Summary
Biz bir yöntem büyük ölçekli enzimatik sentez ve spesifik enantiomerler ve arachidonik asit (AA), dokosahexaenoik asit (DHA) ve eicosapentaenoik asit (EPA) epoksitler regioisomers arıtma için yararlı bir bakteriyel sitokrom kullanımı ile P450 enzim (BM3).
Abstract
Çeşitli çoklu doymamış yağ asitleri (PUFAs), epoksi yağ asitleri olarak adlandırılan, epifon metabolitleri, insan fizyolojisinde rolleri geniş bir yelpazede vardır. Bu metabolitler enzimlerin sitokrom P450 sınıfı ile Endogenously üretilmektedir. Onların farklı ve güçlü biyolojik etkileri nedeniyle, bu metabolitleri okumaya önemli ilgi vardır. Epoksi yağ asitleri ilk olarak önemli miktarlarda elde edilmelidir ve yüksek saflık ile vücutta bu metabolitlerin benzersiz rolleri belirlenmesi, zor bir iştir. Doğal kaynaklardan bileşikler elde genellikle emek yoğun, ve çözünür epokid Hidrolazlar (sEH) hızla metabolitleri hidrolize. Öte yandan, bu metabolitleri kimyasal reaksiyonlar yoluyla elde etmek, saf regioisomers ve enantiomers, düşük verim ve geniş (ve pahalı) arıtma alma zorluk nedeniyle çok verimsizdir. Burada, bir verimli enzimatik sentezi mevcut 19 (s), 20 (r)-ve 16 (s), 17 (r)-epoxydocosapentaenoic asitler (EDPS) DHA ile epizidasyon yoluyla bm3, bir bakteriyel CYP450 enzim orijinal Bacillus gelen izole megateryum (Bu kolayca Escherichia coliifade edilir). Karakteristik ve saflık belirlenmesi nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR), yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ve kütle spektrometresi (MS) ile gerçekleştirilir. Bu prosedür, PUFA epoksi metabolitlerinin enzimatik sentezi yararları gösterir ve diğer yağ asitleri, arachidonik asit (AA) ve eicosapentaenoik asit (EPA) dahil olmak üzere, epoksitizi için uygulanabilir asitler (EETs) ve epoxyeicosatetraenoic asitler (EEQs), sırasıyla.
Introduction
İnsan biyolojisinde çok doymamış yağ asitleri (özellikle Omega-3 ve Omega-6 çoklu doymamış yağ asitleri) oynamak rol ilgi son yıllarda büyüdü, araştırmacılar çekici faydaları geniş haber aldı ki onların metabolitleri Sergi. Özellikle, sitokrom P450 enzimlerin sınıfı tarafından üretilen epoksi yağ asidi metabolitleri odak büyük bir noktası olmuştur. Örneğin, birçok PUFA epoxides, epoxyeicosatrienoic asitler (Eets) dahil olmak üzere, epoxydocosapentaenoic asitler (EDPS) ve epoxyeicosatetraenoic asitler (eeqs), kan basıncı ve inflamasyon düzenlenmesi kritik bir rol oynar1,2 , 3 ' ü , 4 , 5. ilginçtir, AA ve EPA epoksitler spesifik enantiomerler ve regioisomers vazokonstriksiyon üzerinde değişen etkileri olduğu bilinmektedir6,7. Enantiomerler ve EETs ve EEQs regioisomers fizyolojik etkileri belgelenmiş iken, az benzer epoxydocosapentaenoic asitler (EDPs) etki DHA oluşan etkisi hakkında bilinmektedir. Balık yağı yaygın kullanımı8, EPA ve DHA hem de zengin olan, ayrıca EDPS ilgi karıştırmıştır9. Bu takviyeleri faydaları kısmen aşağı DHA metabolitleri nedeniyle olduğuna inanılmaktadır (16, 17-EDP ve 19, 20-EDP en bol olmak) çünkü EDPs in vivo seviyeleri diyet DHA miktarı ile çok iyi koordine10, 11' den itibaren.
Bu epoksi yağ asitlerinin metabolomics, kimyasal biyoloji ve diğer yöntemlerin mekanizmalarını ve hedeflerini incelemek, kısmen, çünkü Regio-ve stereo-izomerlerin karışımları olarak var oldukları ve saf miktarlarda elde etmenin bir yöntemi olan zorlu kanıtlanmıştır enantiomerler ve regioisomers gereklidir. Bu bileşikler kimyasal sentezleme için konvansiyonel araçlar etkisiz olduğunu kanıtladı. Epasetatasyon için meta-chloroperoxybenzoic asit gibi perokasitlerin kullanımı birçok dezavantajları vardır, özellikle de bireysel regioisomers ve enantiomers pahalı ve titizlikle arıtılması gerektiren epidrasyon seçicilik, eksikliği. DHA ve EPA metabolitleri toplam sentezi mümkündür, ama aynı zamanda yüksek maliyetler ve düşük verim gibi büyük ölçekli sentez için pratik yapmak dezavantajları muzdarip12,13. Enzim reaksiyonu Regio-ve stereoseçici14olduğu için, enzimatik sentezle verimli genel üretim elde edilebilir. Çalışmalar, AA ve EPA enzimatik epizemasyon (bm3 ile) hem regioseçici ve enantioseçici15,16,17,18, ama bu prosedür DHA ile test edilmedi, ya da büyük bir gösterir Ölçek. Yöntemimizin genel hedefi, bireysel enantiomerler olarak hızla önemli miktarlarda saf epoksi yağ asitleri üretmek için bu kemoenzimatik epizatasyonu ölçeklendirmek ve optimize etmek oldu. Burada sunulan yöntemi kullanarak, araştırmacılar EDPs ve diğer PUFA epoksi metabolitleri sentezi için basit ve uygun maliyetli bir stratejiye erişebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DIKKAT: listelenen kimyasalları kullanmadan önce lütfen tüm ilgili malzeme güvenlik veri sayfalarına (MSDS) danışın.
1. vahşi tip BM3 ifadesi
- PBS-bm3 transfekte DH5α E. coli (Dr. F. Ann Walker 'dan cömert bir bağış) içinde 5 ml steril lb suyu ile 0,5 mg ampisilin 20 ml kültür tüpüne eklendi.
- 200 rpm 'de 24 saat için 37 °C ' de bir shaker içinde hücre kültürünü inkük. Gece marş kültürü (5 mL) ekleyin ve 100 bir FERNBACH veya Erlenmeyer Flask steril LB suyu 1 L ampisilin mg. 37 °C ' de 200 rpm 'de 6 saat, sonra da 30 °C ' de, 200 rpm 'de 18 saat sallayın.
- 1.000 x g'de 10 dakika boyunca 4 °c ' de hücre kültürünü toplayın ve santrifüjün. Süpernatant atın ve hücre Pelet at-78 °c enzim arıtma kadar saklayın.
Not: süpernatant ya kimyasal olarak çamaşır suyu ile tedavi ile sterilize veya bir otoklav kullanarak sterilize ve sonra drenaj aşağı dökmüş olabilir.
2. BM3 arıtma.
-
Hücre liziz
- Ice-Cold (4 °c) çözünme tampon (10 mm Tris, 0,01 mm phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF;), 0,01 mm EDTA; pH 7,8) 40 ml içinde buz ve pelletini üzerinde hücre Pelet çözüyor.
DIKKAT: PMSF temas ederek zehirlidir. - Buzda ise, hücreleri 1 dakika boyunca ultrasonik Homogenizer (çıkış güç ayarı 10, Duty 100%) ile sonikat, sonra da hücreleri Lyse için buzda 1 dakika mola. Bu prosedürü 6 kez tekrarlayın. Hücre lysate 4 °c ' de 30 dakika 11.000 x g 'de Pelet hücre kalıntısıiçin Santrifüjü.
- Ice-Cold (4 °c) çözünme tampon (10 mm Tris, 0,01 mm phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF;), 0,01 mm EDTA; pH 7,8) 40 ml içinde buz ve pelletini üzerinde hücre Pelet çözüyor.
-
Benzeşim Kromatografi
- 4 °C ' de yüksek tampon A (10 mM Tris, pH 7,8) 5 sütun hacmi (CV) ile yıkayarak güçlü bir aniyon değişimi Kromatografi sütunu (bkz. malzeme tablosu; çap: 2,8 cm x 6 cm, sütun hacmi: 37 ml) hazırlayın.
- Hücre endoglikozidazları dengelenmiş sütuna ekleyin ve soğuk tampon 3 CV ile sütun yıkayın A. soğuk tampon B (10 mm Tris, 600 mm NaCl, 6 CV) ile sütunu yıkayarak bm3 elute.
- Kırmızımsı-kahverengi akıtıcı fraksiyonu toplayın. Protein hemen kullanılırsa, sıvı nitrojen ile gliserol ve flaş dondurulması eşit hacimli ile karıştırın. Dondurulmuş solüsyonu-78 °C ' de saklayın.
3. BM3 tarafından DHA epoxidation
- 0,308 g (0,940 mmol) DHA ' nın 18,8 mL 'de dimethylsulfoxıde (DMSO) ile 2 L 'ye tepki tamponunu (0,12 M potasyum fosfat, 5 mM MgCl2, pH 7,4) ile birlikte, çözülmüş bm3 enziminin 20 Nm 'sini ekleyerek reaksiyonu hazırlayın. Enzim konsantrasyonu karbon monoksit/dithionite spektral assay yöntemi19tarafından belirlenebilir.
- Çözelti karıştırırken, tepki arabelleğinde çözülmüş NADPH 1 eşdeğeri (Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat azaltılmış, tetrasodyum tuz, 0,808 g, 0,940 mmol) ekleyerek reaksiyona başlayın. Bir şırınga ve iğne bağlı bir hava dolu balon ile reaksiyon karışımı aracılığıyla hava kabarcıklanma iken 30 dakika için reaksiyon karıştırın.
- Bir spektrofotometre kullanarak ( malzeme tablosunabakın), NADPH tükenirse belirlemek için 340 Nm de reaksiyon karışımı emici kontrol edin. NADPH tüketimini gösteren kalan emici yoksa, reaksiyon tamamlanır.
Not: genellikle, reaksiyon 30 dakika sonra tamamlanır. - Çözüm pH 'Sı 4 ' e ulaşıncaya kadar, 1 M oksulik asit, dropwise ile yavaşça reaksiyon karışımından giderin.
4. EDPs ekstraksiyonu
- 3 kez dietil eter (susuz, peroksit içermeyen) 2 L ile sönüklenmiş tampon çözeltisi ayıklayın. Eter tabakasını (6 L) toplayın ve susuz magnezyum sülfat (MgSO4) ile kuru.
- MgSO4 ' ü çözümden filtreleyin ve ham EDP kalıntılarını vermek için bir döner buharlaştırıcı üzerinde kurutulmuş eter katmanını konsantre olun.
- Kalıntıyı flaş sütun Kromatografi ile arındırın (40 g silika kartuşu yeterlidir). Hekzanlar içinde% 10 etil asetat (EtOAc) başlayın ve 22 dk üzerinde hekzanlar% 60 EtOAc kadar rampa.
Not: üç büyük zirveler elde edilir ve toplanan, 1 sırasına göre el. tepki vermez DHA; 2. EDP isomers karışımı; ve 3. di-Epoxide (normal aşırı oksidasyon ürünleri (bkz. Şekil 1)). - Kesirleri birleştirin ve döner buharlaştırıcı üzerine konsantre olun. Bu örnekteki 0,074 g, (% 24) tepki vermez DHA, 0,151 g (47%) EDP ısomers ve 0,076 g, (% 22) di-Epoxide elde edildi.
5. EDPS esterleşme, 16 (s), 17 (r)-ve 19 (s), 20 (r)-EDP, ve esterlerin sabunlaşma ayrılması
DIKKAT: Trimethylsilyldiazomethane (TMS-diazomethane) hem temas hem de inhalasyon ile çok zehirlidir. Uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla sadece bir duman kaputu içinde kullanın.
- Epoksitler seyreltmeli (0,151 g, 0,435 mmol) argon altında 2 ml susuz metanol (MeOH) ve 3 ml susuz Toluen ile yuvarlak dipli bir Flask veya küçük şişede, bir karıştırın-Bar ekleyin ve TMS-diazomethane (1,2 molar eşdeğerleri veya 0,26 ml, hexanes içinde 2 M çözeltisi) ekleyin.
- 10 dakika bekleyin ve soluk sarı renk kalana kadar ek TMS-diazomethane (0,050 mL) ekleyin.
- 30 dakika sonra, dikkatle döner buharlaştırıcı kullanarak karışımı konsantre ve flaş sütun Kromatografi ile kalıntı arındırmak. Elute ile 4% EtOAc hekzanlar (kullanarak bir 40 g silika jel sütun veya kartuş) için 22 dakika. Bu örnekte, 19, 20-EDP metil ester (0,116 g, 74%) ve 16, 17-EDP metil ester (0,029 g,% 19), net yağlar (toplam verim, 93%) olarak elde edildi.
- Saflaştırılmış EDP metil ester regioisomers içeren kesirler toplayın. 19 (lar), 20 (r)-EDP ilk metil ester elutes, ardından 16 (s), 17 (r)-EDP metil ester.
- Herhangi bir karışık fraksiyonları kalırsa (her iki izomerleri içeren; ince katmanlı Kromatografi (TLC) 8:1 hexane/EtOAc tarafından değerlendirilebilir ve potasyum permanganat (KMnO4) ile lekelenmiş), daha önce olduğu gibi aynı solvent sistemi ile yeniden Kromatograf.
- Bireysel regioisomers içeren kesirler konsantre.
Not: Bu noktada, kimlik ve saflık NMR (solvent olarak CDCl3 kullanarak; Şekil 2için göstergeye bakın) tarafından değerlendirilebilir. - Bireysel EDP metil ester regioisomers kendi asit formları dönüştürmek için, THF içinde EDP Ester seyreltilebilir: su (yaklaşık 0,7 mL/0.1 mmol ester). 2 M sulu LiOH (3 molar eşdeğerleri) ekleyin ve gece karıştırın.
Not: reaksiyon bütünlüğü TLC tarafından, 3:1 hexanes/EtOAc, KMnO4ile boyama kullanılarak değerlendirilebilir; ürün bir bekletme faktörü ~ 0,3 vardır. - Karışım pH 3-4 ulaştığında kadar, formik asit ile yavaşça reaksiyon Quench. Su ve etil asetat ekleyin (1-2 mL/0.100 mmol ester) ve katmanları ayırın. EtOAc (3 x 5 mL) ile su katmanını ayıklayın, doymuş salamura (NaCl) çözeltisi ile yıkayın ve EtOAc tabakasını susuz sodyum sülfat üzerine kurutun (na2so4).
- Bir döner evaporatör kullanarak etil asetat çözeltisi konsantre, hekzanlar ekleyin (10 ml) ve tekrar konsantre. İki kez azeotropically kalan formik asit kaldırmak için tekrarlayın. Kalıntıyı flaş sütun Kromatografi ile temizler, 15 dakika üzerinde 10-30% EtOAc ile salınımlı.
- Konsantre istenilen kesirler ve kuru vakum içinde arıtılmış asit göze.
Not: Bu aşamada, enantiomerik saflık (kiral HPLC tarafından, sütun ve koşullar için Şekil 3 - Şekil 4 için efsanelere bakın) değerlendirilebilir. Kimyasal saflık C18 (achiral) HPLC (bkz. malzeme tablosu ve referans 14) ile değerlendirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flaşlı kolon kromatogram (aşağıda açıklandığı gibi otomatik bir flaş arıtma sistemi kullanılarak gerçekleştirilir) enzimatik epoksifiden ham karışımın arıtılması üzerine elde edilen Şekil 1' de gösterilir. Esterleşme ve regioisomerlerin ayrılması sonrasında, Pure 16 (s), 17 (r)-EDP ve 19 (s), 20 (r)-EDP metil esterleri elde edildi. Genellikle, bunlar yaklaşık 1:4 için 1:5 oranı, 19 (S), 20 (R)-EDP olan ana ürün ile mevcut. Başka hiçbir EDP regioisomers (örn., 13, 14-veya 10, 11-EDP) elde edilir. 1H-NMR spektrumları 16 (s), 17 (r)-EDP (Şekil 2a) ve 19 (s), 20 (r)-EDP (Şekil 2B) metil esterleri kendi yapıları ile birlikte aşağıda gösterilmiştir, bu yüksek saflığı gösteren bileşikler , Asit formlarının C18 (achiral) HPLC de saflık >% 98 göstermiştir. Kimliklerini daha yüksek çözünürlüklü kütle spektroskopisi (hem asit ve Ester formları), hangi kütle/şarj oranları ve tespit EDPs ile tutarlı parçalanma desenleri sağladı doğruladı. Enantiomerik saflık, EDPS 'in otantik enantiomer ve karma standartlarına kıyasla (asit formunda, Şekil 3A ve Şekil 4A) kiral HPLC kullanılarak belirlenmiştir. Şekil 3B ve Şekil 4b'de gözlemlendiği gibi, enzimatik epoksifikasyon ile elde edilen her iki EDP, saponizasyonun ardından son derece enantiomer (>% 99 bir enantiomer). Bu enantiomerlerin kimlikleri daha önce 16 (s), 17 (r)-ve 19 (s), 20 (r)-EDP18olarak bildirilmiştir.
Şekil 1 . DHA enzimatik Epoksi (ilgili yapıları ile birlikte) elde edilen ham karışımı arıtma gelen kromatogram. Orta tepe (monoepoxide) Istenen EDPs içerir. Arıtma otomatik bir flaş arıtma sistemi kullanılarak yapılmıştır (bkz. malzeme tablosu). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 . Örnek 1H-NMR Spectra saf 16 (lar), 17 (r)-EDP metil ester (2a) ve 19 (s), 20 (R)-EDP metil ester (2B). Spectra 500 MHz 'de CDCl3 ' te kaydedildi (solvent 7,26 ppm ve kalan suda 1,6 ppm 'de görülebilir). Kimyasal vardiya aşağıdaki gibidir: 16 (S), 17 (R)-EDP metil ester: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.57-5,35 (m, 10 h), 3,68 (s, 3 h), 2.99-2,95 (m, 2 h), 2.87-2,83 (m, 6 h), 2,47-2,37 (m, 6 h), 2,29-2.21 (m, 2 h), 2.11-2,05 (m, 2 h), 0,99 (t, J = 7,5 Hz, 3 h); 19 (lar), 20 (R)-EDP metil ester: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.54-5,35 (m, 10 h), 3,68 (s, 3 h), 2,97 (td, j = 6,4, 4,2 hz, 1 h), 2,91 (td, j = 6,3, 4,2 Hz, 1 h), 2.85-2.82 (m, 8 h), 2,44-2,36 (m, 5 h), 2,27-2.21 (m, 1 h), 1.65-1,51 (m, 3 h), 1,06 (t, j = 7,5 Hz , 3 H). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3. Bm3 tarafından üretilen 16, 17-EDP (asit formu) enantiopuritesi gösteren chiral HPLC. Şekil 3A "racemic" bir kiral HPLC kromatogram gösterir 16, 17-EDP (her iki enantiomerler otantik standartların yapay bir karışımı14), Şekil 3B enantiomer bir kiral HPLC kromatogram gösterir ise 16 (S), 17 (R )->% 99 S, R ISOMER olarak DEĞERLENDIRILEN DHA ile bm3, epoxidation tarafından üretilen EDP. Kolon selüloz bazlı (bkz. malzeme tablosu, 250 x 4,6 mm, 5 μm, 1.000 Å) İzokratik 45% 50 mM Amonyum Bikarbonat (NH4HCO3) metanol içinde (30 dk), numune konsantrasyonu ile 0,5 mm ve akış hızı 1 ml/dak. lütfen Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın.
Şekil 4. Bm3 tarafından üretilen 19, 20-EDP (asit formu) enantiopuritesi gösteren chiral HPLC. Şekil 4A bir kiral HPLC kromatogram gösterir "racemic" 19, 20-EDP (her iki enantiomerlerin otantik standartları yapay bir karışımı14), Şekil 4b enantiomer bir kiral HPLC kromatogram gösterir 19 (S), 20 (R)-EDP üretilen BM3 ile DHA 'nın epoxidation tarafından, > 99% S,R ISOMER olarak değerlendirildi (Yöntem Şekil 3için açıklandığı gibi). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 . Genel enzimatik epidrasyon reaksiyonu şeması ve AA, EPA, EETs ve EEQs ilgili yapıları bu yöntem tarafından üretilen bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen tıklayın.
Şekil 6 . BM3 tarafından üretilen 17, 18-EEQ (asit formu) enantiopuritesi gösteren chiral HPLC. Şekil 6a "racemic" bir kiral HPLC kromatogram gösterir 17, 18-EEQ (her iki enantiomerler otantik standartların yapay bir karışımı14), Şekil 6B enantiomer bir kiral HPLC kromatogram gösterir ise 17 (S), 18 (R )-EEQ bm3 Ile EPA epoxidation tarafından üretilen, > 99% Solarak değerlendirildi,R ISOMER ( Şekil 3için açıklandığı gibi Yöntem). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada DHA-19, 20 ve 16, 17-EDP iki en bol epoksi metabolitleri hazırlamak için operasyonel olarak basit ve maliyet-etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu epoksi yağ asitleri, vahşi tip bm3 enzim kullanarak yüksek enantiomer ( S, R-isomers gibi) şeklinde hazırlanabilir. Sorun giderme için kullanılan çeşitli kritik noktaları ve AA ve EPA enantiomer epoksi metabolitleri hazırlamak için bizim yöntemin uzantısı, aşağıda açıklanmıştır.
BM3 depolama yönergeleri
Arıtılmış BM3 enzimini depolamak, a-78 °C ' deki dondurucuda depolama öncesinde sıvı nitrojen ile eşit hacimli gliserol ve flaş donma ile protein çözümünü karıştırarak mümkündür. Enzim dondurulduktan sonra, bir yıla kadar depolanabilir. Enzim sadece bir kez çözülür, buzda çözülür ve sadece 4 h için buzda bırakılabilir. tekrar donma ve enzimin bir buz banyosu olmadan çözülmesine izin vermek enzimi devre dışı bırakır.
Kimyasal Depolama kuralları
Prosedür için gerekli bileşiklerin çoğu hava duyarlıdır. Bunlar DHA ve diğer PUFAs, EDPs ve diğer epoksi metabolitleri ve NADPH içerir. Bu bileşiklerin peroksidasyonunu (ve diğer oksidatif süreçlerini) önlemek için, her zaman argon veya nitrojen ile saklanan ve-78 °C ' de depolar olan konteynerleri temizler.
Başka bir önemli not DHA depolandığı çözümdür. DHA DMSO 'da çok kararlı olmasa da, BM3 etanol ve metanol ile uyumsuzdur, bu nedenle DMSO kullanılmalıdır. Düşük stabilitesini karşı koymak için, DHA karışımı, epoksişleme ile aynı gün taze hazırlanmalıdır. Reaksiyonda toplam DMSO yüzdesi enzimin devre dışı bırakılması için% 1 altında tutulmalıdır. Ayrıca, NADPH kısa bir raf ömrü olduğundan, konsantrasyon reaksiyon ek Önce Spektrofotometre ile kontrol edilmelidir. Bu NADPH 1 eşdeğer her zaman reaksiyon karışımı eklenir sağlar.
Epokidasyon reaksiyon kuralları
Oksijen, oksidasyon için gerekli olduğu için reaksiyonu oksijenli tutmak amacıyla balondan reaksiyon karışımından hava akımı korunmalıdır. PUFAs su içinde çok çözünmez olduğundan karışımı da hızla karıştırılabilir olmalıdır (DHA çözünürlüğünün ≤ 125 μM reaksiyonda tampon). Reaksiyon protein denatüre için oksisik asit ile söndür (Bu metal şelat ve Kofaktörler kaldırır gibi) ve asit, dietil eter ekstraksiyon için gerekli olan DHA nötr formu, tutar. Reaksiyonda sıvı giderici, EDPs 'in asitle katalizlenmiş hidrolizsini önlemek için yavaşça yapılmalıdır.
EDP ekstraksiyon ve arıtma kuralları
Eter özellikle birden çok nedenden dolayı ekstraksiyon çözücü olarak seçilmiştir. Dichloromethane solüsyondan proteini çöktürebilir, bu da ekstraksiyon karmaşıklaşır. EtOAc, kaldırmak ve flaş kromatografi ile müdahale etmek zordur gliserol (enzim stok çözeltisi ile eklendi) ayıklar.
Serbest asit durumlarında EDP regioisomers kolayca ayrılabilir değildir, bu yüzden regioisomers ilk flaş sütun Kromatografi tek bir tepe içine karıştırılır. Onlar metil esterleri dönüştürülür kez, regioisomers kolayca ayrılabilir. Ayrıca, esterleri genellikle asit formu hemen gerekli değilse, uzun süreli depolama için karşılık gelen asitler daha kararlı.
Mevcut/alternatif yöntemlere göre yöntemin önemi
Bizim yöntemi mevcut ve alternatif yöntemler üzerinde birçok avantajı vardır enantiomer EDPS, elde etmek için basit ve etkili bir yöntem sağlar. İlk olarak, DHA ve diğer PUFAs kimyasal epoksi ve türevleri ne regioseçici veya enantioseçici, ve karmaşık karışımları genellikle elde edilir. Çoklu Flash Kromatografi sütunları ve kiral hazırlık HPLC de dahil olmak üzere hazırlık HPLC, bu nedenle enantiomer epoksi yağ asitleri bu karışımlardan arındırmak için gereklidir, hangi emek yoğun olan ve istenen sadece çok az miktarda üretebilir Metabolitleri. Toplam sentezi de epoksi yağ asitleri üretmek için istihdam edilebilir, ama titiz, zaman alıcı, birden fazla adım gerektirir, ve düşük bir genel verim verir, BM3 enzim ifade etmek ve arındırmak kolay ise, ve epoksi kısa bir süre içinde tamamlandı Zaman. Bizim yöntem de maliyet-etkili: bir ticari kaynak20 Şu anda 16, 17-ve 19, 20-EDP (onların racemates olarak) 528 usd/0,5 mg. 1 g NADPH için de satın alınabilir sunuyor ~ 500-800 USD, ve üzerinde üretmek için kullanılabilir 200 kez miktarını 19, 20- EDP (ve yaklaşık 50 kez 16, 17-EDP miktarı) benzer bir fiyat için ticari olarak sunulan-ve enantiomer formları, şu anda ticari olarak mevcut değildir.
Yöntemin sınırlamaları
Bu enzim tercih DHA son çift bağ epoxidizes olarak, ana ürün 19, 20-EDP (rağmen 16, 17-EDP de üretilmektedir). Bu nedenle, istenebilecek diğer DHA regioisomers (örn., 13, 14-EDP, 10, 11-EDP) vahşi tip BM3 ile enzimatik epoksi ile üretilemez. Ayrıca, sadece SR-enantiomers tarafından üretilen bm3, RS-enantiomers erişilemez, ancak daha önce yayınlanmış kimyasal inversiyon yöntemi14 onları sentezlemek için kullanılabilir. Ayrıca, reaksiyon tamponunda lipofilik PUFAS 'ın düşük çözünürlüğü nedeniyle, tampon çok büyük miktarlarda büyük ölçekli üretim için gerekli olacaktır (CA. 500-1000 mg) EDPS, hangi potansiyel ekstraksiyon zaman alıcı veya engelleyici yapabilir.
Yöntemin diğer uygulamaları
Hoş bir şekilde, bu enzimatik epokidasyon Protokolü EPA ve AA için de geçerlidir (ilgili yapılar Şekil 5' te gösterilir). Üç yağ asitlerinin her biri için gerekli konsantrasyonlar, tampon ve reaksiyon süresi aynıdır. EPA için, Wild-Type BM3 enzim de kullanılır, ve EEQ fraksiyonu EPA elde (56% monoepoxide verim), esterleşme sonra ~ 14:1 17, 18-EEQ: 14, 15-EEQ. EDPS için yapılan gözlemlere benzer şekilde, elde edilen 17, 18-eeq son derece enantiomer (> 99% 17 (S), 18 (R)-eeq, bkz. Şekil 6) kiral HPLC tarafından değerlendirildiğinde (bkz. Şekil 3 Legend ve malzeme tablosu). Enantiomerler kimliği daha önce17bildirdi. AA için, ancak, F87V BM3 mutant yerine kullanılması gerekir Wild-Type BM3 AA21için bir hidroksilaz olduğunu. İfade ve bu mutant saflaştırma da yukarıdaki protokol kullanır, ve epoksi benzer bir şekilde gerçekleştirilir. Bu yöntemle, 14, 15-EET tek regioisomer olarak elde edilir. 14, 15-EET serbest asit, epoksifikasyon aşağıdaki reaksiyona girmeden AA ayrılmaz, esterleşme gereklidir; 14, 15-EET metil ester elde edilir 52% AA verim. Chiral HPLC (bkz. Şekil 3 efsane ve malzeme tablosu) asit yüksek enantiomer gösterir (> 99%) 14 (S), 15 (R)-EET (daha önce bildirilen)15. Bu EPA ve AA metabolitleri için kimyasal vardiya aşağıdaki gibidir: 17 (S), 18 (R)-EEQ metil ester:1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.53-5.34 (m, 8 H), 3,67 (s, 3 h), 2,96 (TD, j = 6,4, 4,2 Hz, 1 h), 2,90 (td, j = 6,3, 4,2 Hz, 1 h), 2.85-2,79 (m, 6 h), 2,44-2,38 (m, 1 h), 2,32 (t, J = 7,5 Hz, 2 h), 2.26-2.20 (m, 1 h) , 2,11 (q, j = 6,7 Hz, 2 h), 1,71 (Quintet, j = 7,4 Hz, 2 h), 1,66-1.50 (m, 2 h), 1,05 (t, j = 7,5 Hz, 3 h); 14 (S), 15 (R)-EET metil ester: 1 H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.53-5.33 (m, 6 H), 3,67 (s, 3 h), 2,95-2,92 (m, 2 h), 2,81 (DT, j = 17,8, 5,8 Hz, 4 h), 2,40 (dt, j = 14,1, 6,8 hz, 1 h), 2,32 (t, j = 7,5 Hz, 2 h), 2,23 (DT, j = 14,1, 6,8 Hz, 1 h) , 2,11 (q, j = 6,8 Hz, 2 h), 1,71 (Quintet, j = 7,4 Hz, 2 h), 1,56-1.41 (m, 4 h), 1,38-1.30 (m, 4 h), 0,90 (t, J = 7,1 Hz, 3 h).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, ifşa etmek için ilgi çatışması yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, R00 ES024806 (Ulusal Sağlık Enstitüleri), DMS-1761320 (Ulusal Bilim Vakfı) ve Michigan State University 'den başlangıç fonları tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar, enzimatik reaksiyon optimizasyonu ve Dr. Tony Schilmiller (MSU Kütle Spektrometrisi ve Metabolomics tesisi) ile ilgili yardım için Dr. Jun Yang 'a (Davis 'de California Üniversitesi) ve Lalitha Karchalla 'ya (Michigan Devlet Üniversitesi) teşekkür etmek istiyor HRMS veri edinme ile ilgili yardım için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
- Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
- Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
- Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211 (2016).
- Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
- Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
- Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).
- Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
- Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
- Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
- Khan, M. A., Wood, P. L. Method for the synthesis of DHA. , WO2012126088A1 (2012).
- Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
- Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
- Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
- Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
- Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
- Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
- Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
- Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019).
- Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).
