Summary
Este estudo descreve um alto throughput, com base em imagens de ensaio de microneutralização para determinar o título de anticorpos neutralizantes específicos para o vírus sincicial respiratório (VSR). Este formato de ensaio foi testado em tipos diferentes de amostra.
Abstract
Respiratórios sincicial vírus específicos anticorpos neutralizantes (RSV NAbs) são um importante marcador de proteção contra RSV. Um número de formatos diferentes de ensaio está atualmente em uso em todo o mundo para que haja a necessidade de um método de precisão e alta produtividade para medir RSV NAbs. Descrevemos aqui um ensaio de microneutralização com base em imagem que foi testado no subgrupo RSV A e também pode ser adaptado para o subgrupo RSV B e tipos de amostras diferentes. Este método é altamente reprodutível, com variações inter-ensaio para o soro de referência, sendo menos de 10%. Acreditamos que este ensaio pode ser prontamente estabelecido em muitos laboratórios em todo o mundo a um custo relativamente baixo. Desenvolvimento de um ensaio melhorado, elevado-throughput que mede RSV NAbs representa um significativo passo em frente para a padronização deste método internacionalmente, bem como sendo fundamental para a avaliação dos candidatos de vacina RSV romance no futuro.
Introduction
Vírus sincicial respiratório (VSR) é a principal causa de infecções do trato respiratório inferior na população pediátrica em todo o mundo1. Apesar de sua alta carga, não há ainda nenhuma vacina ou tratamento disponível. Desde 2013, a Organização Mundial de saúde (OMS) declarou-se desenvolvimento de vacina RSV como uma prioridade de pesquisa principais, com anual WHO consulta reuniões2,3. A OMS chegou a acordo sobre uso de RSV neutralizando a medição de anticorpo (NAb) para monitorar a imunogenicidade da vacina, como isto é reconhecido como o principal marcador serológico de proteção4. NAbs foram mostrados para proteger contra uma grave infecção pelo VSR em um número de estudos, bem como ensaios clínicos do palivizumab anti-VRS monoclonal anticorpo, atualmente a estratégia profilática apenas disponível4.
Existem vários formatos de ensaio NAb usados pelos laboratórios em todo o mundo, incluindo ensaios baseados em molecular e celular, que têm feito esforços de padronização desafiando5,6,7,8. No entanto, o ensaio de neutralização (PRN) placa convencional-redução que mede o número de placa reduzida, formando unidades (PFU) pela presença de um anticorpo específico RSV continua a ser o padrão-ouro9. Aqui, nós relatamos um protocolo PRN melhorado, simplificado e alta produtividade que pode ser usado em inúmeras linhas de célula, por diferentes cepas de RSV e com taxa de transferência maior do ensaio. Este protocolo foi testado usando amostras clínicas de diferentes configurações, bem como em amostras de experiências modelo animal.
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Protocol
Nota: Todos os passos tem que ser executada em uma capa de BSL2, a menos que indicado de forma diferente. Titulação viral é necessária com antecedência um ensaio PRN para determinar a concentração ideal de RSV utilizada no ensaio de PRN. Recomenda-se alíquota as reservas de vírus em um pequeno volume que será descongelado uma vez e usado para cada ensaio de NAb. Também é recomendável utilizar o mesmo estoque viral para todos os ensaios de NAb realizados para todas as amostras de um estudo. Certifique-se de meios de cultura e tampão fosfato salino (PBS) é aquecido a 37 ° C antes de adicionar placas de célula.
1. RSV titulação Viral
Nota: Dependendo do número de reservas de vírus e o número de duplicatas, a placa de ensaio pode ser configurada de acordo com a Figura 1. Cada estoque de vírus deverá ser titulado em triplicado abaixo da placa de ensaio, começando com a mais alta concentração viral (ou seja, 01:10). Titulações seriais podem ser normalmente 01:10. Cultura de pilha A549 e manutenção, bem como o procedimento de cultura RSV é feito usando os procedimentos padrão e não estão incluídos neste protocolo.
- Semeadura de placas (1 dia)
- Ressuspender as células A549 de Dulbecco Eagles modificado médio (DMEM) + 10% de soro fetal bezerro (FCS) + 1000 UI penicilina/estreptomicina (caneta/estreptococos) em 4 x 105/mL. Semente de 96 poços de fundo plano estéril placas com 100 μL/poço contendo células de 4 x 104 A459.
- Incubar as placas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO2 (células será no crescimento log-fase).
Nota: Use o novo frasco de célula A549 após 23 passagens. É aconselhável não iniciar os experimentos quando um novo frasco de célula está ainda nas primeiro de três passagens.
- Infecção por vírus (dia 2)
- Preparação de diluição serial de vírus
- Descongele rapidamente um único frasco congelado do VRS em um banho de água de 37 ° C até quase completamente descongelados e coloque imediatamente no gelo. Prepare-se 3 repetições para cada RSV estoque de vírus para ser analisada, usar uma diluição de vírus inicial de 01:10 com 100 μL de vírus/bem diluído e reserve pelo menos uma coluna para o controle negativo.
Nota: A Figura 1 mostra o controlo negativo em triplica. - Adicionar 100 μL de cada vírus diluído em 01:10 em triplicado de linha A de um U-fundo de 96 poços placa estéril. Adicionar 90 μL/poço de DMEM + 1000 UI pen/estreptococo sem FCS para linhas B-H.
- Executar serial 01:10 diluições abaixo da placa através da transferência de 10 μL de linha A linha solução B. Mix por pipetagem conteúdo e descer 5 vezes e continuar as diluições dez vezes até linha H. descarte o final 10 μL, para que o volume final em cada bem é 90 μL.
Nota: É importante usar novas dicas para cada diluição.
- Descongele rapidamente um único frasco congelado do VRS em um banho de água de 37 ° C até quase completamente descongelados e coloque imediatamente no gelo. Prepare-se 3 repetições para cada RSV estoque de vírus para ser analisada, usar uma diluição de vírus inicial de 01:10 com 100 μL de vírus/bem diluído e reserve pelo menos uma coluna para o controle negativo.
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Inoculação do vírus às células A549
- Recupere cell plate(s) A549 preparado no dia anterior. Que sejam A549 monocamadas de células nas placas de 96 poços confluente de ~ 80%. Descarte a mídia por inversão suavemente a placa e mancha levemente na toalha de papel absorvente estéril.
- Lavar todos os poços com 100 μL de PBS duas vezes, descarte o excesso PBS por inversão suavemente a placa e mancha levemente na toalha de papel absorvente estéril depois de cada lavagem. Não permita que as placas secar.
- Transferi as diluições de vírus da placa de titulação viral (Figura 1) correspondente aos poços da placa de célula A549. Incube a placa por 1 h a 37 ° C, 5% de CO2. Após incubação de 1 h, decante sobrenadantes usando uma pipeta (para evitar contaminação cruzada). Tire 90 μL/poço.
- Adicionar 100 μL de médio 1 x 199 (M199, consulte tabela de materiais) + 1,5% sal de sódio de carboximetilcelulose (CMC) de baixa viscosidade + FCS 2% contendo caneta/estreptococo a cada poço.
Nota: 2 x M199 + FCS 4% + caneta/inflamada de 2% e 3% soluções CMC precisam ser preparado com antecedência e armazenadas a 4 ° C para uso futuro. Certifique-se que a solução é aquecida a 37 ° C antes de adicionar a placas.- Preparar a solução de x M199 2: 1 sachê/500 mL de água destilada água + 20 mL FCS + 10 mL caneta/estreptococo (para compensar 2 x MI99). Filtre a solução usando uma unidade de filtro de 0,22 μm.
- Para a preparação de 3%, CMC, adicione 15 g de CMC lentamente em 500 mL de água destilada. Dissolva o CMC na água usando aquecedor agitador metálico a 50 ° C, que leva cerca de 1h de preparação. Misture bem para fazer 3% CMC e autoclave a solução.
Nota: O CMC sólido deve ser adicionado à água para ser dissolvido; adição de água para o sólido seco produz uma "moita" de sólido que é muito difícil de dissolver. - Preparar 1 x M199 + baixa viscosidade CMC de 1,5% + 2% FCS contendo caneta/inflamada pela mistura 1:1 a 2 x M199 e 3% CMC preparado na etapa 1.2.2.4.2.
- Incube a placa por 3 dias a 37 ° C, 5% de CO2.
- Preparação de diluição serial de vírus
- Desenvolvimento de placa de ensaio e análise (dia 5)
- Fixação e desenvolvimento do ensaio placa
- Descarte o M199 + CMC + 2% FCS contendo caneta/inflamada por inversão suavemente a placa. Adicionar lentamente (para evitar perturbar a camada de células) 200 μL de tampão de fixação (acetona 80%, 20% de PBS, armazenado a-20 ° C) para reparar as células. Incube a-20 º C por 20 min.
- Descartar o buffer de fixação e borre-se suavemente na toalha de papel absorvente. Deixar o rosto de placa até secar durante 10 min.
Nota: Desta etapa em diante, o ensaio pode ser executado fora do capô BSL2. - Preparar a solução bloqueio diluente de 5% leite em filtrado PBS contendo 0,05% polissorbato 20 (PBS-Polissorbato, consulte Tabela de materiais). Para um prato, calcular o volume necessário para bloqueio baseado em 200/bem e 110 poços: 200/poço x 110 poços = 22 mL (1,1 mL concentrado leite diluente em 20,9 mL filtrados polisorbato-PBS). Nesta fase, também compõem a solução bloqueio suficiente para anticorpos primários e secundários. Para um prato, calcular o volume necessário para cada solução de anticorpo baseada em poços/50 e 110: 50/bem x 110 poços = 5,5 mL. Portanto, o volume total de diluente de leite que obstrui a solução necessária para um ensaio de placa única é 33 mL.
- Adicione 200 pois da solução de bloqueio. Incubar a placa à temperatura ambiente (RT) por 30 min. descarte a solução invertendo-se suavemente a placa e borre na toalha de papel absorvente.
- Prepare 1: 500 anticorpos de cabra X RSV (mAb – anticorpo primário) diluído em solução de bloqueio. Adicionar 50 pois da solução mAb e incubar a 37 ° C por 1 h. placa de lavagem 3 vezes com PBS-Polissorbato filtrada.
- Prepare 1:5,000 burro de Alexa Fluor anti-cabra IgG (anticorpo secundário) diluído em solução de bloqueio. Adicionar 50 pois da solução anticorpo secundário e incubar a 37 ° C por 1 h. placa de lavagem 5 vezes com PBS-Polissorbato filtrada.
- Leia a placa em um leitor de pontos automatizados usando o canal de fluoresceína isotiocianato (FITC) e contar as configurações, conforme mostrado na Figura 2. Embrulhe o prato em folha e armazenar a 4 ° C. Calibre o instrumento, usando uma placa de cultura de 96 poços não utilizadas e introduzir as configurações de contagem antes do ensaio.
Nota: Re-digitalização dentro de alguns dias é possível, se necessário. A calibração e ajuste de contagem podem ser salvos e usados para a verificação futura, caso o ensaio utiliza o mesmo tipo de placa utilizada para a calibração. - Verifique as imagens dos poços para placas de artefato ou monocamadas de células rompidas (Figura 3). Exclua poços com monocamadas de células rompidas.
Nota: Dependendo do tamanho das placas artefacto, contagem manual pode precisar de ser executadas para os poços ou daqueles poços podem precisar ser descartado da análise de dados. Critérios para um resultado válido incluem placas de monocamada ou artefato sem células rompidas detectadas em replicar mais de um bem e não PFU detectado em negativos wells (poços sem vírus adicionado).
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Determinar as concentrações virais
- Escolha as últimas duas diluições onde manchas podem ser contadas claramente. Calcule o número médio de pontos de replicar poços na mesma diluição. Calcule o título viral (PFU / mL) da amostra ações usando a fórmula abaixo:
PFU/mL = número médio de placas / (× fator de diluição Volume de vírus diluído adicionado ao poço)
Nota: A concentração de vírus determinada para cada unidade populacional RSV agora pode ser usada no ensaio de PRN (etapa 2).
- Escolha as últimas duas diluições onde manchas podem ser contadas claramente. Calcule o número médio de pontos de replicar poços na mesma diluição. Calcule o título viral (PFU / mL) da amostra ações usando a fórmula abaixo:
- Fixação e desenvolvimento do ensaio placa
2. RSV neutralização ensaio
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Semeadura de placas (1 dia)
- Resuspenda A549 células em DMEM + 10% FCS + 1000 UI pen/estreptococo em /mL de 4 x 105. Semente de 96 poços de fundo plano estéril placas com 100 μL/poço contendo 4 x 104 A459 células e incubar as placas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO2 (células será no crescimento log-fase).
Nota: Use o novo frasco de célula A549 após 23 passagens. Não é recomendável usar células A549 antes do número de passagem 3.
- Resuspenda A549 células em DMEM + 10% FCS + 1000 UI pen/estreptococo em /mL de 4 x 105. Semente de 96 poços de fundo plano estéril placas com 100 μL/poço contendo 4 x 104 A459 células e incubar as placas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO2 (células será no crescimento log-fase).
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Preparação de soro e vírus (dia 2)
Nota: Dependendo do tipo de amostra, existem etapas necessárias para amostras de pré-processamento antes do ensaio de NAb. É recomendável usar o RSV internacional padrão sera que agora está disponível mediante pedido do Instituto Nacional de padrões biológicos e controles (NIBSC).-
Preparação da diluição do soro
- Descongelar o soro de referência RSV humano (soro de referência, REF) e soro teste amostras em RT. Heat-inativar amostras de soro e referência anti-soro num banho de água a 56 ° C durante 30 min antes de usar. Prepare diluições de acordo com o modelo da placa (Figura 4).
- Preparar a diluição 1: 100 a REF. Prepare um mínimo de 110 μL de REF diluído em DMEM + caneta/estreptococo sem FCS por placa de ensaio (por exemplo,, 1,5 μL de REF em um volume total de 150 μL). Adicionar 110 μL de 1: 100 diluído REF em A12 bem de um U-fundo de 96 poços placa estéril.
- Adicione 55 μL de DMEM + caneta/estreptococo sem FCS poços B12 para H12 na coluna 12. Execute a série diluições de 1:2 para baixo a placa Transferindo 55 μL de linha A linha B, misturando a solução por pipetagem conteúdo e descer 5 vezes e continua até a linha H. Discard o final 55 μL de mídia para que o volume final em cada bem é 55 μL. Use novas dicas para cada diluição.
- Prepare a diluição de 1: 100 de soro teste amostras. Como todas as amostras de soro são doseadas em triplicado, preparar um volume mínimo de 110 μL/poço x 3 = 330 μL por amostra de soro.
- Adicionar 110 μL de cada amostra de soro diluído (1: 100; S1 = soro 1, S2 = soro 2, etc.) para poços correspondentes A1 A9 e também E1 a E9 da placa de 96 poços estéril, de acordo com a Figura 4.
- Adicionar 55 μL de DMEM + caneta/estreptococo sem FCS para todos os poços rotulados X. Perform serial diluições de 1:2, conforme passo 2.2.1.3 até linha D (para amostras 1, 2 e 3). Descarte o final 55 μL de mídia para que o volume final em cada poço é 55 μL. Da mesma forma, executar o serial diluições de 1:2 para amostras 4, 5 e 6 para linhas E-H.
Nota: É importante usar novas dicas para cada diluição. - Adicione 55 μL de DMEM + caneta/estreptococo sem FCS poços nas colunas 10 e 11.
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Preparação do vírus
- Descongele rapidamente um único frasco congelado do VRS em um banho de água de 37 ° C até quase completamente descongelados e coloque imediatamente no gelo.
- Dilua o vírus em DMEM + caneta/estreptococo sem FCS baseada na concentração da alíquota RSV determinada na etapa 1.3.2. Aplica uma diluição que dá aproximadamente 200 PFU/bem. Preparamos um volume total de 5,5 mL (100 poços).
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Preparação da mistura de soro e vírus
- Adicione 55 do vírus diluído para todos os poços de colunas 1-9 e poços de linhas E-H de colunas 10 e 11 (controle positivo), de acordo com o modelo da placa (Figura 4).
- Adicione 55 de DMEM + caneta/estreptococo sem FCS para todos os poços de linhas A-D de colunas 10 e 11 (controle negativo). Incube a placa por 1 h a 37 ° C, 5% de CO2.
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Inoculação do vírus às células A549
- Antes da conclusão do período de incubação, recupere A549 cell plate(s) preparado na etapa 2.1.1. Que sejam A549 monocamadas de células nas placas de 96 poços confluente de ~ 80%.
- Descarte a mídia por inversão suavemente a placa e mancha levemente na toalha de papel absorvente estéril. Lavar todos os poços com 100 μL de PBS duas vezes, descarte o excesso PBS por inversão suavemente a placa e mancha levemente na toalha de papel absorvente estéril depois de cada lavagem. Não permita que as placas secar.
- Transferi 100 pois da mistura de soro e vírus aos poços correspondentes na placa de célula A549, seguindo o modelo de placa incubar a placa por 1 h a 37 ° C, 5% de CO2.
- Depois de 1h, usando uma pipeta, retirar 90/bem e adicionar 100 de pré-aquecido 1 x M199 + 1,5% CMC FCS 2% + caneta/estreptococos. Incube a placa por 3 dias a 37 ° C, 5% de CO2.
Nota: Certifique-se que a solução é aquecida a 37 ° C antes de adicionar a placas.
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Preparação da diluição do soro
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Desenvolvimento de placa de ensaio e análise (dia 5)
- Desenvolva a placa de fixação e ensaio seguindo passos 1.3.1.1 para 1.3.1.8.
- Determinar o título de neutralização de 50%
- Determine que o título de neutralização de 50%, calculando a distância proporcional entre as diluições do soro recíproca acima e abaixo de 50% do controle 'sem soro' poços (controle positivo vírus - coluna 10, linhas E-H).
- Contar o número de PFU (ou seja, placas) decorrentes de infecções virais individuais em poços de soro e não poços de controle do soro. Calcular o número médio de PFU dos poços sem controle de soro e determinar o valor de 50%.
- Identifica as diluições do soro com contagens que são imediatamente acima e abaixo do valor de 50% dos poços sem controle de soro. Usando um gráfico log semi ou modelo de planilha, plotar o número de PFU sobre o eixo x (escala linear) e a diluição do soro recíproca no eixo y (escala de log10 ). Traçar uma linha entre os dois pontos e ler os títulos de neutralização de 50% do teste de amostras de soro desta linha.
Nota: A planilha de ensaio RSV PRN (Planilha complementar) é usada para determinar o título de neutralização de 50%.
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Representative Results
A titulação de um estoque de vírus foi realizada de 01:10 para 01:108 diluição para determinar a concentração de vírus estoque antes do ensaio do PRN (representante resultados mostrados na Figura 5). Da Figura 5, PFU pode ser contada de forma confiável em diluições de 01:104 e 01:105. Foi calculado o número médio de PFU de três vias poços na mesma diluição. Desde o número médio de pontos às 01:105 diluição tinha 14 anos, o título viral desta unidade populacional viral foi determinado como segue:
14 (número médio de pontos) / [10-5 (diluição) x 0,1 mL (volume de inóculo)] = 1,4 x 107 PFU/mL
Usar o acima descrito o método, medimos NAbs para ambos os RSV-A e B em amostras humanas. A Figura 6 demonstra a interpretação de imagens bem das três amostras de soro representativa com diferentes NAb títulos contra RSV-A. A figura 6A mostra bem imagens de titulação da amostra Replica para cada soro representativo (a placa de ensaio real teve três repetições de técnicas). Diluições do soro conforme indicado são diferentes para cada amostra. Poços de controle do vírus que contenham somente vírus e sem soro tem sua média PFU calculado e usado para determinar o limite de 50% de neutralização, que neste exemplo foi 52. Figura 6B ilustra como a titulação do três sera foi determinado usando esse corte. A recíproca de2 log de diluição do soro é plotada no eixo x e o número de PFU como uma porcentagem do controle no eixo y. Símbolo e erro barras representam a média do desvio-padrão ± triplica. Cinquenta por cento dos pontos médios dos poços de controle do vírus (indicado pela linha tracejada horizontal) foi usado como um disco de corte para determinar a 50%, neutralizando o título de anticorpos de uma amostra de soro. O título de anticorpos neutralizantes é definido como a recíproca da diluição que resultaria em 50% de inibição da atividade do vírus.
Em cada experimento inclui o anti-soro de referência RSV e poços de controle positivo vírus, monitoramento da variação inter-ensaio fornece controle de qualidade entre as experiências. A Figura 7 mostra os resultados do ensaio RSV-A PRN em duas diferentes coortes adultos de coorte da Gâmbia (N = 21)10 e voluntários saudáveis em Melbourne (N = 36). Uma concentração de NAb RSV foram variável dentro de cada população, com os adultos Gambian tendo um título de NAb médio mais baixo em comparação com os adultos de Melbourne. O soro de referência RSV também é mostrado (N = 52 repetições), demonstrando muito baixa variabilidade com um coeficiente de variação (CV) de 6,82%.
Figura 1: layout de placa de titulação Viral para quantificação de estoques RSV. v = estoque de vírus RSV (v1, estoque de viral lote 1 v2, estoque de viral lote 2; v3, estoque de viral lote 3), N = controlo negativo, X = mídia adicionada. Codificação de cores é apenas para auxiliar a visualização do layout da placa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: exemplo de configurações de contagem usado para o leitor pontos. Captura de tela dos parâmetros normalmente utilizados para a contagem de placas de vírus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: exemplos de artefato e monocamadas de células rompidas. () De artefatos. (B) perturbação monocamadas de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: modelo de placa para o ensaio da RSV PRN. V = controle positivo viral poços, N = poços de controlo negativo, X = mídia adicionada, S = anti-soro de referência com todas as diluições (a partir de 1: 100 para 01:12, 800) na coluna 12. Codificação de cores é apenas para auxiliar a visualização do layout da placa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: um exemplo de um resultado de titulação viral RSV. Poços de representante de um ensaio realizado em triplicado são mostrados. A em cada poço referem-se ao número de placas contados usando o leitor de manchas. TMC = demais para contar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: resultados de um ensaio representativo do PRN RSV. (A) o número de PFU contados para três amostras de soro individuais de acordo com intervalos diferentes de diluição. Os números em cada imagem bem referem-se ao número de placas contados. (B) interpretação de título, a partir das imagens bem no painel A para as três amostras de soro humano representativo de NAb. Os dados são calculados o limite de 50% dos poços de controle do vírus. Barras horizontais representam média ± DP. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: RSV neutralizando anticorpos em Melbourne (N = 21) e Gâmbia (N = 36) adultos. O soro de referência RSV humano também é indicado para comparação (N = 52 repetições). Símbolos representam títulos individuais e barras horizontais representam média geométrica título ± 95% CI. A N = 52 resultados baseiam-se em três técnicos durante um período de dois meses. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1: comparação de NAb títulos para RSV-A. (Esquerda) NAb títulos calculados usando os modelos de regressão linear e não linear (N = 152 ensaios). (Direito) Correlação entre RSV-A NAb títulos usando ambos linear e modelos de regressão não-linear. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Temos desenvolvido e aperfeiçoado um ensaio de microneutralização RSV simples e eficiente que pode ser facilmente adaptado na maioria dos laboratórios. Este ensaio é capaz de medir a capacidade de infecção viral, bem como a inibição da infecção viral por NAb a nível celular, usando a varredura de imagem computadorizada de medição. A utilização de uma plataforma baseada em imagem latente e sistemas baseados em anticorpos específicos aumentou a especificidade e a sensibilidade da deteção ponto comparada com placa tradicionais métodos de deteção6,7. Isso permite que a caracterização do VRS cepas com baixa infectividade e também fornece uma quantificação precisa da concentração de RSV antes de utilizar no ensaio de PRN.
É recomendável que o mesmo lote de estoque viral é usado para cada estudo a fim de minimizar quaisquer variações de lotes entre estoques RSV. Outros aspectos importantes do ensaio incluem a consistência da concentração de entrada de vírus, a integridade da monocamada de células a A549 e usando as configurações de contagem mesmo para garantir precisão e consistência de ensaio. A quantidade de vírus adicionado à placa pode ser verificada novamente em uma titulação viral placa separada. No entanto, monitoramento dos poços de controlo positivo do ensaio do PRN também fornece uma indicação da real título viral e também vale a pena monitorar através de ensaios. Além disso, incluindo o soro de referência em cada prato é outra medida de controle de qualidade para assegurar que os ensaios são reprodutíveis. Nossos experimentos não usou recentemente validado RSV internacional padrão anti-soro do NIBSC, como não estava disponível no momento do nosso estudo11. Usar este soro padrão internacional de RSV deve ser recomendada para futuros estudos RSV NAb de medição, para que os resultados através de laboratórios podem ser comparados com confiança.
Desenvolvimento de um ensaio relativamente simples, elevado-throughput facilitaria os esforços de padronização global para a utilização das RSV NAbs como mais laboratórios no mundo seria capazes de usar esse método. Isto é particularmente importante dado o número de candidatos vacinais de RSV em desenvolvimento, com alguns atualmente em ensaios de fase 3. É fundamental que os resultados de futuros estudos clínicos de vacinas RSV ser comparáveis, e, portanto, um ensaio padronizado representa um aspecto fundamental para esse objetivo. Enquanto um número de países de baixa e média renda pode não ser capaz de suporte diretamente a aquisição dos equipamentos necessários, as ligações através de colaborações internacionais e/ou programas de capacitação será fundamental a médio e a longo prazo.
Este protocolo de ensaio NAb é flexível em ser capaz de ser adaptado para as linhas de célula diferente (A549, Hep2 e Vero) e pode ser usado por diferentes cepas de RSV. Nós também adaptaram esse método para RSV-B com êxito. Como a plataforma de ensaio foi desenvolvida para um formato de placa de 96 poços, isto fornece uma alternativa de baixo custo e alta produtividade com exatidão elevada, porque permite mais repetições e a inclusão da referência soro controle e controle negativo sobre todos os placa. Usar o mesmo controle de soro de referência também é recomendado como este é fundamental para garantir o controle de qualidade e garantia de qualidade. Em nossas mãos, observamos muito baixas CVs de 6,82% para o soro de referência que é muito inferior ao relatado CVs para outros ensaios biológicos na faixa dos 30-40%5.
Além disso, os dados de imagem e os dados de contagem (dados brutos) gerados a partir deste protocolo podem ser armazenados indefinidamente para referência futura e/ou análise. Manutenção de registros de dados brutos é um requisito essencial para ensaios clínicos, particularmente aqueles que envolvem futuras vacinas RSV. Nossa planilha (consulte a Planilha complementar) sugerido no presente protocolo pode ajudar a gravar todos os aspectos do experimento com a finalidade de controle de qualidade e controle de garantia. A planilha fornece o cálculo dos 50% neutralizando título usando um modelo linear simples como este tem a vantagem de não exigir qualquer software especializado. No entanto, os dados brutos do nosso ensaio de NAb podem ser analisados usando o modelo de regressão não-linear que também foi usado na pesquisa vacina para calcular 50% neutralizante títulos, embora isso requer outro software pacotes12,13 . Usando nossos dados experimentais, os resultados obtidos usando esses dois métodos foram semelhantes, dando confiança para título valores obtidos utilizando o modelo linear simplificado (ver Figura complementar 1). O custo para a criação deste ensaio é acessível para muitos laboratórios com talvez o item mais caro, sendo o leitor pontos (aproximadamente USD $50K). No entanto, o leitor de manchas tem a vantagem de poder ser usado para outras aplicações como o immunospot enzima-lig (ELISpot) por citocinas e/ou medição desegregação de célula, que o torna um componente valioso na avaliação experimental de vacina.
Em conclusão, este ensaio RSV PRN melhorou, alta produtividade pode ser facilmente implementado em muitos laboratórios e apoiará o esforço de harmonização internacional de quem para ensaios RSV NAb. Isto será fundamental para a avaliação dos candidatos de vacina RSV romance no futuro.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer todos os participantes envolvidos. Reconhecemos o programa de apoio de infra-estrutura operacional do governo vitoriano. LPC é um destinatário NHMRC Fellowship de desenvolvimento de carreira.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22 μm (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
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- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
