дифференциации носителей: добавить 1 мл среднего в скважину в 12-хорошую пластину и 3 мл на скважину в 6-колодской пластине | |
| Низкая эффективность дифференциации | i) Начальная клеточная культура частично дифференцирована | i) Используйте новую, высококачественную партию недифференцированных hPSCs |
| ii) Колонии были слишком плотно посеяны, образуя сливовый лист клеток | ii) Клетки семян и кол-во клеток точно для дифференциации, и встряхнуть равномерно, чтобы распределить их | |
| iii) Остаточные средства массовой информации и нежелательные сигналы не были смыты из-за недостаточного мытья | iii) остаточные mTeSR1 или индукционные носители с предыдущего этапа дифференциации будут блокировать дифференциацию; мыть клетки с IMDM до добавления дифференциации среды | |
| iv) Мытье слишком сурово; неуместные условия стирки серьезно нарушит морфологию клеток | iv) До добавления любой дифференциации среды, мыть кратко с IMDM. Использование DPBS (или носителей с различными осмолялярностью или холодными носителями) или расширенной стирки, поставит под угрозу морфологию клеток и жизнеспособность | |
| v) Длительный или укороченный период стадии дифференциации, более длительный или короткий, чем рекомендуется. | v) Придерживайтесь рекомендуемых сроков для каждого этапа дифференциации. |
Таблица 3: Потенциальные проблемы и их возможные причины и решения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод позволяет выравнять из гПСК обогащенные популяции пенитобудников, а затем и гепатоцитов. Способность генерировать обогащенные популяции клеток печени человека имеет важное значение для практического использования таких клеток. Предыдущие методы генерации гепатоцитов из hPSCs дали нечистых популяций клеток, содержащих как печень и не-печенных клеток, которые, после трансплантации в грызунов, дали кости и хряща в дополнение к ткани печени15. Поэтому явное подавление не-печенской дифференциации имеет решающее значение для создания обогащенных популяций печени, которые могут быть пригодны для различных применений.
Примечательно, что контролируемое покрытие hPSCs на самом первом этапе имеет важное значение для эффективной дифференциации вниз по течению. Важно точно пластины hPSCs при определенной плотности для дифференциации, и равномерно распределить эти hPSCs через колодец или пластины в процессе покрытия. Например, для каждой скважины из 12-колодца, семян от 160 000 до 250 000 hPSCs на скважину; в целом, крайне важно, чтобы титра ютиться плотность клеток посева и в конечном итоге проверить плотность клеток, что подходит для каждой линии клеток (Рисунок 4). Если слишком много HPSCs посеяны на скважину, они образуют большие колонии, что отрицательно скажется на эффективности дифференциации, так как клетки в середине больших колоний менее доступны для сигналов дифференциации по сравнению с клетками вблизи периферии; колонии разнородных размеров также будут представлять аналогичные вопросы. Если плотность клеток слишком низкая (например, ниже 200 000 клеток/колодца 12-колодца пластины), то может не хватить материала для дифференциации и может наблюдаться обширная гибель клеток. Метод пропуска и посева, описанный выше, последовательно генерирует скопления hPSC подходящего размера для дифференциации ниже по течению.
Одним из ограничений этого метода является то, что гепатоцитов, как клетки генерируются не идентичны взрослых гепатоцитов, как hPSC полученных клеток по-прежнему выражают незрелые печени маркер AFP. Кроме того, enzymatic деятельность CYP3A4 примерно в 55 раз ниже в этих hPSC полученных гепатоцитов, как клетки по сравнению с первичными взрослыми гепатоцитов человека. Предстоящая задача будет созреть эти hPSC полученных гепатоцитов, как клетки в полноценных, взрослых, как клетки. Второе ограничение заключается в том, что эффективная дифференциация чрезвычайно зависит от начальной плотности клеток и, следовательно, очень важно, чтобы семена на рекомендуемой плотности и равномерно рассеивать их по пластине (Таблица 3).
В целом, этот протокол производит печени бутон прародителей и гепатоцитов, как клетки на 89,0 "3,1% чистоты, по крайней мере 3 линии hPSC. Во-вторых, гепатоцитоподобные клетки выражали ферменты печени, выделяли человеческий АЛЬБУМИН и выражали более высокий уровень генов печени, чем клетки, генерируемые с использованием сохранившихся подходов к дифференциации. Наконец, результируемые гепатоцитные клетки не только демонстрируют определенные функции гепатоцитов in vitro, но самое главное, что они могут функционировать в некоторой степени in vivo, так как они могут привить мышь модель хронической травмы печени и улучшить краткосрочное выживание2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Бинг Лим за дискуссии и Стэнфордский институт биологии стволовых клеток и регенеративной медицины для поддержки инфраструктуры. Эта работа была поддержана Калифорнийским институтом регенеративной медицины (DISC2-10679) и Институтом стволовых клеток Стэнфорд-UC Berkeley Siebel (в L.T.A. и K.M.L.) и Стэнфордским Центром молекулярной и генетической медицины Бекмана, а также Anonymous, Семьи Бакстер и Дигенова (к K.M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| Human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| Human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| Human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
References
- Bernal, W., Wendon, J.
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Fisher, R. A., Strom, S. C. Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results. Transplantation. 82, 441-449 (2006).
- Dhawan, A. Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges. Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).
- Salama, H., et al. Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases. Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).
- Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice. Differentiation. 98, 25-34 (2017).
- Loh, K. M., et al. Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Zhao, D., et al. Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects. Cell Research. 23, 157-161 (2012).
- Si Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 297-305 (2010).
- Carpentier, A., et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen. Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).
- Avior, Y., et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 62, 265-278 (2015).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).
- Haridass, D., et al. Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice. The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).
