Summary
Här presenterar vi en reproducerbar metod för att utveckla en ortotop murina modell av huvud och hals skivepitelcancer. Tumörer visar kliniskt relevanta histopatologiska funktioner av sjukdomen, inklusive nekros, dålig differentiering, nodal metastaser och immun infiltration. Tumör-bärande möss utvecklar kliniskt relevanta symtom inklusive dysfagi, käken förskjutning och viktminskning.
Abstract
Huvud och hals skivepitelcancer (SchH) är en försvagande och dödliga sjukdom med hög prevalens av upprepning och behandlingssvikt. För att utveckla bättre terapeutiska strategier, förståelse tumör microenvironmental faktorer som bidrar till behandling motståndet är viktigt. Ett stort hinder för att förstå sjukdomsmekanismer och förbättra terapi har varit en brist murina cellinjer som liknar den aggressiva och metastaserande karaktären av mänskliga HNSCCs. Dessutom sysselsätter en majoritet av murina modeller subkutan implantationer av tumörer som saknar viktiga fysiologiska funktioner i regionen huvud och hals, inklusive hög vaskulär densitet, omfattande lymfatiska kärl och bosatt slemhinnor flora. Syftet med denna studie är att utveckla och karakterisera en ortotop modell av SchH. Vi använder två genetiskt distinkta murina cellinjer och etablerade tumörer hos möss buckala slemhinna. Vi optimerar kollagenas-baserade tumör matsmältningen metoder för optimal återhämtning av enstaka celler från etablerade tumörer. De data som presenteras här visar att möss utvecklar högt vaskulariserad tumörer som metastaser till regionala lymfkörtlar. Encelliga multiparametric massa flödescytometri analys visar förekomsten av olika immun befolkningsgrupper med myeloida celler som representerar majoriteten av alla immunceller. Den modell som föreslås i denna studie har tillämpningar inom Cancerbiologi, tumör immunologi och preklinisk utveckling av nya behandlingar. Likheten av ortotop modellen till kliniska drag av mänskliga sjukdomar ger ett verktyg för förbättrad översättning och förbättrade behandlingsresultat.
Introduction
SchH är den femte vanligaste malignitet globalt, med över 600 000 patienter diagnostiseras årligen1. Trots aggressiv behandling med kemoterapi och strålbehandling (RT), förblir den totala överlevnaden (OS) för SchH patienter utan humant papillomvirus (HPV) infektion under 50% efter 5 år2. Detta tillskrivs i hög grad en mycket komplex tumör närmiljön som tumörer kan komma från flera olika anatomiska platser inom regionen huvud och hals, inklusive buckala slemhinna, tunga, golvet i munnen, näshålan, munhålan, svalget, orofarynx och hypofarynx. Dessutom regionen huvud och hals är högt vaskulariserad och innehåller nästan hälften av alla lymfkörtlar i kroppen3. En majoritet av studier som undersöker huvud och hals tumörbiologi lita på tumör modeller i regionen flanken. Sådana modeller kan erbjuda inblick i tumör-inneboende mekanismer, men avsaknaden av den infödda huvud och hals närmiljön kan avsevärt påverka translationell potentialen för sådana slutsatser. En metod som har använts för att framkalla muntliga tumörer är genom exponering för cancerframkallande 9,10-dimetyl-1,2-benzanthracene (DMBA)4. Denna metod är dock associerade med en utdragen process, inducerar tumörer hos råttor och hamstrar men inte i möss, och de resulterande tumörerna inte besitter många av de histologiska funktionerna av differentierade SCCs5,6. Införandet av den carcinogen4-nitroquinoline 1-oxiden (4-NQO), ett vattenlösligt kinolon derivat, resulterade i mus muntliga tumörer när tillämpas muntligen men också lidit av långa exponeringstider (16 veckor) och en begränsad ta kurs inom och mellan serier möss7,8,9. För att utveckla kliniskt relevanta modeller, utnyttjade flera grupper genetiskt modifierade modeller som inbegriper manipulation av drivrutinen onkgener eller tumörsuppressorgener, inklusive TP53, TGFB, KRAS, HRAS och SMAD410. Dessa modeller kan erbjuda inblick i tumörer med kända förare gener men sammanfatta inte de komplexa heterogena mänskliga HNSCCs.
I detta arbete demonstrera vi genomförbarheten av utför en intramucosal inympning av skivepitelcancer celler i möss. Inokulerade celler utvecklas till aggressiva tumörer inom 1 vecka efter injektionen. Liknar mänskliga HNSCCs, tumörer metastasera till regionala lymfkörtlar. Vi karakterisera histologiska och kliniska funktioner av sjukdomen och ge insikt i den tumör immun mikromiljö. Vi föreslår att denna ortotop modell av SchH har tillämpningar inom Cancerbiologi, tumör immunologi och prekliniska studier. Mekanismer för immun skatteflykt, tumör progression, behandlingsresistens och metastaser representerar områden av klinisk betydelse som kan lösas med den föreslagna modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden utfördes i enlighet med en godkänd institutionella djurens skötsel och användning kommittén (IACUC) protokoll vid University of Colorado Denver (protokoll nr 00250).
1. tumör cellkultur
Obs: B4B8 och LY2 cellinjer användes för att generera ortotop SchH tumörer: B4B8 tumörceller härleddes från cancerframkallande-omvandlad slemhinnor keratinocyter (från BALB/C-möss)11. LY2 tumörceller härleddes från lymfkörtel metastaser av en spontant omvandlas BALB/C keratinocyter linje (Pam 212)12,13. Både cellinjer var vänligen tillhandahållen av Dr. Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, USA).
- Använd Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) F/12 kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% antimikrobiella reagens för cell linje underhåll. Upprätthålla dessa cellinjer i en steril inkubator vid 37 ° C och 5% CO2. Cellerna bör användas för inympning innan överstiger 15 passager.
- Tavla 2 x 106 4 x 106 celler i 175 cm2 cell kultur kolvar.
Obs: Se till att cellerna är mindre än 90% konfluenta att undvika förmå en stressreaktion. - När cellerna är 70% konfluenta (~ 48 h), ta bort kolven från inkubatorn och tvätta cellerna 3 x med kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Lossa cellerna från kolven med 0,25% trypsin, tillräckligt för att täcka ytan av plattan.
- För att göra detta, fördela 4 mL av trypsin i en 175 cm2 kolv som innehåller 70% konfluenta celler. Inkubera cellerna med trypsin i 3 – 4 min i cell kultur inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2.
- Visualisera cellerna i Mikroskop för att säkerställa cell avlossning.
- Tillsätt 12 mL DMEM F/12 media som innehåller FBS att neutralisera trypsin aktivitet.
- Aspirera cellsuspensionen och placera det i en 50 mL konisk tub.
- Skaka tuben som innehåller celler genom att Invertera det 3 x-4 x.
- Du kan också blanda en 10 µL alikvot av cellsuspensionen med 10 µL Trypan blå i en mikrocentrifug rör och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Bestämma cellviabilitet genom att subtrahera antalet Trypan-blå-positiva celler från det totala antalet celler och dividera med det totala antalet celler.
- Centrifugera cellsuspension på 300 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Att resuspendera cellerna i serum-fri och antibiotikum DMEM på en lämplig volym så att 1 x 106 celler finns i 50 µL av media.
Obs: Baserat på celler in vivo linje aggressivitet (bestäms empiriskt), 1 x 106 celler per injektionsställe per mus ansågs lämpliga för B4B8 och LY2 celler. - Placera injektionsflaskan med cellsuspension på is.
- Plats före tinade basalmembranet matrisen på is.
Obs: Basalmembranet matrisen var tinat över natten vid 4 ° C.
2. cellen injektion i möss
- Förbereda en 1:1 blandning av celler: källaren membran matris (50 µL varje).
- Lägga till cellerna först; sedan gradvis Pipettera matrisen basalmembranet. Undvika att införa luftbubblor. Se till att blandningen görs omedelbart före djurens injektion. Lägga till celler i basalmembranet matris under en längre tid kan resultera i cellen som bosätter sig i matrix blandningen, vilket försvårar blandningen att skaka noggrant. Detta kommer att orsaka en betydande variabilitet i tumörens storlek mellan möss.
- Blanda försiktigt. Säkerställa alla steg som innefattar matrix genomförs på is. Basalmembranet matrix kommer att polymerisera vid rumstemperatur.
- Förbereda sprutor för inympning.
- Fyll på 0,5 mL insulinsprutor (23 G) med 100 µL av cell/källaren membran modellösning.
- Förvara sprutorna på is för att undvika basalmembranet matrix polymerisation.
- Söva möss genom att placera dem i en kammare med isofluran och syre (2,5%).
- Att möss är djupt sövda innan du utför injektionen (genom att säkerställa en brist på svar på en tå nypa).
- Stick in nålen i höger eller vänster buckala regionen. Detta utförs genom öppna utrymmet på vardera sidan av munnen.
- Kontrollera att musens tungan inte är i vägen.
Obs: Det är lätt att sticka tungan, som kommer att resultera i tungan tumörer. Flytta tungan till motsatt sida om det behövs. - Förvara sprutan parallell till regionen buckala medan inne i munhålan.
- När du är redo att injicera, dra sprutan bakåt och långsamt in sprutan i 10° vinkel.
- Injicera 100 µL av cell/källaren membran matrix upphängning under en period av 5 s.
- Håll sprutan på plats för ytterligare 5 s att säkerställa allt material injiceras.
Obs: För kontroll nontumor-bärande möss, injicera en blandning av serum-fria medier och matrix (enligt ovan) utan tumörcellerna. - Ta ut sprutan försiktigt.
- Fortsätta proceduren ovan med de återstående möss.
- För 1 vecka tills tumörer börjar förekomma grovt (50 – 200 mm3 för B4B8 och LY2 celler).
3. mus övervakning
- Utföra första mätningen använda bromsok på 1 vecka efter tumör cell injektionen. För att beräkna volymen tumör använda externa bromsok, fastställa den största longitudinella diametern (längd) och största tvärgående diameter (bredd) och använda de modifierade elliptiska formel14,15.
- Fortsätta att utföra regelbundna bromsok mätningar för tumör volym (1 x-2 x per vecka med jämna mellanrum).
- Mäta djurs vikt att bedöma effekterna av tumörtillväxt på utfodring.
4. skörda tumörer
- När den experimentella slutpunkten är nådd euthanize djuren med hjälp av lämpliga åtgärder (t.ex. CO2 kvävning, halshuggning, eller cervikal Dislokation).
Obs: I denna studie slutpunkten nåddes om mössen blev döende (med en viktminskning på > 15% av sin ursprungliga vikt, brist på grooming, kakexi) eller om tumörstorlek nått 1000 mm3. -
Börja dissekera djuret genom att skapa en lång incision genom mittlinjen i regionen hals.
- Använd trubbig pincett att greppa huden och vass sax för att klippa ut huden.
- Infoga sax försiktigt under huden som täcker tumören och skapa luftfickor genom att trycka saxen över och in i huden.
- När huden är tillräckligt avskild från tumören, identifiera dränerande lymfkörtlarna (DLNs) och punktskatt dem för att slippa blygas av närvaron av lymfkörtlar tumörvävnad.
Obs: Stora tumörer kan nå eller täcka DLN. Beroende på vilken typ av analys som utförs, är isolering av intakt lymfkörtlar viktigt för att undvika spill av immunceller mot tumören, vilket resulterar i skevning test resultaten. - Skär igenom tumören gränser tills hela volymen är fristående.
5. tumör bearbetning för nedströms tillämpningar
- För nedströms histologisk undersökning, placera tumörer i 10% formalin i rumstemperatur. För att undvika overfixation, ersätta formalin med 70% etanol. För flödescytometri flödesanalys, behandla tumörer som beskrivs nedan.
Obs: Vävnaden kan hållas i formalin för 72 h innan overfixation kan bli problematiskt för vissa typer av färgning. - Skärs tumören i 1 – 2 mm-storlek bitar med hjälp av en steril rakblad eller vass sax.
- Placera bitar skär tumör i en 50 mL konisk tub med kollagenas III (4.250 enheter per prov), DNase jag (0,1 mg per prov), och trypsin hämmare (1 mg per prov).
- Inkubera vid 37 ° C under 30 minuter med skakningar varje 10 min.
Obs: Proverna kan placeras i en återförslutningsbar påse, steriliseras med 90% etanol, och placeras i en cell kultur inkubator. - Efter 30 min, tillsätt 20 mL av Hanks balanserad saltlösning (HBSS) och snurra på 300 x g i 5 min.
Obs: HBSS består av kaliumklorid, natriumklorid, natriumvätekarbonat, natriumfosfat dibasisk, monobasiskt natriumfosfat och glukos. - Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 2 – 3 mL lyseringsbuffert röda blodkroppar (RBC). Överför med pipett noggrant.
Obs: RBC lyseringsbuffert består av ammoniumklorid, natriumbikarbonat och dinatrium. - Inkubera i 2 min i rumstemperatur.
Obs: Längre inkubation kan vara giftigt för andra cellpopulationer. - Tillsätt 20 mL HBSS att neutralisera effekten av lyseringsbuffert.
- Centrifugera vid 300 x g i 5 min och kasta bort supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 10 mL HBSS.
- Låt lösningen rinna genom en 70 µm nylon fasthållning och centrifugera vid 300 x g i 5 min. Tag bort supernatanten.
- Upprepa steg 5,8 – 5.10 och passera cellsuspensionen genom en 40 µm nylon fasthållning att säkerställa ytterligare skräp avlägsnas från upphävandet.
6. cell färgning och datainsamling
- Återsuspendera cellpelleten i 1 mL HBSS.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cell räknare, som beskrivs i steg 1,7
-
Fastställa antalet totala celler och lämplig koncentration för färgning.
Obs: idealisk cellkoncentrationen för flöde flödescytometri färgning är 1 – 2 miljoner celler. Till exempel om färgning utförs i en plattan med 96 brunnar och det finns 10 miljoner celler, Återsuspendera provet i 1 mL och platta 100 µL för 1 miljoner celler per brunn. -
Lägg till Fc block (CD16/CD32) vid en koncentration på 1: 100 för att förhindra nonantigen-specifik bindning av immunglobuliner till FcγIII och FcγII-receptorer. Inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Centrifugera och återsuspendera cellpelleten i 100 µL av cellen flöde flödescytometri färgning buffert (består av koksaltlösning innehållande 5% FBS, 2% EDTA och 1% HEPES).
-
Utföra cellytan färgning enligt leverantör-förutsatt instruktioner (lägga till varje antikropp med lämplig utspädning). Inkubera i 60 min i rumstemperatur.
- Centrifugera och återsuspendera cellpelleten i 100 µL av HBSS. Upprepa 2 x för att bli av med överflödigt antikropp.
-
Köra prover på en lämplig flödescytometer.
- Om analysera intracellulära markörer (t.ex. foxp3), utföra cell permeabilisering och färgning enligt leverantörens anvisningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro-bedömningen av proliferation av LY2 och B4B8 visade att både cellinjer har liknande fördubbling gånger (21 och 23 h, respektive). In vivo, både cellinjer bildade en enda, synlig och påtaglig massa inom 1 vecka efter inympningen (figur 1A). I möss med LY2 tumörer, förflyttades käken av 3 veckor på grund av tumör börda (figur 1A). Kontroll möss som inte fått tumörceller utvecklade inte tumörer som förväntad. LY2 tumörer växte i högre takt jämfört med B4B8 tumörer. Den genomsnittliga tumör volymen på dag 21 i LY2 tumör-bärande möss var 632 ± 10 mm3 jämfört med 162 ± 4 mm3 i B4B8 tumörer (figur 1B). Möss uppvisar käken deplacement snabbt utvecklat viktminskning på grund av dysfagi (figur 1 c). Möss uppvisar betydande viktminskning definieras som > 15% av sin ursprungliga vikt eller att ha en tumör volym av > 1 cm3 var euthanized inom 1 dag noterade observation. Medianvärdet för överlevnad i LY2 möss var 22,5 dagar, jämfört med 52,0 dagar i B4B8 tumör-bärande möss (figur 1 d).
Magnetisk resonanstomografi (MRT) av tumör-bärande möss visade väl avgränsade tumörer sträcker sig in i det inre skiktet av buckala slemhinnan (figur 2A). Tumörer inte invadera i tungan eller andra närliggande organ (matstrupen, luftrör, thymus) som visas med histologisk utvärdering. Signalen heterogenitet på MR-bilder var representativt av förekomsten av simblåsa hyperintensiva (betecknas med V) och nekrotisk hypointensiva regioner (betecknas med N) (figur 2A). En grov patologiska undersökningar visade utvidgade DLNs (figur 2B). Vidare bedömde vi tumör volym med datortomografi (CT) att avgöra tillförlitligheten av bromsok mätningar. Tumörer var avgränsad med en digital imaging och kommunikation i medicin (DICOM) bild analys programvara16. Bedömning av LY2 tumör volym av bromsok och CT imaging visade en utmärkt korrelation mellan de två metoderna (R2 = 0.8493; Figur 2 c). Detta indikerar att tumörtillväxt är primärt exophytic och bromsok mätning är en tillförlitlig metod för bedömning av tumörens tillväxt. Histologisk undersökning visade att alla LY2 tumör-bärande möss utvecklats dåligt differentierad skivepitelcancer (figur 2D). Nio av nio LY2 tumör-bärande möss utvecklat metastaser till första och andra echelon lymfkörtlarna. Nodal metastaser var primärt subkapsulär (med sju av de nio möss) och inom bihålor (med fem av nio möss), med två av nio möss visar intrakapsulära invasion. Däremot möss med B4B8 tumörer utvecklas måttligt differentierad skivepitelcancer (figur 2E) och inte metastasera till regionala eller avlägsna platser, inklusive DLNs. nekros utvärderades baserat på en tidigare etablerade tre-grade skala: 0 = ingen synlig nekros, 1 = knapphändig, 2 = måttlig och 3 = svår17. Alla LY2 tumör-bärande möss hade histologiskt bekräftat nekros med majoriteten (sju av tio) visar måttlig till svår nekros (figur 2F). Inga tecken på nekros hos B4B8 tumörer.
Vi fokuserade på LY2 tumör modellen för ytterligare karakterisering av den tumör-immun mikromiljö. Tumörer har skördats på 3 veckor efter tumör inympningen och smält med kollagenas III, följt av färgningen av cellens yta och intracellulära markörer för flöde/massa flödescytometri (figur 3A). Prover bearbetades, med en massa cytometer, vid University of Colorado Denver Flow flödescytometri delad resurs. Gating och data analys utfördes med flöde flödescytometri kommersiell programvara. Uppgifterna visade förekomsten av talrika immunceller populationer i varierande grad. Summa immunceller (CD45+) utgjorde 7,3% av den totala tumören (figur 3B). I absoluta tal, vi observerade, i genomsnitt 26 CD45+ celler (SD = 0,81) per milligram av tumörvävnad (figur 3B). Myeloida celler (CD11b+) representerade 37,8% av alla CD45+ celler (figur 3 c). Myeloida celler var till stor del består av makrofager (F4 / 80 +, 63,0%), följt av myeloisk-derived suppressor-celler (MDSCs) (Gr1 +, 8,51%) och neutrofiler (Ly6G +, 5,87%). Total T-celler består 15,9% av CD45+ -celler med CD4+ T celler bestående av majoriteten av alla T-celler (79,4%), av vilka 53,4% var regulatoriska T-celler (Tregs) (CD4+FoxP3+) (figur 3D). Naturliga mördarceller (NK) består 1,75% av alla CD45+ celler. Dessa data Markera närvaron av olika immun infiltrerar i LY2 ortotop SchH tumörer som sannolikt spela en roll i medla tumör progression och immun skatteflykt.
Figur 1: övervakning möss med ortotop SchH tumörer. (A) representativa bilder av tumör-bärande möss. De inokulerade buckala utvecklar en tumör inom 1 vecka efter inympningen. På 3 veckor observeras förskjutning av käken. (B) tumör tillväxt i B4B8 och LY2 tumör-bärande möss som bestäms av bromsok mätningar. (C) förändringar i kroppsvikten av möss med B4B8 eller LY2 tumörer. (D) överlevnad av B4B8 och LY2 tumör-bärande möss. Staplarna representerar standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) av 7-10 möss per grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Imaging och histologisk funktioner av murina SchH tumörer. (A) representativ koronalt herr bild av en LY2 tumör-bärande mus. Anatomiska platser är märkta. Områden av signal hyperintensity representerar simblåsa områden (betecknas V). Regioner av signal hypointensity representerar nekrotiska områden (betecknar N). (B) representativa grov bild av en dissekerade tumör-innehållande region. Vita pilarna pekar på förstorad dränerande lymfkörtlar (DLNs). (C) sambandet mellan tumör volym enligt bedömning av bromsok mätning jämfört med datortomografi (CT)-bedömning. Lutning, korrelationskoefficienten (R2) och raden av bästa passform visas. (D) representativ hematoxylin och eosin (H & E) bild av LY2 tumör. (E) representant H & E bilden av B4B8 tumör. (F) kvantifiering av nekros i LY2 tumörer, baserat på en H & E fyra-grade poängsystem. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: analys av baslinjen intratumoral immun populationer med flödescytometri genom time-of-flight (CyTOF). Tumörer var bearbetas till en enskild cell suspension med kollagenas-baserade enzymatisk nedbrytning och, sedan, fläckad med cell surface och intracellulära markörer. (A) massa flödescytometri utfördes med hjälp av CyTOF plattformen. (B) absoluta och relativa kvantitativ bedömning av totala immunceller (CD45+). (C) kvantifiering av myeloisk-immun subpopulations. (D) kvantifiering av lymfoida immun subpopulations. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Noggrann analys och karakterisering av de tumör närmiljön utgör en viktig strategi för förståelse mekanismer för tumörutveckling, progression och metastaser och för utvecklingen av effektiva behandlingar. Huvud och hals cancer är en komplex sjukdom som kan härröra från flera anatomiska platser inom regionen huvud och hals. Ett stort hinder för att förstå sjukdomsmekanismer och förbättra terapi har varit en brist murina mus cellinjer som liknar den aggressiva och metastaserande karaktären av mänskliga HNSCCs. Dessutom sysselsätter många murina modellerna en subkutan implantation av tumörer som saknar viktiga fysiologiska funktioner i regionen huvud och hals, inklusive hög vaskulär täthet, en omfattande lymfatiska kärl och bosatt slemhinnor flora.
I denna studie präglas vi en ortotop modell av murina SchH. Vi valde den buckala slemhinnan som platsen för tumören inympning för ett antal skäl, inklusive enkel tillgång till regionen utan behov av bilden vägledning, förmågan att bedöma tumörtillväxt använda bromsok, närvaron av tumören inom slemhinnor flora, den förekomsten av omgivande lymfkärlen och användarvänlighet reproducerbarhet. Även om en injektion av celler i slemhinnan i buckala är okomplicerad, placeringen av nålen och inträngningsdjupet är kritiska att förhindra punktering genom huden och säkerställa celler inte injiceras subkutant. Vi rekommenderar du för in nålen inom oralt medan det är helt parallella till regionen buckala och luta i en vinkel som är större än 10 ° när du är redo att injicera.
De cellinjer som vi använde var murina cellinjer som möjliggör deras implantationen i immunkompetenta mössen av den stam som de härrör från. Det finns över 39 SchH mänskliga cellinjer som har studerats i litteraturen men kan inte användas i närvaro av en infödd mikromiljö18. Senaste utvecklingen tillåts för utformningen av humaniserad musmodeller som integrerar mänskliga ben-märg-härledda chimärer i nicka scid gamma möss (kallas även NSG möss), möjliggör utveckling av ett mänskligt immunförsvar som kan interagera med mänskliga tumörer i en nedsatt immunförsvar mus modell19. Dock sådana modeller är kostsamma, kräver mödosamma förädlingsmetoder, och sammanfatta inte alla komponenter i den tumör mikromiljö, inklusive endotelceller fibroblaster och lymfkärlen. Murina mus modellerna vi använt i denna studie recapitulate kritiska komponenter i mänskliga HNSCCs, inklusive förekomsten av olika immun infiltrat. För att säkerställa maximal hämtning av livskraftiga enstaka celler från tumörer, är användningen av matsmältning enzymer nödvändigt. Kollagenas-baserade matsmältning enzymer kan vara hårda på celler och optimering av koncentrationen och typ av kollagenas kan behövas för olika tumörtyper. Vi jämförde fem matsmältning enzymer innan bedömningen att kollagenas III, som användes i denna studie, är den optimala metoden för rötning av skivepitelcancer celltumörer.
De tumör-modeller som används i denna studie är särskilt användbara för studerar mekanismer av SchH immun skattefusk och preklinisk utvärdering av olika terapier. Vi har tidigare visat att både B4B8 och LY2 tumörer är radioresistant och eldfasta till immun checkpoint hämmare anti-PD-L120. Detta är förenligt med majoriteten av mänskliga HNSCCs. Senaste kliniska studier visade att mindre än 15% av SchH patienter svarar på behandling med anti-PD-1/PD-L121,22,23,24,25. Dessutom är det väl etablerat att HNSCCs är radioresistant26,27. Inriktning på vägar ansvarar för radioresistance i SchH är ett viktigt steg för att förbättra behandlingssvar. Landmärket Bonner et al. studie visade en signifikant nytta i total överlevnad med tillägg av cetuximab till RT jämfört med RT ensam i lokalt avancerad SchH patienter28. Senaste data visar att hämning av EphB4-Efrinreceptorkinaser-B2 signalering i ortotop HNSCCs ytterligare kan förbättra svaret på RT eller cetuximab-RT genom att främja tumör apoptos och hämmar tumör spridning29,30. Dessutom kan kombinerar RT med rationell immun terapi öka antitumöreffekt immunsvar och förbättra både lokala tumör kontroll och kontroll av fjärrmetastaser31. Vi har nyligen visat att inriktning Tregs i kombination med immun checkpoint blockad och RT resulterar i tumör utrotning och immunologiskt minne32. Framtida studier anställa ortotop modeller av SchH kommer att bättre informera utformningen av kliniska prövningar och förbättra förståelsen av mekanismer av tumör immun skatteflykt och behandling motstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase III | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | |
| DNase I | Worthington Biochemical Corp. | LS006328 | |
| Fc Block (CD16/32) | BD Biosciences | 553141 | Clone 2.4G2 |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no pheno red |
| Helois mass cytometer | Fluidigm | NA | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB-40234B | |
| MRI Scanner | Bruker | NA | 7.4 Tesla |
| RBC lysis buffer | BioLegend | 420301 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington Biochemical Corp. | LS002830 |
References
- Chaturvedi, A. K., et al. Worldwide trends in incidence rates for oral cavity and oropharyngeal cancers. Journal of Clinical Oncology. 31 (36), 4550-4559 (2013).
- Ang, K. K., Sturgis, E. M. Human papillomavirus as a marker of the natural history and response to therapy of head and neck squamous cell carcinoma. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 128-142 (2012).
- Amin, M. B., et al. The Eighth Edition AJCC Cancer Staging Manual: Continuing to build a bridge from a population-based to a more "personalized" approach to cancer staging. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (2), 93-99 (2017).
- Salley, J. J. Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian hamster. Journal of Dental Research. 33 (2), 253-262 (1954).
- Morris, A. L. Factors influencing experimental carcinogensis in the hamster cheek pouch. Journal of Dental Research. 40, 3-15 (1961).
- MacDonald, D. G. Comparison of epithelial dysplasia in hamster cheek pouch carcinogenesis and human oral mucosa. Journal of Oral Pathology & Medicine. 10 (3), 186-191 (1981).
- Hawkins, B. L., et al. 4NQO carcinogenesis: a mouse model of oral cavity squamous cell carcinoma. Head & Neck. 16 (5), 424-432 (1994).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vered, M., Yarom, N., Dayan, D. 4NQO oral carcinogenesis: animal models, molecular markers and future expectations. Oral Oncology. 41 (4), 337-339 (2005).
- Bornstein, S., et al. Smad4 loss in mice causes spontaneous head and neck cancer with increased genomic instability and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 119 (11), 3408-3419 (2009).
- Thomas, G. R., Chen, Z., Oechsli, M. N., Hendler, F. J., Van Waes, C. Decreased expression of CD80 is a marker for increased tumorigenicity in a new murine model of oral squamous-cell carcinoma. International Journal of Cancer. 82 (3), 377-384 (1999).
- Yuspa, S. H., Hawley-Nelson, P., Koehler, B., Stanley, J. R. A survey of transformation markers in differentiating epidermal cell lines in culture. Cancer Research. 40 (12), 4694-4703 (1980).
- Chen, Z., Smith, C. W., Kiel, D., Van Waes, C. Metastatic variants derived following in vivo tumor progression of an in vitro transformed squamous cell carcinoma line acquire a differential growth advantage requiring tumor-host interaction. Clinical & Experimental Metastasis. 15 (5), 527-537 (1997).
- Euhus, D. M., Hudd, C., LaRegina, M. C., Johnson, F. E.
- Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. NeuroImage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Dutta, S., et al. The relationship between tumour necrosis, tumour proliferation, local and systemic inflammation, microvessel density and survival in patients undergoing potentially curative resection of oesophageal adenocarcinoma. Britisch Journal of Cancer. 106 (4), 702-710 (2012).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research. 12 (4), 571-582 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Oweida, A., et al. Ionizing radiation sensitizes tumors to PD-L1 immune checkpoint blockade in orthotopic murine head and neck squamous cell carcinoma. OncoImmunology. 6 (10), e1356153 (2017).
- Ferris, R., et al. Further evaluations of nivolumab (nivo) versus investigator’s choice (IC) chemotherapy for recurrent or metastatic (R/M) squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN): CheckMate 141. Journal of Clinical Oncology. 34, (2016).
- Ferris, R. L., et al. Nivolumab for Recurrent Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1856-1867 (2016).
- Harrington, K. J., et al. Nivolumab versus standard, single-agent therapy of investigator's choice in recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (CheckMate 141): health-related quality-of-life results from a randomised, phase 3 trial. The Lancet Oncology. 18 (8), 1104-1115 (2017).
- Kiyota, N., et al. A randomized, open-label, Phase III clinical trial of nivolumab vs. therapy of investigator's choice in recurrent squamous cell carcinoma of the head and neck: A subanalysis of Asian patients versus the global population in checkmate 141. Oral Oncology. 73, 138-146 (2017).
- Ling, D. C., Bakkenist, C. J., Ferris, R. L., Clump, D. A. Role of Immunotherapy in Head and Neck Cancer. Seminars in Radiation Oncology. 28 (1), 12-16 (2018).
- Perri, F., et al. Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications. Head & Neck. 37 (5), 763-770 (2015).
- Yamamoto, V. N., Thylur, D. S., Bauschard, M., Schmale, I., Sinha, U. K. Overcoming radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 63, 44-51 (2016).
- Bonner, J. A., et al. Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival. The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).
- Bhatia, S., et al. Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).
- Bhatia, S., et al. Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 6, 38792 (2016).
- Tang, C., et al. Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors? Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).
- Oweida, A., et al. Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration. Clinical Cancer Research. , (2018).
