Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo monostrato e privo di siero-per generare in modo efficiente cellule simili a epatociti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in 18 giorni. Ciò comporta sei passaggi in quanto gli hPSC si differenziano in sequenza in tipi di cellule intermedie come la striscia primitiva, l'endoderma definitivo, il foregut posteriore e i progenitori del germoglio epatico prima di formare cellule simili a epatociti.
Abstract
Il fegato disintossica le sostanze nocive, secerne proteine vitali ed esegue attività metaboliche chiave, sostenendo così la vita. Di conseguenza, l'insufficienza epatica, che può essere causata dall'assunzione cronica di alcol, dall'epatite, dall'avvelenamento acuto o da altri insulti, è una condizione grave che può culminare nel sanguinamento, nell'itterizia, nel coma e infine nella morte. Tuttavia, approcci per trattare l'insufficienza epatica, così come gli studi di funzione epatica e malattia, sono stati ostacolati in parte dalla mancanza di un abbondante apporto di cellule epatiche umane. A tal fine, questo protocollo descrive in dettaglio l'efficiente differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in cellule simili agli eatociti, guidate da una roadmap di sviluppo che descrive come il destino del fegato è specificato attraverso sei fasi di differenziazione consecutive. Manipolando i percorsi di segnalazione dello sviluppo per promuovere la differenziazione del fegato e per sopprimere esplicitamente la formazione di destini cellulari indesiderati, questo metodo genera in modo efficiente popolazioni di progenitori di germogli di fegato umani e cellule simili a epatociti entro i giorni 6 e 18 della differenziazione PSC, rispettivamente. Ciò si ottiene attraverso il controllo temporale preciso dei percorsi di segnalazione dello sviluppo, esercitati da piccole molecole e fattori di crescita in un mezzo di coltura senza siero. La differenziazione in questo sistema si verifica nei monostrati e produce cellule simili a epatociti che esprimono enzimi epaticiti caratteristici e hanno la capacità di innestare un modello murino di insufficienza epatica cronica. La capacità di generare in modo efficiente un gran numero di cellule epatiche umane in vitro ha ramificazioni per il trattamento dell'insufficienza epatica, per lo screening farmacologico e per gli studi meccanicistici delle malattie epatiche.
Introduction
Lo scopo di questo protocollo è quello di differenziare in modo efficiente le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) in popolazioni arricchite di progenitori di gemme del fegato e cellule simili a epatociti2. L'accesso a una fornitura pronta di progenitori epatici umani e cellule simili a epatociti accelererà gli sforzi per indagare sulla funzione epatica e sulla malattia e potrebbe consentire nuove terapie di trapianto di cellule per l'insufficienza epatica3,4, 5. Ciò si è dimostrato impegnativo in passato poiché gli hPSC (che includono cellule staminali pluripotenti embrionali e indotte) possono differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo umano; di conseguenza, è stato difficile differenziarli esclusivamente in una popolazione pura di un tipo a singola cellula, come le cellule epatiche6.
Per differenziare con precisione gli hPSC in cellule epatiche, in primo luogo è fondamentale capire non solo come vengono specificate le cellule epatiche, ma anche come si sviluppano i tipi di cellule non epatiche. La conoscenza di come si sviluppano le cellule non epatiche è importante per sopprimere logicamente la formazione di lignaggi non epatici durante la differenziazione, guidando così esclusivamente hPSC verso un destino epatico2. In secondo luogo, è essenziale delineare i molteplici passaggi di sviluppo attraverso i quali gli hPSCs si differenziano verso un destino epatico. È noto che gli hPSC si differenziano in sequenza in più tipi di cellule note come striscia primitiva (APS), endodermi definitivo (DE), foregut posteriore (PFG) e progenitori di gemme epatiche (LB) prima di formare cellule simili a epatociti (HEP). I lavori precedenti hanno rivelato i segnali che specificano il destino del fegato e i segnali che sopprimevano la formazione di tipi alternativi di cellule non epatiche (compresi i progenitori di stomaco, pancreatici e intestinali) ad ogni scelta di lignaggio dello sviluppo2, 7 (in questo stato , 8.
Collettivamente, queste intuizioni hanno dato origine a un metodo monostrato privo di siero per differenziare gli hPSC verso la striscia primitiva, l'endoderma definitivo, il foregut posteriore, i progenitori delle gemme del fegato e, infine, le cellule simili a epatociti2. Nel complesso il metodo prevede la seeding di hPSC in un monostrato ad una densità appropriata, preparando sei cocktail di supporti di differenziazione (contenenti fattori di crescita e piccole molecole che regolano varie vie di segnalazione dello sviluppo), e l'aggiunta sequenziale di questi mezzi di comunicazione per indurre la differenziazione nel corso di 18 giorni. Durante il processo, non è necessario passare le cellule. Da notare, poiché questo metodo include esplicitamente segnali che sopprimono la formazione di tipi di cellule non epatiche, questo approccio di differenziazione1 genera in modo più efficiente progenitori epatici e cellule simili a epatociti rispetto a quelli esistenti metodi di differenziazione2,9,10,11,12. Inoltre, il protocollo descritto in questo testo consente la generazione più rapida di epatociti che in ultima analisi esprimono livelli più elevati di fattori ed enzimi di trascrizione epatica rispetto a quelli prodotti da altri protocolli9,10 , 11 Del sistema di , 12.
Il protocollo qui descritto presenta alcuni vantaggi rispetto agli attuali protocolli di differenziazione. In primo luogo, comporta la differenziazione del monostrato degli hPSC, che è tecnicamente più semplice rispetto ai metodi di differenziazione tridimensionali, come quelli che si basano su corpi embrionali13. In secondo luogo, questo metodo sfrutta un recente progresso in base al quale le cellule endodermiche definitive (un precursore precoce delle cellule epatiche) possono essere generate in modo efficiente e rapido entro 2 giorni dalla differenziazione hPSC2,7, consentendo così la successiva produzione di epatociti con maggiore purezza. In terzo luogo, nei confronti affiancati, le cellule simili agli epatociti prodotte da questo metodo2 producono più ALBUMIN ed esprimono livelli più elevati di fattori di trascrizione epatica ed enzimi rispetto agli epatociti prodotti in altri metodi10, 11,12.
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Protocol
1. Preparazione dei mezzi di differenziazione
NOT: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per informazioni sul produttore relative ai materiali e ai reagenti utilizzati.
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Preparazione di supporti definiti chimicamente di base (CDM)
NOTA: CDM2, CDM3, CDM4 e CDM5 sono supporti definiti chimicamente che vengono utilizzati come supporti di base per differenziare gli hPSC alle cellule epatiche in varie fasi. La composizione di questi supporti è riportata nella Tabella 1.- Per fare CDM2 o CDM3, preparare una soluzione di stock contenente alcool polivinile (PVA). Sciogliere 0,5 g di polvere di PVA in 50 mL del mezzo di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM) per generare un brodo PVA da 10 mg/mL.
NOT: Poiché il PVA non si scioglie facilmente, preparare la miscela PVA/IMDM in un flacone conico con agitazione continua a 50 gradi centigradi su una piastra di riscaldamento; può essere facilmente ottenuto utilizzando un agitatore magnetico. - Dopo che il PVA è stato disciolto omogeneamente in IMDM, rimuovere la soluzione PVA dal pad di riscaldamento e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente.
- Utilizzare un filtro sterile di 0,2 m per filtrare la soluzione PVA.
- Preparare il CDM2 e il CDM3 combinando il PVA filtrato dal passaggio 1.1.1 e i vari componenti acquistati commercialmente, come descritto nella tabella 1 e nella tabella dei materiali. Utilizzare unità di filtro sterili, 0,2 m per filtrare tutti i supporti.
NOT: Il supporto di base può essere immagazzinato a 4 gradi centigradi, ma per non più di 2 mesi. - Preparare i supporti di base rimanenti CDM4 e CDM5 seguendo la tabella 1.
- Per fare CDM2 o CDM3, preparare una soluzione di stock contenente alcool polivinile (PVA). Sciogliere 0,5 g di polvere di PVA in 50 mL del mezzo di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM) per generare un brodo PVA da 10 mg/mL.
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Preparazione dei mezzi di differenziazione
- Per preparare soluzioni stock per le piccole molecole e fattori di crescita, ricostituirle secondo le raccomandazioni dei produttori. Per lo stoccaggio, l'aliquota in tubi sterili per ridurre i cicli di congelamento-disgelo e mantenere a -20 gradi centigradi o come raccomandato.
NOT: La composizione del mezzo di differenziazione da utilizzare in varie fasi di differenziazione è descritta nella tabella 2 e nelle fasi seguenti. - Per preparare il mezzo di differenziazione, scongelare prima le piccole molecole congelate e/o i fattori di crescita a temperatura ambiente. Successivamente, aliquota fuori la quantità richiesta di supporto di base. Infine, preparare il supporto di differenziazione finale aggiungendo le piccole molecole e i fattori di crescita specificati al supporto di base alle concentrazioni appropriate (Tabella 2).
NOT: Il mezzo di differenziazione appena preparato dovrebbe idealmente essere utilizzato nello stesso giorno; in caso contrario, può essere conservato a 4 gradi centigradi e utilizzato entro tre giorni. - Utilizzando una punta di pipetta, mescolare il supporto di differenziazione più volte per garantire che gli integratori siano distribuiti omogeneamente prima di aggiungere il mezzo alle cellule (ad esempio, aggiungere 1 mL di mezzo di differenziazione a ogni pozzo di una piastra di 12 pozze.)
- Per preparare soluzioni stock per le piccole molecole e fattori di crescita, ricostituirle secondo le raccomandazioni dei produttori. Per lo stoccaggio, l'aliquota in tubi sterili per ridurre i cicli di congelamento-disgelo e mantenere a -20 gradi centigradi o come raccomandato.
2. HPSC di seme su piastre a densità definite per la differenziazione
- Plastica di coltura cellulare cappotto che verrà utilizzata per la semina con hPSCs.
- Scongelare la matrice (ad esempio, Geltrex) a 4 gradi centigradi durante la notte prima del giorno di utilizzo.
- Il giorno successivo, diluire la matrice 1:100 aggiungendo 500 l di matrice in 50 mL di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/F12 di Dulbecco. Poiché la matrice è un idrogel che polimerizza in modo irreversibile dall'esposizione alla temperatura ambiente, quando si lavora con la matrice, mantenere sempre i tubi della matrice e i supporti sul ghiaccio.
- NOT: La matrice disciolta 1:100 in DMEM/F12 può essere immagazzinata a 4 gradi centigradi, ma deve essere utilizzata entro 2 mesi.
- Per rivestire una piastra di coltura con la matrice, pipetta la matrice diluita nel numero richiesto di pozzi utilizzando un volume sufficiente di soluzione a matrice per coprire la superficie del pozzo (ad esempio, aggiungere 0,5 mL di matrice a un pozzo di una piastra di 12 pozzetti o 1 mL a un pozzo di un 6- piatto). Se necessario, agitare delicatamente la piastra per assicurarsi che la soluzione a matrice abbia completamente coperto il fondo del pozzo.
- Lasciare la piastra rivestita a matrice in un'incubatrice di 37 gradi centigradi per almeno 60 min. A questa temperatura, la matrice polimerizza per formare una pellicola sottile nella parte inferiore del pozzo.
- NOT: Le piastre rivestite a matrice possono essere conservate nell'incubatrice a 37 gradi centigradi e utilizzate entro 3 giorni, purché la matrice non si sia prosciugata.
- Aspirare la soluzione a matrice rimanente dai pozzi rivestiti immediatamente prima di seeding i pozzi con hPSCs.
- Passare e seminare le piastre rivestite con hPSCSNOTE: L'agente di dissociazione contiene enzimi che dissociano le cellule ed è importante lasciare gli hPSC nell'agente di dissociazione per un periodo di tempo il più breve possibile.
- Per le piastre di coltura rivestite a matrice di semi con hPSC prima della differenziazione, far crescere hPSC indifferenziati per >70% confluenza in supporto mTeSR1 disponibile in commercio (Tabella dei materiali) secondo il protocollo del produttore. È fondamentale passare hPSC prima che diventino completamente confluenti, in quanto gli hPSC possono differenziarsi spontaneamente ad alta confluenza.
NOTA: gli hPSC devono essere cariyoti per garantire che non vi siano anomalie cromosomiche prima di utilizzarle per gli esperimenti. Gli hPSC utilizzati per questo protocollo di differenziazione sono stati mantenuti nei supporti mTeSR1 e sono stati passaggia come grumi con EDTA per ridurre al minimo le anomalie cariotipiche. Gli hPSC karyotipicamente anormali non devono essere utilizzati per la differenziazione, in quanto potrebbero proliferare in modo anomalo rapidamente; quindi le densità di semina delle cellule raccomandate qui non sono appropriate per le cellule cariotipicamente anormali. - Per inizializzare le hPSC per differenziarla, aspirare mTeSR1 da colture hPSC in gran parte confluente e aggiungere agente di dissociazione acquistato commercialmente (Tabella dei materiali) per dissociare gli hPSC, utilizzando un agente di dissociazione sufficiente a coprire la superficie del bene o piatto su cui le cellule stanno crescendo (ad esempio, aggiungere 0,5 mL dell'agente di dissociazione per pozzo di una piastra di 12 pozzetti, 1 mL per pozzo di una piastra di 6 pozzetti o 3 mL per 10 cm piatto).
- Incubare gli hPSC nell'agente di dissociazione a 37 gradi centigradi per 5 min o fino a quando alcune colonie iniziano a staccarsi. Toccare delicatamente il fondo del pozzo / piastra più volte; dopo alcuni minuti di dissociazione, la maggior parte delle colonie hPSC dovrebbe essere liberamente in sospensione.
- Per spostare gli hPSC dissociati dalla piastra, aggiungere 2 mL/pozzetto di DMEM/F12 se si lavora con una piastra a 6 pozzetti (o 1 mL/bene se si lavora con una piastra di 12 pozzetti) per diluire l'agente di dissociazione. Utilizzare una pipetta sierologica da 5 mL per pipettare delicatamente su e giù più volte per lavare via tutte le cellule dalla superficie del pozzo; raccogliere le singole celle risospese in un tubo conico da 50 mL. Lavare la piastra una seconda volta con lo stesso volume di DMEM/F12 per garantire il recupero di tutti gli hPSC.
- Al tubo conico da 50 mL contenente le cellule, aggiungere DMEM/F12 per diluire il volume originale dell'agente di dissociazione di 1:5-1:10 (ad esempio, se il volume originale dell'agente di dissociazione era di 1 mL, regolare il volume totale della sospensione cellulare a 10 mL con DMEM/F12 per diluire l'agente di dissociazione all'1:10)
- Centrifugare gli hPSC raccolti in un tubo conico da 50 mL a 350 x g per 3 min a 4 gradi centigradi per le cellule a pellet.
- In attesa che le cellule a pellet, matrice aspirare dalla piastra in cui verrà seminato l'hPSCS. Successivamente, aggiungere una quantità sufficiente di mTesR1 integrata con 1 mdi di tiazovivina commercialmente ottenuta (un inibitore farmacologico ROCK) ai pozzetti per coprirli (ad esempio, aggiungere 0,5 mL mTeSR1 per pozzetto di una piastra di 12 pozzetti o 1 mL di mTeSR1 per pozzo di 6 pozzetti).
NOT: La thiazovivin a bassa concentrazione è inclusa in questo passaggio per migliorare la sopravvivenza delle singole cellule e quindi la successiva densità di semina degli hPSC. - Dopo la centrifuga hPSCs, aspirare con attenzione il supernatante, lasciando gli hPSC pelleta nella parte inferiore del tubo conico. Il supernatante contiene agente di dissociazione che inibirà la successiva adesione di hPSC e quindi, è importante aspirare la grande maggioranza del supernatante prima di procedere.
- Risospendere il pellet cellulare in mTeSR1 integrato con 1 Mdi di tiazovivina. Con una pipetta p1000, triturare delicatamente 2-3 volte per riutilizzare uniformemente il pellet cellulare in una singola sospensione cellulare. Non triturare troppo il pellet cellulare in quanto l'eccessiva forza meccanica danneggerà gli hPSC e porterà a una scarsa sopravvivenza delle cellule.
- Dopo la sospensione degli hPSC, immediatamente pipetta 10 -L della sospensione in un emocitometro e contare il numero di cellule. È importante pipette cellule per il conteggio il più rapidamente possibile, come gravità porterà a hPSCs naturalmente stabilirsi nella parte inferiore del tubo 50 mL, che confonderà il conteggio accurato delle celle.
- Regolare il volume degli hPSC risospesi con mTeSR1 con triamovita per ottenere la concentrazione cellulare desiderata per la placcatura. Ad esempio, dopo aver regolato il volume degli hPSC risospesi, aggiungere 0,5 mL della sospensione cellulare per pozzo per seed 160,000-250,000 celle in ogni pozzo di una piastra di 12 pozzetti, ottenendo così un volume totale di 1 mL in ogni pozzo (0,5 mL di supporti è stato aggiunto al pozzo nel passaggio 2.2.7). Se si utilizzano pozzi più grandi o più piccoli, scalare i numeri di cella/volumi multimediali verso l'alto o verso il basso di conseguenza.
NOT: È importante seedhPSCs alla densità cellulare indicata. Gli hPSC eccessivamente confluenti non si differenziano in modo efficiente e gli hPSC sotto-confluenti non sopravviveranno bene durante la differenziazione. - Agitare la piastra in un modello trasversale (a sinistra, poi a destra; in avanti, quindi all'indietro) più volte per assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente attraverso la piastra / bene. Non girare la piastra in un movimento circolare, in quanto le celle si stabiliranno al centro della piastra / bene. Tipicamente, hPSCs inizierà ad aderire alla superficie del pozzo all'interno di 3-30 min . Consentire alle cellule di crescere per almeno 24 h prima di iniziare la differenziazione.
- Per le piastre di coltura rivestite a matrice di semi con hPSC prima della differenziazione, far crescere hPSC indifferenziati per >70% confluenza in supporto mTeSR1 disponibile in commercio (Tabella dei materiali) secondo il protocollo del produttore. È fondamentale passare hPSC prima che diventino completamente confluenti, in quanto gli hPSC possono differenziarsi spontaneamente ad alta confluenza.
3. Differenziazione degli hPSC nelle cellule endodermiche e nei progenitori del fegato
- Dopo che gli hPSC sono stati placcati per almeno 24 ore (come descritto al punto 2.2.12), prima di procedere con la differenziazione, controllare la morfologia delle cellule al microscopio a contrasto di fase, con particolare attenzione al diametro e alla densità delle colonie hPSC placcate.
NOT: Idealmente, i grumi dovrebbero essere facilmente distanziati e di dimensioni e densità appropriate in tutto il ben prima del passaggio 3.2. Le colonie grandi (circa >400 m) o di piccole dimensioni (circa <200 m) di hPSC non sono utilizzabili per la differenziazione (Figura4). I segnali di differenziazione non agiranno in modo uniforme in tutte le grandi colonie hPSC, portando a una differenziazione inefficiente. Le colonie troppo piccole non sopravvivono bene durante i primi 3 giorni di differenziazione hPSC in questo protocollo di differenziazione. Se la densità degli hPSC di semi è corretta, le colonie hPSC spesso formano "ponti" di cellule tra di loro e la confluenza complessiva sarà di 30-50% prima di aggiungere il mezzo di differenziazione del primo giorno (Figura 4). - Se le dimensioni delle colonia sono ideali nel passaggio 3.1, procedere al giorno 1 di differenziazione, che comporta la differenziazione degli hPSC in una striscia primitiva anteriore (APS).
- Preparare il giorno 1 supporto di differenziazione APS mescolando tutti i reagenti descritti nella tabella 2 utilizzando CDM 2 (tabella 1 e sezione 1.2) come mezzo di base. Pipet per mescolare più volte per garantire la distribuzione uniforme dei componenti nel supporto.
- Aspirare per rimuovere la tiazovivina integrato mTeSR1 dagli hPSC placcati e lavare brevemente hPSCs con supporti IMDM. Non lavare con fosfato tamponato salina (PBS) invece di IMDM, in quanto PBS manca di ioni di calcio (Ca2 )ed è quindi tossico per hPSC; interromperà la morfologia cellulare.
- Dopo il breve lavaggio IMDM, aggiungere il giorno 1 medio agli hPSCs. Registrare il tempo e riportare le cellule nell'incubatore a 37 gradi centigradi
- Continuare con i successivi passaggi di differenziazione preparando (Tabella 2) e aggiungendo il rispettivo mezzo di differenziazione alle celle nei rispettivi giorni (a intervalli di 24 h) di differenziazione intorno alla stessa ora del giorno (Figura 1). Sostituire con supporti freschi ogni giorno, anche se giorni consecutivi di differenziazione utilizzano lo stesso supporto di differenziazione. Tra una modifica e l'altro dei supporti, lavare le cellule una volta con i supporti IMDM per rimuovere le cellule morte e il resto dei componenti medi precedenti.
- Come la differenziazione progredisce oltre la fase di germogli di fegato, il numero di cellule aumentae e quindi, aggiungere più media per ogni bene della piastra per garantire che la quantità di fattori di differenziazione e sostanze nutritive non è limitante. Ad esempio, aggiungere 1 mL di differenziazione medio a ogni pozzo di 12-pozzi inizialmente nei giorni da 1 a 6 di differenziazione, ma aggiungere 1,5-2 mL di supporti di differenziazione successivi nei giorni successivi di differenziazione (giorni da 7 a 18 di differenziazione).
4. Caratterizzazione delle cellule endodermiche e dei progenitori del fegato da parte dell'immunostaining
- Preparare il buffer di blocco: 10% siero asino - 0.1% Triton X100 in fosfato deionizzato bufferss salina (DPBS).
- Preparare il buffer di colorazione: 1% siero d'asino - 0,1% Triton X100 in DPBS.
- Mezzo aspirato da cellule in piastra 12-well.
- Aggiungere 4% paraformaldeide (in DPBS) per 15 min a temperatura ambiente per fissare le cellule e poi lavare le cellule due volte con DPBS.
- Aggiungere il buffer di blocco per 1 h a temperatura ambiente per bloccare e permeabilizzare le celle fisse.
- Aspirare la soluzione di blocco e aggiungere anticorpo primario diluito nel buffer di colorazione. (Vedere tabella dei materiali per i rapporti di diluizione degli anticorpi.)
- Macchiare le cellule durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Lavare le cellule tre volte con 0.1% Triton X100 in DPBS.
- Aggiungere la macchia dell'anticorpo secondario nel tampone di colorazione per 1 h a temperatura ambiente. (Vedere la Tabella dei materiali per le diluizioni di anticorpi secondari.)
- Rimuovere l'anticorpo secondario e aggiungere DAPI per 5 min a temperatura ambiente per condurre controstain nucleare.
- Lavare due volte con 0,1% Triton X100 in DPBS per rimuovere l'anticorpo in eccesso e DAPI.
- Condurre la microscopia a fluorescenza con un osservatore di zeiss D1. In alternativa, conservare la piastra in 4 gradi centigradi fino a quando non viene eseguita l'imaging. Per i risultati attesi, vedere la figura 3.
5. Caratterizzazione dei progenitori del fegato mediante fluorescenza activated Cell-sorting (FACS) Analysis
NOT: Utilizzare FACS per quantificare con precisione la percentuale di cellule LB differenziate AFP che emergono entro il giorno 6 di differenziazione. Seguire gli stessi passaggi per quantificare la percentuale di epatociti differenziati alFAb al giorno 18 della differenziazione.
- Coniugare un anticorpo anti-AFP.
- Aggiungere il phycoerythrin all'anticorpo anti-AFP ad una concentrazione di (0,55 g/l) utilizzando il kit di coniugazione R-phycoerythrin (vedere Tabella dei materiali).
NOT: Assicurarsi che gli anticorpi siano purificati e ricostituiti in tamponi che non contengono ammine. Assicurarsi che la quantità di anticorpi utilizzati in una reazione di etichettatura deve essere inferiore alla quantità di PE (vale a dire, 60 g di anticorpi con 100 g di PE). Una scarsa coniugazione di anticorpi può portare a risultati inaffidabili. - Aggiungere 1 : L del reagente modificatore per 10 - L di anticorpo da etichettare. Mescolare delicatamente.
- Rimuovere il mix R-PE (100 o L) e pipettala la miscela di cui sopra direttamente nel materiale R-PE lyophilizzato.
- Posizionare il tappo indietro e lasciare la fiala in piedi per 3 h al buio a temperatura ambiente.
- Dopo l'incubazione per 3 h o più, aggiungere 1 ll di reagente quencher per 10 -L di anticorpo utilizzato. Il coniugato può essere utilizzato dopo 30 min.
- Conservare l'anticorpo coniugato a 4 gradi centigradi.
- Lavare hPSC differenziati o indifferenziati in formato 6-pozzi con DMEM/F12.
- Trattare brevemente con agente di dissociazione (1 mL/pozzo in una piastra 6-po' di pozzi) per 5 min a temperatura ambiente fino a quando le cellule non si staccano. Raccogliere e macchiare sia le cellule hPSC indifferenziate che le cellule progenitrici del fegato differenziate in modo identico e analizzare in parallelo nello stesso esperimento per garantire la specificità della colorazione degli anticorpi.
- Toccare delicatamente la piastra Petri per staccare le cellule. Utilizzare una pipetta p1000 per staccare le cellule dalla piastra e raccogliere le cellule in un tubo conico da 50 mL. Assicurarsi che le celle si siano per lo più staccate prima di procedere con il passaggio successivo. Successivamente, lavare i pozzi due volte di più con 1xDPBS tampone per raccogliere le cellule residue.
- Nel tubo conico 50mL, diluire agente di dissociazione in 5 volumi di 1x buffer DPBS. Triturare rigorosamente 3-4 volte con una pipetta p1000 per garantire che tutte le cellule siano dissociate in singole cellule.
NOT: È imperativo generare singole cellule prima della centrifugazione o i grumi successivamente non possono essere dissociati con facilità. Tuttavia, non troppo-trituratore in quanto questo può danneggiare l'integrità delle cellule. Contare il numero di cellule e utilizzare la proporzione raccomandata di cellule al rapporto anticorpo, che è stato precedentemente ottimizzato per il rilevamento di sfondo minimo e massimo segnale. - Centrifuga tubo conico contenente la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Aspirare il supernatante con cura di non disturbare il pellet cellulare.
- Risospendere accuratamente il pellet cellulare nel buffer di fissaggio/perm per generare una sospensione a cella singola e fissare sul ghiaccio a 4 gradi centigradi per 20 min. Nota per trasferire in un tubo di microcentrifuga da 2 mL. Inoltre, l'uso di un tubo di microcentrifuga da 2 mL in questa fase consente al pellet cellulare di depositarsi nell'angolo a forma di V del tubo, riducendo al minimo la perdita di cellule durante i fusti.
- Lavare ogni pellet con 1,8 mL di tampone perm/lavaggio due volte. Risospendere accuratamente il pellet cellulare nel buffer perm/lavaggio mediante pipette mescolando 6 volte con una pipetta p1000. Quindi, centrifugare, rimuovere supernatante e ripetere il processo di lavaggio con 1,8 mL di tampone perm/lavaggio.
- Risospendere il pellet cellulare nel buffer perm/lavaggio in modo che ci siano 100 macchie l-individual e successivamente trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga da 2 mL.
NOT: È imperativo generare una sospensione unicellulare in questo passaggio prima della colorazione dell'anticorpo. Gli aggregati di cellule non saranno macchiati e quindi confonderanno l'analisi FACS. Inoltre, l'uso di un tubo di microcentrifuga da 2 mL in questa fase consente al pellet cellulare di depositarsi nell'angolo a forma di V del tubo, riducendo al minimo la perdita di cellule durante i fusti. - Dopo aver ridato le cellule nel buffer FACS, in singoli tubi da 2 mL (sia per il controllo non macchiato che per i campioni macchiati di anticorpi).
- Macchie con 0,33 cellule anti-AFP-PE per 150.000 cellule per 30 min a temperatura ambiente al buio. Ad esempio, per una macchia individuale di 100 l, macchia come segue: 0,33 l di a-AFP PE e 100 L di perm/wash buffer. Risospendere bene le cellule con p200 pipetta per garantire anche la colorazione.
NOT: Solo pipet-mix e non vortice in quanto questo può ridurre la stabilità delle proteine. - Lavare, rispendere le cellule due volte in 1-2 mL di perm/wash buffer (1,9 mL/macchia individuale) e centrifugare a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Lavare le cellule con non meno di 1-2 mL di perm/wash buffer per garantire un lavaggio sufficiente.
NOT: Solo pipette mescolare e non vortice in quanto questo può ridurre la stabilità delle proteine. Dopo la centrifuga, aspirare supernatante con attenzione per evitare che le cellule si sciolgano e rimuovere il maggior numero possibile di supernatali per ridurre al minimo il riporto dell'anticorpo e garantire un lavaggio più completo. - Risospendere ogni pellet lavato in 300 , lofun di tampone di perm/lavaggio e filtrarlo attraverso un filtro da 100 m in un tubo FACS per filtrare grandi ciuffi di cellule prima dell'analisi FACS.
- Analizzare le cellule su una citometria del flusso FACS Aria sul canale PE. Analizzare un minimo di 10.000 eventi per ogni singola colorazione e analizzare gli eventi in virtù dell'analisi FSC-A/SSC-A, selezionare i singlet di cella gating su FSC-W/FSC-H seguito da SSC-H/SSC-W.
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Representative Results
Dopo 24 h di differenziazione APS, le colonie adotteranno generalmente una morfologia diversa da quella delle colonie indifferenziate concomitanti con una perdita del confine luminoso che tipicamente circoscrive le colonie hPSC. Morphologically, le cellule di streak primitive hanno generalmente bordi irregolari e sono più diffuse e meno compatte rispetto agli hPSCs - questo evoca una transizione epiteliale-mesenchymica, poiché le cellule epiblaste pluripotenti differenziano e si inleggono nella primitiva striscia in vivo. Se la dimensione della colonia degli hPSC prima della differenziazione era troppo grande, ci sarà un centro sovrasollevato che comprende cellule indifferenziate. Le colture contenenti tali grossi ciuffi dovrebbero essere scartate, poiché questi centri di colonia indifferenziati confonderanno la successiva differenziazione. Se sono stati placcati grumi di dimensioni e densità corrette, la differenziazione APS è altamente riproducibile e uniforme, generando un 99,3-0,1% MIXL1-Gfp- popolazione di striature primitive (MIXL1 è un indicatore di striature primitive)7. Si noti che alcuni decessi tra le cellule si osservano dopo 24 h di differenziazione APS.
Entro il secondo giorno di differenziazione, le cellule di streak primitive si sono differenziate nel giorno 2 cellule endodermiche definitive, la maggior parte delle quali esprime SOX17 (Figura2) e FOXA2. In decine di esperimenti indipendenti con 14 linee hESC e hiPSC (tra cui H1, H7, H9, HES2, HES3, BJC1, BJC3, HUF1C4 e HUF58C4), questo approccio ha generato in modo scalabile, coerente ed efficiente le popolazioni di endodermi definitive (94,0% - 3,1%). Questo metodo per generare endodermi definitivi da hPSC produce percentuali più elevate di CXCR4-PDGFRA- popolazioni endodermiche rispetto ad altri approcci di formazione di endodermi 2,14.
Al terzo giorno di differenziazione, l'endoderma si è differenziato in progenitori di suffragio che appaiono di forma poligonale (Figura 1). Più tardi, da 6 giorni di differenziazione, i progenitori del pregresso si differenziano in progenitori di fegato di fegato che esprimono AFP, TBX3 e HNF4A (Figura 3). Su tre linee hESC (H1, H7, H9 hESC), questo metodo genera il formato di progenitori a base di 6 AFPe fegato con un'efficienza di 89,0 - 3,1% (Figura 2). Infine, dopo 18 giorni di differenziazione del fegato dagli hPSC, appaiono ALBUMIN- cellule simili a epatociti. Morfologicamente, appaiono epiteliali, formando bordi luminosi che ricordano canaliculi biliari (Figura 1). In questa fase, il citoplasma del giorno 18 hPSC-derivato epatociti appare più scuro del nucleo (Figura 1).
Figura 1: Schematica della strategia di differenziazione e morfologia di hPSC indifferenziati, differenziante endodermo e cellule simili agli epatociti. Sono stati mostrati il processo di differenziazione e la sequenza temporale. Abbreviazioni: d - giorno, hPSC - cellule staminali pluripotenti umane, APS - striscia primitiva anteriore, DE - endoderma definitivo, PFG - prevvedente posteriore, LB - progenitori del budtore del fegato, progenitori di epatito, HEP - epatocito come cellule. Barra della scala: 400 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Percentuale del giorno 1 Striscia primitiva MIXL1, giorno 2 SOX17 endoderma definitivo (def), giorno 6 progenitori del germoglio epatico AFP e popolazioni di epatociti ALB, come mostrato da FACS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi immunostaining dei progenitori epatici del giorno 6. HPSC sono stati prima differenziati in progenitori di germogli di fegato di fegato, che sono stati immunostained per i fattori di trascrizione delle gemme del fegato HNF4A (rosso), TBX3 (verde) così come citoplasma marcatore di germogli di fegato AFP (rosso). I nuclei sono stati controstati con DAPI (blu) per valutare il numero totale di cellule. Barra della scala: 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Densità di semina delle celle di hPSC. Bassa (sinistra) e appropriata (medio e destra) densità di semi di cellule. Barra della scala: 1.000 m. La freccia indica "ponti" tra colonie di cellule. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Mezzo di base | Composizione del supporto di base |
| CDM2 (in modo inseimi in | 1:1 IMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% di lipidi concentrati, 0,7 g/mL di insulina ricombinante umana, 15 gradi/mL Transferrin, 18 nM 1-thioglycerol |
| CDM3 (in modo instato | 1:1 IMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% di lipidi concentrati, 10% KOSR |
| CODICE DI configurazione | IMDM/F12, 1% di lipidi concentrati, 15 g/mL Transferrin |
| Codice DI sistema | CMRL, 10% KOSR, 1% Glutamax |
Tabella 1: Composizione dei supporti definiti chimicamente CDM2, CDM3, CDM4 e CDM5.
| Fasi di differenziazione | durata | Fattori | Dosi | Mezzo di base |
| Giorno 1 Striscia primitiva | 1 giorno | Activin | 100 ng/mL | |
| CHIR99201 | 3 M | CDM2 (in modo inseimi in | ||
| PI103 (informazioni in stato in | 50 nM | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| Giorno 2 Endoderm Definitivo | 1 giorno | Activin | 100 ng/mL | |
| DM3189 | 250 nM | CDM2 (in modo inseimi in | ||
| PI103 (informazioni in stato in | 50 nM | |||
| Giorno 3 Foregut Posteriore | 1 giorno | A83-01 | 1 M | |
| TTNPB | 75 nM | CDM3 (in modo instato | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| Giorno 6 Fegato Bud progenitori | 2 giorni | Activin | 10 ng/mL | |
| C59 (in questo conto in questo i | 1 M | CDM3 (in modo instato | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskolin | 1 M | |||
| 1 giorno | Activin | 10 ng/mL | ||
| CHIR99201 | 1 M | CDM3 (in modo instato | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskolin | 1 M | |||
| Giorno 12 Progenitori epatici | 6 giorni | BMP4 | 10 g/mL | |
| Osm | 10 ng/mL | |||
| Desametasone | 10 M | |||
| Forskolin | 10 M | CODICE DI configurazione | ||
| Ro4929097 | 2 M | |||
| AA2P | 200 g/mL | |||
| insulina | 10 g/mL | |||
| giorno 18 Epatociti | 6 giorni | Desametasone | 10 M | |
| Forskolin | 10 M | CDM4 o | ||
| Ro4929097 | 2 M | Codice DI sistema | ||
| AA2P | 200 g/mL | |||
| insulina | 10 g/mL |
Tabella 2: Composizione dei supporti di differenziazione.
| problema | Possibile motivo | Soluzione Proffered |
| Le cellule al centro della colonia non si differenziano | i) Le dimensioni della colonia erano eccessivamente grandi, le cellule al centro delle grandi colonie non erano accessibili ai segnali di differenziazione | i) Controllare il technqiue di conteggio cellulare. |
| ii) Distribuzione irregolare di gruppi che si fondono insieme al centro del pozzo (o la sua periferia), formando colonie molto grandi | ii) Agitare la piastra in modo trasversale per distribuire uniformemente i grumi durante la placcatura e controllare al microscopio prima di infilarla nell'incubatrice | |
| iii) Le cellule hanno ricevuto segnali di differenziazione insufficienti | iii) Aggiungere volumi adeguati di supporti di differenziazione: aggiungere 1 mL di mezzo per pozzo in una piastra di 12 pozzetti e 3 mL per pozzo in una piastra a 6 pozzetti | |
| Scarsa efficienza di differenziazione | i) Iniziare la coltura cellulare parzialmente differenziata | i) Utilizzare un nuovo lotto di hPSC indifferenziati |
| ii) Le colonie erano troppo densamente seminati, formando un foglio confluente di cellule | ii) Cellule di semi e contare le cellule con precisione per la differenziazione, e scuotere in modo uniforme per distribuirli | |
| iii) I supporti residui e i segnali indesiderati non sono stati lavati via a causa di un | iii) I mezzi di induzione o residui a partire dalla precedente fase di differenziazione bloccheranno la differenziazione; cellule di lavaggio con IMDM prima di aggiungere il mezzo di differenziazione | |
| iv) Lavaggio troppo duro; condizioni di lavaggio inadeguate interromperanno gravemente la morfologia cellulare | iv) Prima di aggiungere un mezzo di differenziazione, lavare brevemente con IMDM. L'uso di DPBS (o supporti con osmolarità diversa o supporti freddi) o lavaggio esteso, comprometterà la morfologia e la vitalità delle cellule | |
| v) Periodo prolungato o ridotto di fasi di differenziazione, più lungo o più breve del consigliato. | v) Rispettare i tempi consigliati per ogni fase di differenziazione. |
Tabella 3: Possibili problemi e le loro possibili cause e soluzioni.
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Discussion
Questo metodo consente la generazione di popolazioni arricchite di progenitori di germogli di fegato, e successivamente cellule simili a epatociti, da hPSCs. La capacità di generare popolazioni arricchite di cellule epatiche umane è importante per l'utilizzo pratico di tali cellule. I metodi precedenti per generare epatociti da hPSC hanno prodotto popolazioni di cellule impure contenenti cellule epatiche e non epatiche che, dopo il trapianto in roditori, hanno prodotto ossa e cartilagine oltre al tessuto epatico15. Quindi la soppressione esplicita della differenziazione non-fegato è fondamentale per generare popolazioni di fegato arricchite che potrebbero essere adatti per una varietà di applicazioni.
In particolare, la placcatura controllata degli hPSC nella prima fase è essenziale per un'efficiente differenziazione a valle. È importante placcare accuratamente i sistemi hPSC ad una certa densità per la differenziazione e distribuire uniformemente questi hPSC attraverso il pozzo o la piastra durante il processo di placcatura. Ad esempio, per ogni pozzo di una piastra da 12 pozzetti, seme da 160.000 a 250.000 hPSC per pozzo; nel complesso, è imperativo mettere in titolazione della densità di semina cellulare e, in ultima analisi, testare la densità cellulare appropriata per ogni linea cellulare (Figura 4). Se troppi hPSC sono semi per pozzo, formeranno grandi colonie, che influenzeranno negativamente l'efficienza di differenziazione, poiché le cellule nel mezzo di grandi colonie sono meno accessibili ai segnali di differenziazione rispetto alle cellule vicine alla periferia; colonie di dimensioni eterogenee presenteranno anche questioni simili. Se le densità delle cellule sono troppo basse (ad esempio, al di sotto di 200.000 cellule/pozzo di una piastra di 12 pozze), allora potrebbe non esserci materiale sufficiente per la differenziazione e può essere osservata una morte estensa nelle cellule. Il metodo di passaggio e seeding descritto in precedenza genera costantemente grumi hPSC di dimensioni adeguate per la differenziazione a valle.
Una limitazione di questo metodo è che le cellule simili agli epatociti generate non sono identiche agli epatociti adulti, poiché le cellule derivate da hPSC esprimono ancora un marcatore epatico immaturo AFP. Inoltre, l'attività enzimatica CYP3A4 è circa 55 volte inferiore in queste cellule simili agli eatociti derivati da hPSC rispetto agli epatociti umani adulti primari. Una prossima sfida sarà quella di far maturare queste cellule simili a quelle di epatociti derivate da hPSC in cellule a pieno titolo, simili a adulti. Una seconda limitazione è che una differenziazione efficiente è estremamente dipendente dalla densità iniziale delle cellule e, pertanto, è molto importante eseguire il seme alla densità raccomandata e disperderle uniformemente attraverso la piastra (Tabella 3).
Nel complesso, questo protocollo produce progenitori di gemme epatiche e cellule simili a epatociti a 89,0-3,1% purezza in almeno 3 linee hPSC. In secondo luogo, le cellule simili agli epatociti esprimevano enzimi epatici, secernevano l'ALBUMIN umano ed esprimevano livelli più elevati di geni epatici rispetto alle cellule generate utilizzando approcci di differenziazione esistenti. Infine, le cellule simili agli epatociti risultanti non solo presentano alcune funzioni epatociti in vitro, ma soprattutto possono funzionare in una certa misura in vivo, in quanto possono innestare un modello murino di lesioni epatiche croniche e migliorare la sopravvivenza a breve termine2 .
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Bing Lim per le discussioni e lo Stanford Institute for Stem Cell Biology & Regenerative Medicine per il supporto infrastrutturale. Questo lavoro è stato sostenuto dal California Institute for Regenerative Medicine (DISC2-10679) e dallo Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (a L.T.A. e K.M.L.) e dallo Stanford Beckman Center for Molecular and Genetic Medicine, nonché dall'Anonymous, baxter e DiGenova (a K.M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| Human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| Human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| Human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
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