Summary
Представляем полезный для крупномасштабного ферментативного синтеза и очистки специфических энантиомеров и региоисомеров эпоксидов арахидоновой кислоты (АА), докозагексаеновой кислоты (ДГК) и эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) с использованием бактериального цитохрома Фермент P450 (BM3).
Abstract
Эпоксидированные метаболиты различных полиненасыщенных жирных кислот (ПУФА), именуемые эпоксидными жирными кислотами, играют широкий спектр ролей в физиологии человека. Эти метаболиты производятся эндогенно цитохромом класса P450 ферментов. Из-за их разнообразных и мощных биологических эффектов, существует значительный интерес к изучению этих метаболитов. Определение уникальной роли этих метаболитов в организме является трудной задачей, так как эпоксидные жирные кислоты сначала должны быть получены в значительных количествах и с высокой чистотой. Получение соединений из природных источников часто является трудоемким, а растворимые эпоксидные гидролазы (sEH) быстро гидролизуются метаболиты. С другой стороны, получение этих метаболитов с помощью химических реакций является очень неэффективным, из-за трудностей получения чистых региоисомеров и энантиомеров, низких урожаев и обширной (и дорогостоящей) очистки. Здесь мы представляем эффективный ферментатическийсинтез 19 (S), 20 ( R)- и 16 (S), 17 (R)-эпоксидокосапентаевские кислоты (EDPs) из ДГК через эпоксидацию с BM3, бактериальный фермент CYP450, изолированный первоначально из Bacillus megaterium (что легко выражается в Escherichia coli). Характеристика и определение чистоты осуществляется с помощью ядерной магнитно-резонансной спектроскопии (ЯМР), высокопроизводительной жидкой хроматографии (HPLC) и масс-спектрометрии (МС). Эта процедура иллюстрирует преимущества ферментативного синтеза эпоксидных метаболитов PUFA, и применима к эпоксидации других жирных кислот, включая арахидоновая кислота (АА) и eicosapentaenoic кислоты (EPA) для производства аналогичных эпоксикозасатрино кислоты (EET) и эпоксикозатетененоии кислоты (EE), соответственно.
Introduction
Поскольку интерес к роли, которую полиненасыщенные жирные кислоты (в частности, омега-3 и омега-6 полиненасыщенные жирные кислоты) играют в биологии человека, в последние годы вырос интерес, исследователи обратили внимание на широкий спектр привлекательных преимуществ, которые их метаболиты Выставка. В частности, значительной точкой внимания были метаболиты эпоксидной жирной кислоты, вырабатываемые цитохромом класса P450. Например, многие эпоксидные паоксиды PUFA, в том числе эпоксикозатриноиновые кислоты (EET), эпоксидокозапентаеновые кислоты (EDPs) и эпоксикозатететрееновые кислоты (Экэ), играют важную роль в регуляции артериального давления и воспаления1,2 , 3 , 4 , 5. Интересно, что конкретные энантиомеры и региоисомеры АА и ЭПК эпоксиды, как известно, имеют различное влияние на сосудосуживание6,7. В то время как физиологические эффекты энантиомеры и региоизомы EETs и EE's были задокументированы, мало что известно о влиянии аналогичных эпоксидокосапентаевных кислот (ЭДП), образованных из ДГК. Широкое использование рыбьего жира8, который богат как EPA и ДГК, также вызвал интерес к EDPs9. Преимущества этих добавок, как полагают, отчасти из-за вниз по течению ДГК метаболитов (16,17-EDP и 19,20-EDP является наиболее распространенным), потому что в ививо уровни EDPs координировать очень хорошо с количеством ДГК в диете10, 11.
Изучение механизмов и целей этих эпоксидных жирных кислот метаболомией, химической биологией и другими методами оказалось сложным, отчасти потому, что они существуют как смеси реджио- и стерео-изомеров, и метод получения чистого количества enantiomers и regioisomers не требуется. Обычные средства для химического синтеза этих соединений оказались неэффективными. Использование пероксикислот, таких как мета-хлоропероксибензоиновая кислота для эпоксидации, имеет много недостатков, в частности, отсутствие селективности эпоксидации, что требует дорогостоящей и кропотливой очистки отдельных региоизомеров и энантиомеров. Тотальный синтез метаболитов ДГК и ЭПК возможен, но также страдает от недостатков, которые делают его нецелесообразным для крупномасштабного синтеза, таких как высокие затраты и низкие урожаи12,13. Эффективное общее производство может быть достигнуто с помощью ферментативного синтеза, так как ферментативные реакции режио- и стереоселекционные14. Исследования показывают, что ферментативная эпоксидация АА и EPA (с BM3) является регипоцитивным и энантиоселективным15,16,17,18, но эта процедура не была протестирована с ДГК, или на большом Масштаб. Общая цель нашего метода заключалась в расширении и оптимизации этой хемоэнсиматической эпоксидации, чтобы быстро производить значительное количество чистых эпоксидных жирных кислот в качестве их отдельных энантиомимов. Используя представленный здесь метод, исследователи имеют доступ к простой и экономичнейой стратегии синтеза ЭДП и других эпоксидных метаболитов PUFA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, проконсультируйтесь со всеми соответствующими листами данных о безопасности материалов (MSDS) перед использованием перечисленных химических веществ.
1. Выражение дикого типа BM3
- Привить pBS-BM3 трансfected DH5 "E. coli (щедрое пожертвование от доктора Ф. Энн Уокер) в 5 мл стерильного бульона LB с 0,5 мг ампициллина добавил в 20 мл культуры трубки.
- Инкубировать клеточную культуру в шейкере при 37 градусах по Цельсию при 24 ч при 200 об/мин. Добавьте культуру ночного стартера (5 мл) и 100 мг ампициллина в 1 л стерильного бульона LB в колбе Фернбаха или Эрленмейера. Встряхните при 37 градусах по Цельсию при 6 ч при 200 об/мин, затем при 30 градусах по Цельсию при 200 об/мин.
- Соберите и центрифуги ячеек культуры на 4 кв к в течение 10 минут на 1000 х г. Откажитесь от супернатанта и храните клеточные гранулы при -78 градусов по Цельсию до очистки ферментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант может быть либо химически стерилизованы путем лечения отбеливателем или стерилизованы с помощью автоклава, а затем вылил в канализацию.
2. Очистка BM3.
-
Лиза клетки
- Оттепели клеточные гранулы на льду и повторно в 40 мл ледяного (4 кВ) буфера растворификации (10 мм Трис, 0,01 мм фенилметилсульфонил фтора (PMSF;), 0,01 мм EDTA; pH 7.8).
ВНИМАНИЕ: PMSF является токсичным при контакте. - Находясь на льду, снотрадите клетки в течение 1 мин с ультразвуковым гомогенизатором (выходная мощность устанавливает10, долг 100%), а затем 1 мин перерыв на льду для того, чтобы линза клеток. Повторите эту процедуру 6 раз. Центрифуга клетки lysate при 4 кв к в течение 30 мин на 11000 х г, чтобы гранулы клеточного мусора.
- Оттепели клеточные гранулы на льду и повторно в 40 мл ледяного (4 кВ) буфера растворификации (10 мм Трис, 0,01 мм фенилметилсульфонил фтора (PMSF;), 0,01 мм EDTA; pH 7.8).
-
Хроматография сродства
- Подготовьте сильный столбец обмена анионов (см. ТаблицаМатериалов; диаметр: 2,8 см х 6 см, объем колонны: 37 мл) путем промывания с 5 объемами столбцов (CV) буфера A (10 мм Трис, рН 7,8) при 4 градусах По Цельсию.
- Добавьте клеточные лисаты в уравновеш— колонку и промойте колонку 3 CV холодного буфера A. Elute BM3, промыв колонну холодным буфером B (10 мМ Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
- Соберите красновато-коричневую элюентную фракцию. Если белок используется не сразу, смешайте его с равным объемом глицерола и заморозьте вспышкой с жидким азотом. Храните замороженный раствор при -78 градусах Цельсия.
3. Эпоксидация ДГК по BM3
- Подготовьте реакцию, добавив 0,308 г (0,940 ммоль) ДГК в 18,8 мл диметилсульфоксида (ДМСО) до 2 л буфера реакции (0,12 М фосфат калия, 5 мМ МГКл2, рН 7,4) вместе с 20 Нм размороженного фермента BM3. Концентрация фермента может быть определена методом спектрального анализа угарного газа/дитионита19.
- В то время как раствор помешивается, начните реакцию, добавив 1 эквивалент NADPH (никотинамид аденин динуклеотид фосфат уменьшается, соль тетры натрия, 0,808 г, 0,940 ммоль) растворяется в реакционном буфере. Перемешать реакцию в течение 30 минут в то время как восходящей воздухчерез реакционную смесь с воздухом заполненный шар омывается шприц и игла.
- Используя спектрофотометр (см. ТаблицуМатериалов), проверьте поглощение реакционной смеси на уровне 340 нм, чтобы определить, исчерпан ли NADPH. Если нет оставшегося абсорбции, указывающей на потребление NADPH, реакция завершена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, реакция завершается через 30 минут. - Утолить реакционную смесь, медленно добавляя 1 м щавелевой кислоты, капли, пока рН раствора не достигнет 4.
4. Извлечение ЭДП
- Извлеките закаленный буферный раствор с 2 l диэтил-эфира (ангирута, без перекиси) 3 раза. Соберите слой эфира (6 л) и высушите сульфатом магния (MgSO4).
- Фильтр MgSO4 из раствора и концентрат высушенного слоя эфира на роторном испарителе, чтобы получить сырой остаток EDP.
- Очистите остатки с помощью флэш-колонки хроматографии (достаточно 40 г картриджа кремнезема). Начните с 10% этилового ацетата (EtOAc) в гексанах и нарастить до 60% EtOAc в гексанах более 22 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Три основных пика получены и собраны, eluting в порядке 1. не отреагированный ДГК; 2. смесь изомеров EDP; и 3. ди эпоксид (нормальные продукты чрезмерного окисления (см. рисунок1)). - Смешайте фракции и сконцентрируйте их на вращающемся испарителе. Из этого примера 0,074 г, (24%) ДГК, 0,151 г (47%) изомеров EDP, и 0.076 г, (22%) ди эпоксида были получены.
5. Эстерификация ЭДП, разделение16 ( S), 17 ( R)- и 19 (S), 20 (R )-EDP, и сапонификация эфиров
ВНИМАНИЕ: Trimethylsilyldiazomethane (TMS-диазоменан) очень токсичен как при контакте, так и при вдыхании. Используйте только в дымовой капот с соответствующим индивидуальным защитным оборудованием.
- Разбавить эпоксиды (0,151 г, 0,435 ммоль) в круглодной колбе или небольшой флакон с 2 мл ангидруса метанола (MeOH) и 3 мл ангидры толуола, добавить перемешать-бар, и добавить TMS-диазометана (1,2 молярных эквивалентов, или 0,26 мл раствора 2 м.
- Подождите 10 минут и добавьте дополнительные TMS-диазометан (0.050 мл) до тех пор, пока не останется бледно-желтый цвет.
- После 30 минут тщательно сконцентрируйте смесь с помощью роторного испарителя и очистите остатки флэш-колонкой хроматографии. Elute с 4% EtOAc в гексанах (с использованием 40 г кремнезема желоколонка или картридж) в течение 22 мин. В этом примере 19,20-EDP метиловый эфир (0,116 г, 74%) и 16,17-EDP метилэфир (0,029 г, 19%), были получены в виде чистых масел (общая урожайность, 93%).
- Соберите фракции, содержащие очищенные метилэтикоэмиомеры EDP. 19(S),20 (R)-EDP метил эфир elutes первый, а затем 16 (S), 17 (R)-EDP метиловый эфир.
- Если какие-либо смешанные фракции остаются (содержащие оба изомеров; могут быть оценены тонкослойной хроматографией (TLC) в 8:1 гексан/EtOAc и окрашены перманганата калия (KMnO 4)), повторно хроматограф их с той же системой растворителя, как и раньше.
- Концентрируйте фракции, содержащие отдельные региоисомеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, личность и чистота могут быть оценены NMR (с помощью CDCl3 в качестве растворителя; см. легенду на рисунке 2). - Для преобразования отдельных региоизомеров метил-этира EDP в их кислотные формы разбавьте эстер EDP в THF:water (примерно 0,7 мл/0,1 ммоль эфира). Добавьте 2 M aqueous LiOH (3 молярных эквивалента) и перемешайте на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полнота реакции может быть оценена TLC, используя 3:1 гексаны / EtOAc, окрашивание с KMnO4; коэффициент удержания продукта составляет 0,3 евро. - Утолить реакцию медленно с formic кислотой, до тех пор пока pH смеси не достигнет 3-4. Добавьте воду и этиловый ацетат (1-2 мл/0.100 ммоль эфира) и разделите слои. Извлеките слой воды с помощью EtOAc (3 х 5 мл), промойте насыщенным раствором рассола (NaCl) и высушите слой EtOAc над ангидровым сульфатом натрия (Na2SO4).
- Сконцентрируйте раствор этилового ацетата с помощью роторного испарителя, добавьте гексаны (10 мл) и снова концентрируйтесь. Повторите дважды, чтобы азеотропно удалить остаточные для мической кислоты. Очистите остатки с помощью флэш-колонки хроматографии, eluting с 10-30% EtOAc более 15 мин.
- Сосредоточьтесь на желаемых фракциях и высушите в vacuo, чтобы позволить себе очищенную кислоту.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе, энантиомерной чистоты могут быть оценены (по хираль HPLC, см. легенды для Рисунок 3 - Рисунок 4 для колонки и условий). Химическую чистоту можно оценить по C18 (ахираль) HPLC (см. Таблица материалов и ссылка 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Хроматограмма флэш-колонки (выполненная с использованием автоматизированной системы очистки вспышки, как описано ниже), полученная при очищении сырой смеси от ферментатической эпоксидации показана на рисунке 1. После эстерификации и разделения regioisomers,чистый 16 ( S), 17 (R)-EDP и 19 (S), 20 (R)-EDP метиловые эфиры были получены. Как правило, они присутствуют в приблизительном соотношении 1:4 к1:5, при этом основным продуктом является 19 (S), 20 (R)-EDP. Других режиоизомеров EDP (например, 13,14- или 10,11-EDP) не получаются. 1H-NMR спектра 16(S), 17 (R)-EDP (Рисунок 2A) и 19 (S), 20 (R)-EDP (Рисунок 2B) метиловые этеры вместе с их структурами показаны ниже, что указывает на высокую чистоту этих соединений; C18 (ахиральный) HPLC кислотных форм также указал на чистоту Их личность была также подтверждена масс-спектроскопией высокого разрешения (как кислотной, так и эстеровой формы), которая давала соотношение массы/заряда и модели фрагментации в соответствии с выявленными ЭДП. Энантиомерная чистота была определена с помощью хирала HPLC, по сравнению с подлинными энантиочистыми и смешанными стандартами ЭДП (в их кислотной форме, Рисунок 3A и Рисунок 4A). Как можно наблюдать на рисунке 3B и Рисунок 4B, оба EDPs, полученные ферментативной эпоксидации являются высоко enantiopure после сапонификации (Зgt;99% один энантиомер). Личности этих энантиомеров ранее сообщалось,16 (S), 17 (R)- и 19 (S ), 20 (R )-EDP18.
Рисунок 1 . Хроматограмма от очищения сырой смеси, полученная из ферментативной эпоксидации ДГК (наряду с соответствующими структурами). Средний пик (моноэпоксид) содержит желаемые ЭДП. Очистка проводилась с помощью автоматизированной системы очистки флэш-памяти (см. Таблицаматериалов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 . Пример 1H-NMR спектра чистого 16(S),17 (R)-EDP метиловый эфир (2A) и 19 (S),20(R)-EDP метиловый эфир (2B). Спектра были записаны на 500 МГц в CDCl3 (растворитель виден при 7,26 промилле и остаточной воды на 1,6 промилле). Химические сдвиги следующие: 16 (S), 17 (R )-EDP метиловый эфир: 1H-NMR (500 МГц; CDCl3: 5,57-5,35 (м, 10 Н), 3,68 (с, 3 Н), 2,99-2,95 (м, 2 Н), 2,87-2,83 (м, 6 Н), 2,47-2,37 (м, 6 Н), 2,29-2,21 (м, 2 Н), 2,11-2,05 (м, 2 Н), 0,99 (т, Д. 7,5 Нц, 3); 19(S),20 (R)-EDP метил эфир: 1H-NMR (500 МГц; CDCl3: 5,54-5,35 (м, 10 Н), 3,68 (ы, 3 Н), 2,97 (тд, J 6,4, 4,2 Гц, 1 Н), 2,91 (тд, J - 6,3, 4,2 Гц, 1 Нц), 2,85-2,82 (м, 8 Н), 2,44-2,36 (м, 5 Н), 2,27-2,21 (м, 1 Н), 1,65-1,51 (м, 3 Нц), 1,06 т,5 , 3 H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Chiral HPLC указывает на энантиочистоту 16,17-EDP (кислотная форма), производимая BM3. Рисунок 3A показывает хиральную хроматограмму HPLC "расовой" 16,17-EDP (искусственная смесь аутентичных стандартов обоих энантиомеров14),в то время как рисунок 3B показывает хиральную хроматограмму HPLC энантиоpure 16 (S), 17(R )-EDP производится путем эпоксидации ДГК с BM3, оценивается как йgt;99% S,R изомер. Колонка на основе целлюлозы (см. Таблица материалов, 250 х 4,6 мм, 5 мкм, 1000 м) eluting с изократическим 45% 50 мм мм амикарбонат (NH4HCO3) в метаноле (30 мин), с концентрацией образца 0,5 мм и скорость потока 1 мл / мин. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Chiral HPLC указывает на энантиочистоту 19,20-EDP (кислотная форма), производимая BM3. Рисунок 4A показывает хиральный HPLC хроматограмма "расовой" 19,20-EDP (искусственная смесь аутентичных стандартов обоих энантиомеров14),в то время как рисунок 4B показывает хиральный HPLC хроматограмма энантиопюр 19 (S), 20 (R)-EDP производится эпоксидированиеМ ДГК с BM3, оцененный как йgt;99% S,R изомер (метод, как описано для рисунка 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 . Общая ферментативная схема реакции эпоксидации и соответствующие структуры АА, EPA, EETs и EE, подготовленные этим методом Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 . Chiral HPLC, указывающий на энантиочистоту 17,18-EE (кислотная форма), производимая BM3. Рисунок 6A показывает хиральную хроматограмму HPLC "расовой" 17,18-EE (искусственная смесь аутентичных стандартов обоих энантиомеров14),в то время как рисунок 6B показывает хиральную хроматограмму HPLC энантиоpure 17 ( S), 18 (R ) - EE, производимые эпоксидированием EPA с BM3, оценено как sgt;99% S,R изомер (метод, как описано для рисунка 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представляем здесь оперативно простой и экономически эффективный метод подготовки двух наиболее распространенных эпоксидных метаболитов ДГК - 19,20 и 16,17-EDP. Эти эпоксидные жирные кислоты могут быть подготовлены в высоко энантиочисты (как их S,R-изомеры) форме с использованием фермента bm3 дикого типа. Ниже описано несколько критических точек, которые могут быть использованы для устранения неполадок, а также расширение нашего метода подготовки энантиочистых эпоксидных метаболитов АА и ЭПК.
Руководящие принципы хранения BM3
Хранение очищенного фермента BM3 возможно путем смешивания белкового раствора с равным объемом глицерола и флэш-замораживания жидким азотом перед хранением в морозильной камере -78 градусов. После того, как фермент заморожен, он может храниться до года. Фермент может быть разморожен только один раз, должны быть разморожены на льду, и может быть оставлен на льду только на 4 ч. Замораживание снова, и позволяет фермента таять без ледяной ванны будет деактивировать фермент.
Руководящие принципы хранения химических веществ
Многие соединения, необходимые для процедуры, чувствительны к воздуху. К ним относятся ДГВ и другие PUFAs, EDPs и другие эпоксидные метаболиты, и NADPH. Для предотвращения перекисного окисления (и других окислительных процессов) этих соединений, всегда промыть контейнеры, в которых они хранятся с аргоном или азотом и хранить при -78 градусов по Цельсию.
Другим важным примечанием является решение, в котором хранится ДГК. Хотя ДГК не очень стабильна в DMSO, BM3 несовместим с этанолом и метанолом, поэтому DMSO необходимо использовать. Чтобы противодействовать его низкой стабильности, смесь ДГК должна быть приготовлена недавно в тот же день, что и эпоксидация. Общий процент DMSO в реакционной смеси должен быть менее 1%, чтобы избежать деактивации фермента. Кроме того, поскольку NADPH имеет короткий срок годности, концентрация должна быть проверена с помощью спектрофотометра до добавления к реакции. Это гарантирует, что 1 эквивалент NADPH всегда добавляется в реакционную смесь.
Руководящие принципы реакции на эпоксидацию
Воздушный поток из воздушного шара в реакционную смесь необходимо поддерживать, чтобы сохранить реакцию насыщенной кислородом, так как кислород необходим для эпоксидации. Смесь также должна быть быстро перемешивают, так как PUFAs не очень растворимы в воде (растворимость ДГК составляет 125 мкм в буфере реакции). Реакция закаляется щавелевой кислотой на денатурированный белок (так как она хелатирует металл и удаляет кофакторы), а кислота сохраняет ДГК свою нейтральную форму, которая необходима для извлечения диэтилового эфира. Закалка реакционной смеси должна проводиться медленно, чтобы избежать кислотно-катализированного гидролизовЭДа ЭДП.
Руководящие принципы по добыче и очистке EDP
Эфир был выбран специально в качестве растворителя добычи по нескольким причинам. Дихлорметан может высажывать белок из раствора, что усложняет экстракции. EtOAc экстрактир (добавлен с ферментом бульон ассоциативных раствор), который трудно удалить и мешает флэш-хроматографии.
Региоисомы EDP в свободном кислотном состоянии не легко отделяются, поэтому региоисомы смешиваются в один пик в первой хроматографии флэш-колонки. Как только они преобразуются в метиловые эзеры, реж. Кроме того, эзеры, как правило, более стабильны, чем соответствующие кислоты для длительного хранения, если кислотная форма не нужна немедленно.
Значение метода по отношению к существующим/альтернативным методам
Наш метод обеспечивает простой и эффективный метод получения энантиочистыED EDPs, который имеет много преимуществ по сравнению с существующими и альтернативными методами. Во-первых, химическая эпоксидация ДГК и других ПУФА и их производных не является региоселеселесционной или энантиоселективной, и часто получаются сложные смеси. Несколько флэш-хроматографии колонны и preparative HPLC, в том числе хиральный preparative HPLC, поэтому необходимы для очистки энантиочисты эпоксидных жирных кислот из этих смесей, которые являются трудоемкими и может производить только очень небольшое количество желаемого Метаболитов. Общий синтез также может быть использован для производства эпоксидных жирных кислот, но он строгий, отнимает много времени, требует нескольких шагов и дает низкую общую урожайность, в то время как фермент BM3 легко выразить и очистить, и эпоксидация завершена в течение короткого периода Время. Наш метод также рентабельен: коммерческий источник20 в настоящее время предлагает 16,17- и 19,20-EDP (как их товарищи по гонке) за 528 USD /0,5 мг. 1 г NADPH также можно приобрести за 500-800 долларов США, и может быть использован для производства более чем в двести раз количество 19,20- EDP (и примерно в пятьдесят раз больше, чем 16,17-EDP) предлагается коммерчески по аналогичной цене - и в enantiopure формы, которые в настоящее время не коммерчески доступны.
Ограничения метода
Поскольку этот фермент преимущественно эпоксидирует последнюю двойную связь ДГК, основным продуктом является 19,20-EDP (хотя 16,17-EDP также производится). Таким образом, другие региоизомы ДГК, которые могли бы быть желательными (например, 13,14-EDP, 10,11-EDP) не могут быть произведены ферментатической эпоксидации с диким типом BM3. Кроме того, поскольку только SR-энантиомеры производятся BM3, RS-энантиомерынедоступны, хотя наш ранее опубликованный метод химической инверсии14 может быть использован для их синтеза. Кроме того, из-за низкой растворимости липофильных ПУФА в буфере реакции, очень большое количество буфера будет необходимо для крупномасштабного производства (около 500-1000 мг) ЭДП, которые потенциально могут сделать добычу трудоемким или непомерным.
Другие применения метода
Приятно, что этот ферментативный протокол эпоксидации также применим к EPA и АА (соответствующие структуры показаны на рисунке 5). Концентрации, буфер, и время реакции, необходимое для эпоксидации всех трех жирных кислот то же самое. Для EPA, фермент BM3 дикого типа также используется, и фракция EE, полученная из EPA (56% урожайности моноэпоксида), после эстерификации составляет 14:1 17,18-EE:14,15-EE. Подобно наблюдениям, сделанным для EDPs, полученные 17,18-EE, очень enantiopure (99% 17 (S), 18 (R)-EE, см. Рисунок 6) по оценке хирал HPLC (см. Рисунок 3 легенда и Таблица материалов). Личность энантиомера ранее сообщалось17. Для АА, однако, F87V BM3 мутант должен быть использован вместо этого в качестве дикого типа BM3 является гидроксилаза для AA21. Выражение и очищение этого мутанта также использует вышеуказанный протокол, и эпоксидация выполняется аналогичным образом. По этому методу, 14,15-EET получается в качестве единственного regioisomer. Поскольку 14,15-EET свободная кислота неотделима от неотреагированной АА после эпоксидации, этерификация необходима; 14,15-EET метиловый эфир получен в 52% урожайности от АА. Chiral HPLC (см. Рисунок 3 легенда и таблица материалов) кислоты указывает на высоко энантиочисты (Зgt;99%) 14(S), 15 (R)-EET (как сообщалось ранее)15. Химические сдвиги для этих метаболитов EPA и АА таковы: 17(S),18(R)-EE'метиловый эфир:1H-NMR (500 МГц; CDCl3: 5,53-5,34 (м, 8 Н), 3,67 (с, 3 Н), 2,96 (тд, J - 6,4, 4,2 Гц, 1 Нц), 2,90 (тд, J No 6,3, 4,2 Гц, 1 Н), 2,85-2,79 (м, 6 Н), 2,44-2,38 (м, 1 Н), 2,32 (т, J 7,5 Гц, 2 Hz), 2,26-2,20 м,1, 1, 2,32 (т, J 7,5 Гц, 2,2 Hz), 2,26-2,20 м, 1, 1, 2,32 (т, J 7,5 Гц, 2,2 Гц), 2,26-2,20 м, 1,20 м, 1, 1,32 (т, J 7,5 Гц, 2,2, 2,26-2,20 м, 1, 1, 1, 1, 2,32 (т, J - 7,5 Гц, 2,2 Гц), 2,26-2,20 м, 1,26-20 м, 1,20 м, 1,32 (т, J - 7,5 Гц, 2,2 Гц), 2,26-2,20 м, 1,26-20 м, 1,20 , 2,11 (кв, J - 6,7 Гц, 2 Н), 1,71 (квинтет, J - 7,4 Гц, 2 Н), 1,66-1,50 (м, 2 Н), 1,05 (т, J - 7,5 Гц, 3 Н); 14(S),15(R)-EETметил эфир: 1 H-NMR (500 МГц; CDCl3: 5,53-5,33 евро (м, 6 Н), 3,67 (с, 3 Н), 2,95-2,92 (м, 2 H), 2.81 (dt, J 17.8, 5.8 Hz, 4 H), 2.40 (dt, J - 14.1, 6.8 Hz, 1 H), 2.32 (t, J 7.5 Hz, 2 Hz), 2.23 (dt, J 14.1, 6.8 Hz, 1 Hz) , 2,11 (кв, J 6,8 Гц, 2 H), 1,71 (квинтет, J 7,4 Гц, 2 Hz), 1,56-1,41 (м, 4 H), 1,38-1,30 (м, 4 H), 0,90 (т, J 7,1 Гц, 3 Hz).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа финансируется R00 ES024806 (Национальные институты здравоохранения), DMS-1761320 (Национальный научный фонд) и стартап-фонды из Мичиганского государственного университета. Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Джун Яна (Калифорнийский университет в Дэвисе) и Лалиту Каршаллу (Мичиганский государственный университет) за помощь в оптимизации ферментативной реакции, и д-ра Тони Шилмиллера (МГУ Масс-спектрометрии и метаболомики) для помощи в получении данных HRMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
- Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
- Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
- Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211 (2016).
- Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
- Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
- Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).
- Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
- Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
- Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
- Khan, M. A., Wood, P. L. Method for the synthesis of DHA. , WO2012126088A1 (2012).
- Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
- Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
- Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
- Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
- Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
- Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
- Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
- Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019).
- Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).
