Summary
我们提出了一种有用的方法,用于使用细菌细胞色素,对阿氏酸(AA)、多沙六烯酸(DHA)和乙二苯甲酸(EPA)的特异性环氧乙烷和环氧乙烷酶的环氧乙烷和环氧乙烷的再三氧化二氮进行纯化。P450 酶 (BM3)。
Abstract
各种多不饱和脂肪酸(PUFAs)的环氧树脂代谢物,称为环氧脂肪酸,在人体生理学中有着广泛的作用。这些代谢物是由细胞色素P450类酶内分泌产生的。由于其多样化和强大的生物效应,人们对研究这些代谢物产生了浓厚的兴趣。确定这些代谢物在体内的独特作用是一项艰巨的任务,因为环氧脂肪酸必须首先获得大量且纯度高。从天然来源获得化合物通常是劳动密集型的,可溶性环氧乙烷(sEH)会迅速水解代谢物。另一方面,通过化学反应获得这些代谢物的效率非常低,因为很难获得纯反热敏体和抗性剂,产量低,并且广泛(和昂贵的)纯化。在这里,我们提出一个有效的酶合成19(S),20 (R) - 和16 (S),17 (R)-环氧乙烷酸 (EDPs) 从DHA通过环氧化与BM3, 一种细菌CYP450酶从杆菌分离梅盖特(在大肠杆菌中很容易表达)。使用核磁共振光谱 (NMR)、高性能液相色谱 (HPLC) 和质谱 (MS) 进行纯度的特性和测定。本程序说明了PUFA环氧代谢物酶合成的好处,并适用于其他脂肪酸的环氧化,包括甲氧乙酸(AA)和乙酸苯甲酸(EPA),以生产类似的环氧乙烷酸酸(EETs)和四烯酸(EEQs)。
Introduction
近年来,随着人们对多不饱和脂肪酸(特别是欧米茄-3和欧米茄-6多不饱和脂肪酸)在人类生物学中的作用的兴趣与日俱增,研究人员已经注意到其代谢物具有广泛的吸引力。展览。特别是环氧脂肪酸代谢物产生的细胞色素P450类酶一直是人们关注的焦点。例如,许多PUFA环氧乙烷,包括环氧乙烷酸(EETs)、环氧二甲酸(EDPs)和环氧乙烷四甲酸(EEQs),在调节血压和炎症方面起着关键作用1,2,3,4,5.有趣的是,已知AA和EPA环氧树脂的特定异构体对血管收缩6、7具有不同影响。虽然EET和EEQ的内窥剂和再血管异构体的生理影响已经记录在案,但人们对DHA形成的类似环氧二苯丙酸(EDPs)的影响知之甚少。鱼油8的广泛使用,富含EPA和DHA,也激起了对EDPs9的兴趣。这些补充剂的好处被认为是部分由于下游DHA代谢物(16,17-EDP和19,20-EDP是最丰富的),因为在体内的EDP水平与膳食10中的DHA量协调得很好, 11.
通过代谢组学、化学生物学和其他方法研究这些环氧脂肪酸的机制和目标已被证明具有挑战性,部分原因在于它们作为再血管和立体异构体的混合物存在,以及一种获得纯量的需要反古体和再血管等位。事实证明,用化学合成这些化合物的传统方法是无效的。使用环氧树脂等环氧树脂有许多缺点,特别是缺乏环氧化选择性,这需要昂贵和费力地纯化单个再血管体和抗氧化剂。DHA和EPA代谢物的完全合成是可能的,但也存在缺点,使得大规模合成不切实际,如高成本和低产量12,13。有效的整体生产可以通过酶合成来实现,因为酶反应是regio-和立体选择性14。研究表明,AA和EPA的酶环氧化(与BM3)同时具有反选择性和内选选择性15,16,17,18,但这个程序没有测试与DHA,或在大型规模。我们该方法的总体目标是扩大和优化这种化学环氧化,以迅速产生大量的纯环氧脂肪酸作为各自的抗氧化剂。使用这里介绍的方法,研究人员可以获得一种简单且经济高效的策略来合成EDPs和其他PUFA环氧代谢物。
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Protocol
注意:在使用所列化学品之前,请查阅所有相关的材料安全数据表 (MSDS)。
1. 野生型BM3的表达
- 接种pBS-BM3转染DH5+大肠杆菌(由F.Ann Walker博士慷慨捐赠)在5 mL无菌LB汤中加入0.5毫克氨基青霉素加入20 mL培养管。
- 在37°C下在摇床中孵育细胞培养,在200rpm下孵育24小时。在Fernbach或Erlenmeyer烧瓶中加入隔夜开胃剂培养基(5 mL)和100毫克的阿霉素,加入1L无菌LB汤。在 37°C 下在 200 rpm 下摇动 6 小时,然后在 30°C 下在 200 rpm 下摇动 18 小时。
- 在4°C下收集并离心机细胞培养基10分钟,在1,000 x g下。丢弃上清液,将细胞颗粒储存在-78°C,直到酶纯化。
注:上清液可以通过漂白剂进行化学灭菌,也可以使用高压灭菌器消毒,然后倒入下水道。
2. BM3的净化。
-
细胞莱沙
- 在冰上解冻细胞颗粒,重新悬浮在40 mL的冷冰 (4 °C) 溶解缓冲液(10 mM Tris, 0.01 mM 苯基甲基硫磷基氟化物 (PMSF;), 0.01 mM EDTA; pH 7.8).
注意:PMSF 因接触而有毒。 - 在冰上时,用超声波均质器对细胞进行1分钟的声波处理(输出功率设置10,占100%),然后冰上休息1分钟,以对细胞进行分解。重复此过程 6 次。在 4°C 下将细胞分管 30 分钟,在 11,000 x g下与颗粒细胞碎片分离。
- 在冰上解冻细胞颗粒,重新悬浮在40 mL的冷冰 (4 °C) 溶解缓冲液(10 mM Tris, 0.01 mM 苯基甲基硫磷基氟化物 (PMSF;), 0.01 mM EDTA; pH 7.8).
-
亲缘色谱
- 通过在 4°C 下用缓冲器 A 的 5 列体积 (CV) 洗涤,制备强的海网交换色谱柱(参见材料表;直径:2.8 厘米 x 6 厘米,柱体积:37 mL)。
- 将细胞分片添加到平衡柱中,用3 CV冷缓冲液A洗涤柱,用冷缓冲液B(10 mM Tris,600 mM NaCl,6 CV)清洗柱。
- 收集红褐色洗脱分数。如果不立即使用蛋白质,将其与同等体积的甘油混合,并与液氮一起闪冻。将冷冻溶液储存在-78°C。
3. BM3对DHA的抗氧化
- 在18.8 mL二甲基硫酸盐(DMSO)中加入0.308克(0.940毫摩尔)至2L的搅拌反应缓冲液(0.12M磷酸钾,5 mM MgCl 2,pH 7.4)以及20 nM的解冻BM3酶,制备反应。酶浓度可以通过一氧化碳/二聚苯醚光谱测定方法19确定。
- 当溶液搅拌时,在反应缓冲液中加入1个等效的NADPH(烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸盐减少,四钠盐,0.808克,0.940 mmol)开始反应。将反应搅拌30分钟,同时通过反应混合物冒泡空气,用充气气球连接到注射器和针头。
- 使用分光光度计(见材料表),检查反应混合物在340nm处的吸光度,以确定NADPH是否耗尽。如果没有剩余吸收电指示 NADPH 的消耗,则反应已完成。
注:通常,反应在30分钟后完成。 - 通过缓慢加入1M草酸,滴落,直到溶液的pH率达到4,使反应混合物淬火。
4. 提取 EDP
- 用2L二乙醚(无氢、过氧化物)提取淬火缓冲液溶液3次。收集醚层(6L),用无水硫酸镁(MgSO4)干燥。
- 从溶液中过滤MgSO4,将干燥的醚层浓缩在旋转蒸发器上,产生粗EDP残留物。
- 通过闪光柱色谱法净化残留物(40 克硅盒就足够了)。在己带中从 10% 乙酸乙酯 (EtOAc) 开始,在 22 分钟内在己带中增加高达 60% 的 EtOAc。
注: 获取和收集三个主要峰,按 1 的顺序进行。未反应的DHA;2. EDP等体混合物;和3。二氧化二氮(正常过氧化产物(见图1)。 - 将分数合并,并集中到旋转蒸发器上。从本例中,0.074 克 (24%)未反应的DHA,0.151 g (47%)EDP 等构体和 0.076 g,(22%)二环二氧化硫。
5. EDP的酯化,16(S),17(R)-和19(S),20(R)-EDP,和酯的皂化
注意:三甲基硅二氮甲烷(TMS-二甲烷)在接触和吸入中毒性极强。只能在带适当个人防护设备的烟气罩中使用。
- 在圆底烧瓶或小瓶中稀释环氧化物(0.151克,0.435毫摩尔),在阿根下面加2mL无水甲醇(MeOH)和3 mL无水甲苯,加入搅拌棒,并加入TMS-二甲烷(1.2摩尔当量,或0.26 mL的2M溶液)。
- 等待 10 分钟,并添加额外的 TMS-二甲烷 (0.050 mL),直到保持淡黄色。
- 30分钟后,使用旋转蒸发器小心地浓缩混合物,并通过闪光柱色谱法净化残留物。在己带中加入 4% EtOAc(使用 40 g 硅胶柱或墨盒)22 分钟。在此示例中,19,20-EDP 甲基酯(0.116 g, 74%)16,17-EDP甲基酯(0.029克,19%)作为透明油获得(总产量,93%)。
- 收集含有纯化EDP甲基酯再焦散剂的馏分。19 (S)(R) -EDP 甲基酯首先洗脱,然后是 16 (S), 17 (R)-EDP 甲基酯.
- 如果任何混合馏分仍然存在(包含两种异构体;可以通过薄层色谱法(TLC)在8:1己烷/EtOAc中评估,并沾染高锰酸钾(KMnO 4),则用与以前相同的溶剂系统重新进行色谱。
- 集中包含单个血管等位器的分数。
注:此时,身份和纯度可能由 NMR 评估(使用 CDCl3作为溶剂;参见图2的图例)。 - 要将单个 EDP 甲基酯再焦油酯转化为其酸形式,在 THF:水(约 0.7 mL/0.1 mmol 的酯)中稀释 EDP 酯。加入2M水李OH(3摩尔当量),搅拌过夜。
注:反应的完成性可以通过TLC评估,使用3:1己安/EtOAc,与KMnO4染色;产品的保留系数为 ±0.3。 - 用甲酸缓慢地淬火反应,直到混合物的pH达到3-4。加入水和乙酸乙酯(1-2 mL/0.100 mmol酯),并分离层。用EtOAc(3 x 5 mL)萃取水层,用饱和盐水(NaCl)溶液清洗,并在无水硫酸钠(Na2SO4)上干燥EtOAc层。
- 使用旋转蒸发器浓缩乙酸乙酯溶液,加入己酸素(10 mL),然后再次浓缩。重复两次,以亚子化去除残留的甲酸。通过闪光柱色谱法净化残留物,在 15 分钟内用 10-30% EtOAc 进行稀释。
- 浓缩所需的馏分,在真空中干燥,以承受纯化的酸。
注: 在此阶段,可以评估异质纯度(通过手性 HPLC,参见图 3的图例 -图 4列和条件)。化学纯度可以通过C18(化学)HPLC评估(见材料表和参考文献14)。
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Representative Results
从酶性酶氧化中纯化原油混合物时获得的闪光柱色谱图(使用下述自动闪光纯化系统执行)如图1所示。继对再血管等量体进行酯化和分离后,获得纯16(S)、17(R)-EDP和19(S)、20(R)-EDP甲基酯。通常,它们以大约 1:4 到 1:5 的比例存在,主要产品为 19(S),20 (R) -EDP。未获得其他EDP反血管体(例如,13,14-或10,11-EDP)。1 H-NMR 光谱 16 (S), 17 (R) -EDP (图 2A) 和 19 (S) 20 (R) -EDP (图 2B) 甲基酯及其结构如下,表明这些化合物;C18(丙烯酸)HPLC的酸形式也指示纯度>98%。高分辨率质谱(酸和酯形式)进一步证实了它们的身份,产生了与已识别的EDP一致的质量/电荷比和碎片模式。使用手性HPLC测定了抗性纯度,与真正的内酸纯和EDPs的混合标准(以酸性形式,图3A和图4A)进行比较。如图3B和图4B所示,通过酶性环氧化获得的两种EDP在皂化后均具有高抗氧化性(>99%为一个内酸剂)。这些无主的身份先前报称为16(S),17(R)-和19(S),20(R)-EDP18。
图 1.从DHA酶性酶氧化(以及相关结构)中获得的粗混合物纯化的色谱图。中间峰值(单氧化物)包含所需的 EDP。使用自动闪光净化系统进行纯化(见材料表)。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.例1H-NMR光谱纯16(S),17(R)-EDP甲基酯(2A)和19(S),20(R)-EDP甲基酯(2B)。在 CDCl3中,光谱记录在 500 MHz 下(溶剂在 7.26 ppm 时可见,残留水为 1.6 ppm)。化学变化如下: 16 (S), 17 (R) -EDP 甲基酯: 1H-NMR (500 MHz;CDCl3: = 5.57-5.35 (米, 10 H)、3.68(s,3 H)、2.99-2.95(米,2高)、2.87-2.83(米、6高)、2.47-2.37(米、6高)、2.29-2.21(米、2小时)、2.11-2.05(米、2高)、0.99(t、J = 7.5赫兹、3高); 19(S)20 (R) -EDP 甲基酯: 1H-NMR (500 MHz;CDCl3: ± 5.54-5.35 (米, 10 高), 3.68 (s, 3 H), 2.97 (td, J = 6.4, 4.2 赫兹,1 H),2.91 (td, J = 6.3, 4.2 Hz, 1 H), 2.85-2.82 (米, 8 H), 2.44-2.36 (米, 5 H), 2.27-2.21 (米, 1 H), 1.65-1.51 (米, 3 H), 1.06 (t, J = 7.5 赫兹,3 H)。请点击此处查看此图的较大版本。
图3.奇拉尔HPLC表示BM3生产的16,17-EDP(酸性形式)的抗性纯度。图3A显示了"种族"16,17-EDP(两种内氮剂14真实标准的人工混合物),而图3B显示了手性HPLC色谱的内酸纯16(S),17(R))-EDP由DHA与BM3的环氧化产生,评估为>99%S,R等体。 该柱以纤维素为基础(见材料表,250 x 4.6 mm,5 μm,1,000 μ),在甲醇(30分钟)中,用异体45% 50 mM碳酸氢铵(NH4HCO3)进行脱氧,样品浓度为0.5 mM,流速为1 mL/min。 单击此处查看此图的较大版本。
图 4.奇拉尔HPLC表示BM3生产的19,20-EDP(酸性形式)的抗性纯度。图 4A 显示了"种族"19,20-EDP(两种内氮剂14的真实标准的人工混合物),而图 4B显示了手性 HPLC 色谱表的内酸纯 19 (S),20 (R)-EDP 生产通过用BM3对DHA的环氧化,评估为>99% S,R等同体(方法如图3所述)。 请点击此处查看此图的较大版本。
图 5.该方法产生的AA、EPA、EETs和EEQ的整体酶环氧化反应方案和相关结构请点击这里查看此图的较大版本。
图 6.奇拉尔HPLC表示BM3生产的17,18-EEQ(酸性形式)的抗性纯度。图6A显示了"种族"17,18-EEQ(两种内氮剂14真实标准的人工混合物),而图6B显示了手性HPLC色谱的内酸纯17(S),18(R))-EEQ由EPA与BM3的环氧化产生,评估为>99% S,R等同体(方法如图3所述)。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
我们在这里提出了一种操作简单且经济高效的方法,用于制备DHA的两种最丰富的环氧代谢物 - 19,20 和 16,17-EDP。这些环氧脂肪酸可以使用野生型BM3酶以高抗纯(作为S,R-等体)形式制备。下面将介绍可用于故障排除的几个关键点,以及我们制备 AA 和 EPA 的环氧树脂代谢物的方法的扩展。
BM3 存储指南
在-78°C冷冻室储存之前,将蛋白质溶液与同等体积的甘油混合,并与液氮进行闪冻,从而储存纯化的BM3酶。一旦酶被冷冻,它可以储存长达一年。这种酶只能解冻一次,必须在冰上解冻,并且只能在冰上再冷冻4小时,让酶解冻而不打冰浴就会使酶失去活性。
化学品储存指南
手术所需的许多化合物对空气敏感。其中包括DHA和其他PUFA、EDP和其他环氧代谢物和NADPH。为了防止这些化合物的过氧化(和其他氧化过程),一定要冲洗储存在容器中的砷或氮,并储存在-78°C。
另一个重要注意事项是存储 DHA 的解决方案。虽然DHA在DMSO中不是很稳定,但BM3与乙醇和甲醇不相容,因此必须使用DMSO。为了抵消其低稳定性,DHA混合物必须在环氧化的同一天新鲜制备。反应混合物中的总DMSO百分比必须保持在1%以下,以避免酶停用。此外,由于NADPH的保质期短,在添加反应之前,应使用分光光度计检查浓度。这可确保始终在反应混合物中加入 1 个等效的 NADPH。
环氧化反应指南
必须保持从气球到反应混合物的气流,以保持反应氧合,因为氧气是气氧化所必需的。由于PUFA在水中不溶性(DHA在反应缓冲液中的溶解度为±125μM),因此混合物也必须快速搅拌。反应用草酸淬火,使蛋白质变性(因为它能降解金属并去除辅助因子),酸保持DHA的中性形式,这是二乙醚提取所必需的。反应混合物的淬火必须缓慢进行,以避免EDP的酸催化水解。
EDP提取和纯化指南
由于多种原因,Ether 被专门选作萃取溶剂。二氯甲烷会使蛋白质从溶液中沉淀出来,使提取复杂化。EtOAc萃取甘油(加入酶库存溶液),难以去除并干扰闪热色谱。
处于自由酸状态的EDP再焦质体不易分离,这就是为什么在第一个闪光柱色谱中,再血管异构体混合成单个峰值的原因。一旦它们转化为甲基酯,再血管性亚体体很容易分离。此外,如果不需要立即使用酸形式,则酯通常比相应的酸更稳定,用于长期储存。
方法相对于现有/替代方法的意义
该方法为获得纯化EDP提供了一种简单而有效的方法,与现有和替代方法具有许多优点。首先,DHA和其他PUFA及其衍生物的化学环氧化既不是再生选择性的,也不是反选择性的,而且经常得到复杂的混合物。因此,需要从这些混合物中纯化环氧脂肪酸,这些混合物是劳动密集型的,只能产生非常少量的所需液化,因此需要多个闪光色谱柱和预生HPLC,包括手性预生HPLC。代谢 产物。总合成也可用于生产环氧脂肪酸,但它非常严格,耗时,需要多个步骤,总产量低,而BM3酶易于表达和纯化,并且环氧化是在短时间内完成的。时间。我们的方法也是具有成本效益的:商业来源20目前提供16,17-和19,20-EDP(作为他们的赛马)528美元/0.5毫克1毫克的NADPH也可以购买€500-800美元,并可用于生产超过200倍的金额19,20-EDP(大约是16,17-EDP的50倍)以类似价格提供商业价格,而且以纯正形式提供,目前无法上市。
方法的限制
由于这种酶优先释放DHA的最后一个双键,主要产品是19,20-EDP(虽然16,17-EDP也生产)。因此,其他可能需要的DHA干扰剂(例如,13,14-EDP,10,11-EDP)不能通过野生型BM3的酶环氧化产生。此外,由于只有SR-enantiomers由BM3生产,RS-enantiomers是无法访问的,尽管我们先前发布的化学反转方法14可用于合成它们。 此外,由于反应缓冲液中亲脂性PUFA的溶解度较低,大规模生产(约500-1,000毫克)的EDPs需要大量缓冲液,这可能使提取费时或令人望而却步。
该方法的其他应用
令人高兴的是,这种酶环氧化方案也适用于EPA和AA(相关结构如图5所示)。所有三种脂肪酸的环氧化所需的浓度、缓冲液和反应时间相同。对于 EPA,也使用野生型 BM3 酶,从 EPA 获得的 EEQ 馏分(单氧化物产量为 56%),酯化后的含量为 ±14:1 1 17,18-EEQ:14,15-EEQ。与对EDP的观察相似,获得的17,18-EEQ是高度纯化(>99% 17 (S), 18 (R) -EEQ, 参见图 6), 由手性 HPLC 评估 (参见图 3图例和材料表)。此前,曾有17人此前报道过身份。然而,对于AA,必须使用F87VBM3突变体,因为野生型BM3是AA21的羟基酶。这种突变物的表达和纯化也使用上述协议,并且以类似的方式执行环氧化。通过这种方法,获得14,15-EET作为唯一的再血管。由于14,15-EET游离酸与环氧化后未反应的AA分不开,因此必须酯化;14,15-EET甲基酯从AA获得52%的收率。酸的奇拉尔HPLC(参见图3图例和材料表)表示高抗性纯(>99%)14(S),15( R)-EET(如先前报道的)15。这些 EPA 和 AA 代谢物的化学变化如下: 17 (S),18 (R)-EEQ 甲基酯:1H-NMR (500 MHz;CDCl3: ± 5.53-5.34 (米, 8 高), 3.67 (s, 3 H), 2.96 (td, J = 6.4、4.2 Hz、1 H)、2.90(td、J = 6.3、4.2 Hz、1 H)、2.85-2.79(米、6高)、2.44-2.38(米、1 H)、2.32(t、J = 7.5 Hz、2 H)、2.26-2.20(米、1小时) ,2.11 (q, J = 6.7 Hz, 2 H), 1.71 (五角,J = 7.4 赫兹, 2 H), 1.66-1.50 (米, 2 H), 1.05 (t, J = 7.5 Hz, 3 H); 14(S)15 (R) -EET 甲基酯:1H-NMR(500兆赫;CDCl3: ± 5.53-5.33 (米, 6 高), 3.67 (s, 3 H)、2.95-2.92(米、2 H)、2.81(dt、J = 17.8、5.8 Hz、4 H)、2.40(dt、J = 14.1、6.8 Hz、1 H)、2.32(t、J = 7.5 Hz、2 H)、2.23(dt、J = 14.1、6.8 Hz、1 H) ,2.11 (q, J = 6.8 Hz, 2 H), 1.71 (五角,J = 7.4 赫兹, 2 H), 1.56-1.41 (米, 4 H), 1.38-1.30 (米, 4 H), 0.90 (t, J = 7.1 Hz, 3 H).
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Disclosures
提交人没有利益冲突可披露。
Acknowledgments
这项工作由R00 ES024806(国家卫生研究院)、DMS-1761320(国家科学基金会)和密歇根州立大学的启动基金资助。作者希望感谢杨俊博士(加州大学戴维斯分校)和拉利莎·卡查拉博士(密歇根州立大学)协助优化酶反应,以及托尼·席尔米勒博士(MSU质谱和代谢组学设施)协助HRMS数据采集。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
- Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
- Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
- Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211 (2016).
- Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
- Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
- Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).
- Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
- Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
- Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
- Khan, M. A., Wood, P. L. Method for the synthesis of DHA. , WO2012126088A1 (2012).
- Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
- Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
- Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
- Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
- Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
- Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
- Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
- Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019).
- Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).
