Summary
Dolioliden, met inbegrip van de soort Dolioletta gegenbauri, zijn kleine gelatineuze mariene zoöplankton van ecologische betekenis gevonden op productieve Subcontinentale plank systemen wereldwijd. De moeilijkheid van het kweken van deze delicate organismen beperkt hun onderzoek. In deze studie beschrijven we de teelt benaderingen voor het verzamelen, fokken en onderhouden van de doliolid Dolioletta gegenbauri.
Abstract
Gelatineuze zooplanktons spelen een cruciale rol in de oceaan ecosystemen. Het is echter over het algemeen moeilijk om hun fysiologie, groei, feconiteit en trofische interacties te onderzoeken, voornamelijk als gevolg van methodologische uitdagingen, waaronder het vermogen om ze te cultuur. Dit geldt met name voor de doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri komt vaak voor in productieve subtropische, continentale schapsystemen wereldwijd, vaak bij bloei concentraties die een grote fractie van de dagelijkse primaire productie kunnen consumeren. In deze studie beschrijven we de teelt benaderingen voor het verzamelen, fokken en onderhouden van D. gegenbauri met het oog op het uitvoeren van laboratorium studies. D. gegenbauri en andere doliolid soorten kunnen levend worden gevangen met behulp van schuin getrokken conische 202 μm mesh plankton netten van een drifting schip. Culturen worden het meest betrouwbaar vastgesteld wanneer de watertemperaturen lager zijn dan 21 °C en worden gestart vanuit onrijpe gonozooids, rijpende phorozooids en grote verpleegkundigen. Culturen kunnen worden gehandhaafd in afgeronde kweekvaten op een langzaam draaiend plankton wiel en gedurende vele generaties worden gesteund op een dieet van gekweekte algen in natuurlijk zeewater. Naast de mogelijkheid om laboratorium culturen van D. gegenbaurivast te stellen, tonen we aan dat de opvang toestand, algen concentratie, temperatuur en blootstelling aan natuurlijk geconditioneerd zeewater essentieel zijn voor de cultuur oprichting, groei, overleving en reproductie van D. gegenbauri.
Introduction
Zooplankton is voor de grootste dierlijke biomassa in de Oceaan, zijn belangrijke componenten in mariene voedsel webben, en spelen belangrijke rollen in de oceaan biogeochemische cycli1,2. Zooplankton, hoewel het bestaat uit een enorme diversiteit aan organismen, kan worden onderscheiden in twee categorieën: gelatineuze en niet-gelatineuze met weinig tussenliggende taxa3,4. In vergelijking met het niet-gelatineuze zoöplankton zijn gelatineuze zoöplankton bijzonder moeilijk te bestuderen vanwege hun complexe levens geschiedenissen5, en hun delicate weefsels zijn gemakkelijk beschadigd tijdens het vangen en hanteren. Gelatineuze zoöplankton soorten zijn daarom notoir moeilijk te kweken in het laboratorium en over het algemeen minder bestudeerd in vergelijking met niet-gelatineuze soorten6.
Onder gelatineuze zoöplankton groepen, een overvloedig en van ecologisch belang in de wereld Oceaan zijn de thalieeën. Thalieeën zijn een klasse van pelagische tunicaten, waaronder de bevelen Salpida, Pyrosomida en Doliolida7. Doliolida, gezamenlijk aangeduid als dolioliden, zijn kleine tonvormige vrij-zwemmen pelagische organismen die hoge Abundances kunnen bereiken in productieve neritische gebieden van subtropische oceanen. Dolioliden behoren tot de meest overvloedige van alle zoöplankton groepen4,8. Als suspensie feeders verzamelen dolioliden voedseldeeltjes uit de waterkolom door filter stromen te maken en ze op slijm Nets9te vangen. Taxonomisch zijn dolioliden ingedeeld in de stam Urochordata10. Voorouderlijke naar de chordates, en in aanvulling op hun ecologische betekenis als belangrijke componenten van mariene pelagische systemen, zijn de Thalieeën van belang voor het begrijpen van de oorsprong van de koloniale levensgeschiedenis10,11 en de evolutie van de chordates5,7,10,12,13,14.
De levensgeschiedenis van doliolids is complex en draagt bij aan de moeilijkheden bij het kweken en ondersteunen van hen door hun levenscyclus. In Godeaux et al.15vindt u een overzicht van de levenscyclus en anatomie van de doliolid. De doliolid levenscyclus, waarbij een verplichte afwisseling tussen seksuele en ongeslachtelijke levensgeschiedenis stadia, wordt weergegeven in Figuur 1. Eieren en sperma worden geproduceerd door de hermafrodiet gonozooids, de enige eenzame fase van de levenscyclus. Gonozooids geven sperma vrij aan de waterkolom en eieren zijn intern bevruchte en vrijkomen om zich te ontwikkelen tot larven. Larven en metamorfose in oozooids die 1-2 mm kunnen bereiken. veronderstelde gunstige milieuomstandigheden en voeding, oozooids worden vroege verpleegkundigen binnen 1-2 dagen bij 20 °C en initiëren de koloniale stadia van de levenscyclus. Oozooids produceren knoppen op hun ventrale stolon. Deze knoppen verlaten de stolonen en migreren naar de dorsale cadophore waar ze zich in drie gekoppelde rijen bevinden. De centrale dubbele rijen worden phorozooids en de buitenste twee dubbele rijen worden trophozooids. Deze laatste bieden voedsel aan zowel de verpleegkundige als de phorozooids16,17. De trophozooids leveren de verpleegkundige met voeding terwijl ze alle inwendige organen verliest. Naarmate de overvloed aan trophozooids toeneemt, kan de grootte van de verpleegkundige 15 mm in het laboratorium bereiken. Naarmate de phorozooids groeien, nemen ze steeds meer plankton prooi en bereiken ze ~ 1,5 mm in grootte voordat ze als individuen worden vrijgelaten17. Een enkele verpleegkundige kan > 100 phorozooids vrijgeven tijdens de levensduur18. Nadat de phorozooids uit de cadophore zijn vrijgelaten, blijven ze groeien en zijn ze de tweede koloniale fase van de levenscyclus. Zodra ze ~ 5 mm in grootte bereiken, ontwikkelt elke phorozooid een cluster van gonozooids op hun ventrale peduncle. Deze gonozooids kunnen deeltjes opnemen wanneer ze ~ 1 mm lang bereiken. Nadat de gonozooids hebben bereikt ~ 2 aan 3 mm in grootte ze worden vrijgelaten uit de phorozooid en uitgegroeid tot de enige eenzame fase van de levenscyclus. Zodra ze bereiken ~ 6 mm in grootte, gonozooids worden seksueel volwassen17. Gonozooids kunnen een lengte van 9 mm of meer bereiken. Gonozooids zijn hermaphroditic, sperma wordt met tussenpozen vrijgegeven terwijl de bevruchting van de eieren intern16,17plaatsvindt. Wanneer de gonozooid ≥ 6 mm groot is, brengt het tot 6 bevruchte eieren uit. Succesvolle kweek vereist ondersteuning van de specifieke behoeften van elk van deze unieke levensgeschiedenis stadia.
Vanwege de ecologische en evolutionaire betekenis van Thalieeën, waaronder doliolids, is er behoefte aan de teelt methodieken om het begrip van de unieke biologie, fysiologie, ecologie en evolutionaire geschiedenis van dit organisme te begrijpen19 . Doliolids hebben een aanzienlijke belofte als experimentele model organismen in de ontwikkelingsbiologie en functionele genomics omdat ze transparant zijn en waarschijnlijk hebben genomen genomen20,21. Het ontbreken van betrouwbare teeltmethoden belemmert echter hun nut als laboratorium modellen. Hoewel een handvol laboratoria resultaten hebben gepubliceerd op basis van gekweekte dolioliden, naar onze kennis teelt benaderingen en gedetailleerde protocollen zijn niet eerder gepubliceerd. Op basis van jarenlange ervaring, en trial and error teelt pogingen, het doel van deze studie was om ervaringen te beoordelen en te delen protocollen voor de verzameling en de teelt van doliolids, met name de soort Dolioletta gegenbauri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. het voorbereiden van kweek faciliteiten voor het fokken van D. gegenbauri
Opmerking: alle benodigde materialen en apparatuur worden vermeld in de tabel met materialen.
- Bereid 1 M natrium hydroxide (NaOH), 0,06 M kaliumpermanganaat (KMnO4) oplossing. Om deze oplossing voor te bereiden, Los 400 g NaOH op in 10 L gedeïoniseerd water. Voeg 100 g KMnO4 toe aan de NaOH-oplossing en meng goed.
- Bereid een 0,1 M natrium natriumbisulfiet (nahso3) oplossing door het oplossen van 100 g van nahso3 in 10 L gedeïoniseerd water en meng goed.
Let op: deze reagentia zijn irriterende stoffen die ademhalingsproblemen kunnen veroorzaken bij inademing. Plaats in een goed geventileerde ruimte, zoals een rook afzuigkap. Vermijd huidcontact. Draag beschermende handschoenen, beschermende kleding, oogbescherming en Gelaatsbescherming bij het hanteren. - Voor het oprichten en fokken van doliolid culturen in het laboratorium, schoon en steriliseren de kweek potten.
- Spoel 1,9 L en 3,8 L kweek potten minstens 3 keer met gedeïoniseerd water. Laat de schroefdoppen drogen, omdat de doppen niet in de volgende reinigingsstappen zijn opgenomen.
- Reinig en steriliseren 1,9-en 3,8 L glazen kweek potten door ze onder te dompelen in de NaOH/KMnO4 oplossing. Laat de potten 's nachts weken.
- Verwijder de potten uit de NaOH/kmno4 oplossing en dompel de potten onder in de natrium natriumbisulfiet (nahso3) oplossing. Laat de potten 's nachts weken.
- Verwijder de potten uit de NaHSO3 oplossing en Spoel grondig met gedeïoniseerd water. Laat de potten drogen.
- Plaats het plankton wiel (Figuur 2) in een temperatuurgeregelde ruimte (milieu kamer). Temperatuur tot 20 °C. Voor een meer gedetailleerde beschrijving van het Custom plankton wiel verwijzen wij u naar de aanvullende figuur 1.
2. fytoplankton cultuur
- Verkrijg algenculturen van het nationale centrum voor mariene algen en microbiota (NCMA) of andere bronnen om te worden gebruikt als voedsel voor D. gegenbauri. Mengsels van twee flagellaten soorten, waaronder Isochrysis Galbana (ccmp 1323), rhodomonas sp (CCMP 740), en een klein Diatoom, thalassiosira weissflogii (CCMP 1051) werden verkregen uit het NCMA en zijn gebruikt in eerdere laboratorium studies aan achterste doliolids met succes17.
- Bereid L1 en L1-si Growth media22 zoals aanbevolen door het NCMA.
- Volg de instructies van de leverancier om de nieuwe algenculturen te initiëren.
- Om de voorraadculturen te behouden, met behulp van strenge Axenische-cultuur technieken, zet u elke twee weken 0,5 mL oude senescing-cultuur over naar 25 mL verse groeimedia in steriele 55 mL glazen kweek buizen.
Opmerking: het is niet mogelijk om levende algenculturen op te slaan zonder ze regelmatig over te dragen. Als culturen niet voor langere tijd worden gebruikt en het niet mogelijk is om culturen gedurende de duur van de niet-gebruiksperiode te handhaven, is het aan te bevelen deze gemeenschappelijke algenculturen opnieuw te verwerven uit hun oorspronkelijke bronnen (bijv. NCMA). - Bereid grotere hoeveelheden fytoplankton voor het voeden van dolioliden in schone 500 mL kunststof weefselkweek kolven met 200 mL groeimedia.
- Inoculeren fytoplankton uit Axenische aandelen (4 mL) in 200 mL groeimedia (1:50 verdunning).
- Incuberen bij 20 °C met een 12:12 h licht: donkere cyclus onder koele witte licht verlichting van 65-85 μE/m2. Leg cultuur kolven plat om de verlichting te maximaliseren. De cultuur zachtjes dagelijks te zwenken.
- Bepaal de concentratie van cellen met behulp van een deeltjesteller of Microscoop om de groei van de culturen te bewaken.
Opmerking: na 7-10 dagen na inoculatie bevat de flagellaten culturen ~ 105-106 cellen/ml en de diatoom cultuur zal ~ 104-105 cellen/ml bevatten. Deze concentraties zijn voldoende om de doliolid culturen te behouden. - Start nieuwe voeder voorraden ten minste om de twee weken om voldoende algenbiomassa te leveren voor de ondersteuning van alle cultuur activiteiten.
3. verzameling van wilde dolioliden en zeewater voor cultuur
Opmerking: in Figuur 3wordt een overzicht gegeven van de inzamelings-en teelt benaderingen. Een beschrijving van de gespecialiseerde collectie plankton net en COD-end is te vinden in Figuur 4.
- Lokaliseer dolioliden door ze te detecteren met behulp van plankton netten of in situ Imaging Systems23.
Opmerking: omdat dolioliden zelden aanwezig zijn in oppervlaktewateren en niet detecteerbaar zijn door Remote Sensing Technology, geleid door de vereiste kennis van voorwaarden die gunstig zijn voor dolioliden (Zie discussie), moet de aanwezigheid van dolioliden worden bepaald voorafgaand aan de bemonstering. - Verzamel deeltjes rijk zeewater voorafgaand aan het verzamelen van levende dolioliden ter voorbereiding op het initiëren van een D. gegenbauri -cultuur.
- Implementeer Niskin-flessen gemonteerd op een CTD-rozet of gelijkwaardige apparatuur om water te verzamelen van de plaats waar dolioliden zich bevinden en van de diepte die de hoogste schattingen van chlorofyl bevat, een concentratie die wordt geschat door in-situ fluorometrie.
Opmerking: chlorofyl een concentratie wordt gebruikt als indicator van deeltjes concentraties. Op de Zuid-Atlantische bocht (SAB) mid-continentaal plat, de ondergrond chlorofyl een maximum is meestal dicht bij de bodem, maar op andere locaties, het kan niet.
- Implementeer Niskin-flessen gemonteerd op een CTD-rozet of gelijkwaardige apparatuur om water te verzamelen van de plaats waar dolioliden zich bevinden en van de diepte die de hoogste schattingen van chlorofyl bevat, een concentratie die wordt geschat door in-situ fluorometrie.
- Zodra doliolids zich bevinden, herstelt u onbeschadigde doliolid zoïden met behulp van het gespecialiseerde plankton net en COD-end. Voordat u het net implementeert, vult u het kabeljauw uiteinde met zeewater.
- Van een drifting schip, lager en verhoog het net door de waterkolom handhaven van een schuine Sleep hoek van ~ 15-25 ° en verticale implementatie en retrieval snelheid niet groter dan 15 m/min.
- Zodra het net aan boord is, breng en verdeel de inhoud van de kuil voorzichtig over in 3, 5 gallon (~ 20 L) plastic emmers met elk ~ 10 L oppervlakte zeewater dat van de site is verzameld.
Opmerking: nieuwe plastic emmers moeten worden geconditioneerd door de toevoeging van zeewater dagen voordat Living doliolid Collection. Het doel is om de uitspoeling van chemicaliën uit kunststof te verminderen. Als zeewater niet beschikbaar is, gebruik dan gezuiverde (bijv. milli Q) of kraanwater vrij van giftige verontreinigingen om de emmers te conditionen. - Isoleer doliolid zoïden van ander plankton.
- In kleine batches (~ 2 L) worden gemengde planktons van de netto Sleep inhoud (nu in plastic emmers van 20 liter) overgedragen naar een glazen beker van 2 liter.
- Met behulp van een glazen pipet met brede boring (8 mm id x 38 cm lengte), zorgvuldig sifon en overdracht actief zwemmen doliolid zoïden uit het bekerglas in schone glazen cultuur potten met deeltjes rijk zeewater verzameld met behulp van Niskin flessen van waar doliolids waren Gelegen.
- Laat de doliolid zoïden zachtjes onder het zeewater oppervlak los.
Opmerking: Verzamel gonozoöïden, phorozooids die bijgevoegde gonozooids bevatten, en verpleegkundige stadia met bijgevoegde trofozooïden (Figuur 1).
- Na de toevoeging van doliolids, Voeg Rhodomonas SP. cultuur aan een uiteindelijke concentratie van ~ 5 x 103 – 104 cellen/ml (~ 50 ml van een cultuur met ~ 5 x 104 – 1 x 105 cellen/ml in een pot 3,8 L). Dit is om te bepalen of de dolioliden actief voeden. Wanneer doliolids opnemen rhodomonas SP., hun spijsverteringskanaal zal verschijnen rood in kleur. Verwijder zoïden die niet lijken te voeden.
- Om te voorkomen dat dolioliden worden gevangen in de lucht-water-interface, Vermijd de headspace in de kweek potten door de potten volledig te vullen met ongefilterd deeltjes rijk zeewater en een stukje plastic wikkel over de jar opening te plaatsen (89 mm breed).
- Vermijd het maken van luchtbellen die ook de dieren kunnen beschadigen. Schroef de dop voorzichtig op de pot en keer de pot voorzichtig om om te bepalen of er bubbels aanwezig zijn. Als er bubbels aanwezig zijn, verwijder ze dan.
- Nadat potten zijn gevuld, veeg het overtollige water van de buitenkant van de pot.
- Monteer elke pot op het plankton wiel (Figuur 2) door de pot te plaatsen op de verticale metalen staven bedekt met rubberen buizen en tussen een RVS slangklem.
- Zorg ervoor dat de achterkant van de pot is gedempt tegen de rubberen slang. Draai de slangklem rond de pot door de schroef aan te passen.
- Controleer of de pot niet beweegt zodra deze stevig op zijn plaats is bevestigd. Laat de potten draaien bij 0,3 rpm om de doliolids in suspensie te houden.
Let op: het is belangrijk om de pot niet te strak te spannen om te voorkomen dat de pot kraken.
- Op het schip, houd de kweekvaten op het plankton wiel bij 20 °C in Dim licht tot ze kunnen worden overgebracht naar de laboratoriumcultuur faciliteit.
- Bij terugkeer naar het laboratorium, overdracht van de potten met doliolids in de voorbereide cultuur faciliteit. Monteer de potten op het plankton wiel (zie stap 3,8) en laat de potten doorgaan met roteren bij 0,3 rpm.
Opmerking: alle fokken van dolioliden in deze studie werd uitgevoerd bij 20 °C.
4. onderhouden van D. gegenbauri culturen
- Van het schip naar het lab, laat de dieren te acclimeren in de oorspronkelijke potten aan de laboratoriumomstandigheden voor 3 dagen.
- Tijdens de acclimatie periode gebruikt u een glazen pipet met brede boring om gedurende 3 dagen 10% van het water met ongefilterd deeltjes rijk zeewater van de verzamelplaats te wisselen.
- Houd verschillende gerust in de pot, maar verwijder alle andere zoöplankton, grote fecale pellets en grote geaggregeerde deeltjes die het filterapparaat van de doliolid kunnen verstoppen (mucus net). Als de cultuur bestaat uit vroege verpleegkundigen, houden een grote gonozooid (≥ 6 mm) in de pot.
Opmerking: het is niet belangrijk welke copepod-soorten zijn opgenomen in de cultuur, maar in dit experiment werd gebruik gemaakt van de meest voorkomende soorten die aanwezig waren van waar de dolioliden werden gevangen.
- Na de acclimatie periode, Transfer doliolid zoïden en gerust van de oorspronkelijke jar naar een schone kweek pot met 80% glasvezel filter (GF/F) gefilterd zeewater en 20% van het zeewater uit de oorspronkelijke pot. Bereid gefilterd zeewater door het filteren van zeewater door een GF/F met een nominale poriegrootte van 0,7 μm filtreerpapier.
- Behoud van de nieuwe cultuur door het uitwisselen van 10% van het water met GF/F gefilterd zeewater elke 3 dagen en door het verwijderen van aggregaten en fecale pellets. Wekelijks, breng dieren over naar een nieuwe pot zoals beschreven in stap 4,2.
- Voer dolioliden door het handhaven van fytoplankton concentraties in de kweek potten tussen 40-95 μg C/L.
NB: deze concentraties imiteren omgevingscondities waarvan bekend is dat ze de bloei voorwaarden voor D. gegenbauri17ondersteunen. Het mengsel van algensoorten varieert afhankelijk van de levensfase en het aantal zoïden in elke pot. In de vroege levensstadia, voeg 1:1 mengsel (door koolstofgehalte) van de cryptomonad algen (Isochrysis Galbana en rhodomonas SP.) alleen. Grotere prooi soorten kunnen gemakkelijk verstoppen het Voer apparaat van kleine verpleegkundigen en het ontwikkelen van trophozooids. Voeg de diatomeeën Thalassiosira weissflogii toe aan het algen mengsel, ook bij een gelijk koolstofgehalte, bij het voeden van grotere verpleegkundigen, phorozooids en gonozooids.- Bewaak de algen concentraties voor en na het voeden om de beslissing te begeleiden hoe vaak en hoeveel algen aan de culturen toe te voegen. Gebruik een deeltjesteller om algen concentraties te bepalen, omdat algen concentraties in de kweek potten relatief verdund zijn.
- Verwijder voldoende zoïden om de algen concentraties van 40 – 95 μgc/L te behouden, zodat de overgebleven dolioliden voldoende voedsel hebben om te groeien.
Opmerking: de meest moeilijke levensfase om succesvol te blijven onder laboratoriumomstandigheden is de ontwikkelende larven en oozooid (vroege verpleegster). Tijdens deze fase van de cultuur, houden een grote gonozooid (≥ 6 mm) naast verschillende gerust in de pot met het ontwikkelen van larven en oozooids (~ 20 per 3,8 L jar). - Breng ten minste 4 verpleegkundigen naar een nieuwe kweek pot zodra een minimum van 8 trophozooids zichtbaar is op de cadophore van de verpleegkundige (Figuur 1b).
Opmerking: Trophozooids zal elke 1 – 2 dagen bij 20 °C in aantal verdubbelen. Trophozooids zijn groot genoeg om zichtbaar te zijn voor het blote oog.- Verwijder twee van de verpleegkundigen zodra verpleegkundigen 20 trofozooids ontwikkelen.
- Verwijder één verpleegkundige wanneer de verpleegkundigen > 30 trophozooids op hun cadophores ontwikkelen. Laat de overblijvende verpleegkundige phorozooids ontwikkelen op zijn cadophore.
- Verwijder de verpleegkundige zodra de verpleegkundige 30 phorozooids afgeeft.
- Verminder het aantal dieren in de pot zodra de phorozooids 3 mm groot zijn.
- Verwijder alle maar vier phorozooids wanneer de phorozooids groter worden (> 5 mm) en hebben gonozooid clusters ontwikkeld.
- Verminder de cultuur tot twee phorozooids wanneer het aantal gonozooids clusters toenemen in grootte en beginnen te voeden.
- Verwijder de phorozooids zodra de phorozooids vrijkomen tot 30 gonozooids.
- Verminder het aantal gonozooids van 30 zoïden tot 2 per pot. Laat bevruchte eieren in de pot vrijkomen.
- Verwijder een gonozooid verlaten van een enkele gonozooid in de pot zodra de oozooids ontwikkelen.
Opmerking: afgedankte verpleegkundigen, phorozooids en gonozooids kunnen worden gebruikt om extra culturen te zaaien en verdere experimenten uit te voeren.
- Verwijder een gonozooid verlaten van een enkele gonozooid in de pot zodra de oozooids ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens de beschreven procedures voor het verzamelen en kweek van de doliolid, D. gegenbauri geschetst in Figuur 3, is het mogelijk om een cultuur van D. gegenbauri in zijn complexe levensgeschiedenis te behouden (Figuur 1) en het voor vele generaties ondersteunen. Hoewel de teelt van D. gegenbauri hier wordt beschreven, moeten deze procedures ook relevant zijn voor de teelt van andere doliolid soorten.
Het vastleggen van gezonde en onbeschadigde doliolid zoïden vereist de toepassing van gespecialiseerde netten en sleep procedures (Figuur 4). Als delicate dieren zonder harde structuren, moet men voorzichtig zijn om procedures te minimaliseren die kunnen resulteren in fysieke schade. Deze factoren kunnen omvatten turbulentie, druk, en interacties met oppervlakken met inbegrip van het net, lucht en luchtbellen. Ondanks hun delicate karakter kunnen onbeschadigde doliolid zoïden worden verzameld met behulp van een conische plankton net met een opening diameter tot lengte verhouding van 1:5 en uitgerust met een relatief grote gewogen niet-filtrerende COD-end. Routinematig hebben we gebruikt een 202 μm mesh 2,5 m (lengte) plankton net met een 0,5 m opening gemonteerd in een Swivel harnas en uitgerust met een 4 L gewogen non-filtering COD-end (Figuur 4). Hoewel het effect van plankton maaswijdte op de inname van doeleinden D. gegenbauri zoïden niet systematisch is onderzocht, theoretisch, kan het gebruik van een net met een grotere maaswijdte resulteren in verdere verbetering naarmate grotere maaswijdte Verminder het druk veld dat tijdens het slepen wordt gegenereerd. Als alternatief, grotere maaswijdte zal resulteren in een grotere waterstroom door het net, potentieel schadelijke doliolid zooids. Sleep snelheden en nethoek moeten worden geoptimaliseerd om de Sleep tijd en beschadiging tijdens het verzamelen te minimaliseren. In onze ervaring hebben we geconstateerd dat voldoende zachte sleep condities kunnen worden bereikt door het net schuin onder een hoek van 15-25 ° te slepen van een drifting schip met verticale inzet-en ophaal snelheden van niet meer dan 15 m/min. Om het net te oriënteren op de richting van de waterstroming, wordt het plankton net in een zwenk harnas gemonteerd. Het is meestal zo dat de verdeling van dolioliden in de waterkolom niet willekeurig is en over het algemeen het grootst is in de regio met de hoogste deeltjesbelastingen24. Daarom moet de waterkolom van onder het subopper vlak chlorofyl maximaal op het oppervlak worden bemonsterd. In de ondiepe SAB mid-continentaal plat (20-45 m), de waterkolom van ~ 1 m boven de bodem naar het oppervlak wordt bemonsterd.
Zodra gezonde zoïden zijn verzameld, is het van cruciaal belang om ze op een zodanige manier te onderhouden dat blootstelling aan oppervlakken tot een minimum wordt beperkt. Om ontmoetingen met oppervlakken te minimaliseren, worden dolioliden in afgeronde potten gevuld met zeewater gehouden en zachtjes op een langzaam draaiend plankton wiel tuimelde (Figuur 2).
Hoewel het theoretisch mogelijk is om een cultuur te beginnen met zoïden van elke levensfase, het verkennen van successen en mislukkingen bij het vestigen van nieuwe culturen van D. gegenbauri van 6 pogingen tussen 2015 – 2018 in de Zuid-Atlantische bocht suggereren dat succes wordt meestal bereikt wanneer zoïden worden verzameld uit wateren die < 21 ° c zijn, en wanneer andere levensstadia dan grote volwassen gonozooids worden gebruikt om een nieuwe cultuur te beginnen (tabel 1 en tabel 2). In de praktijk is het nuttig, of althans niet schadelijk, om meerdere levensstadia van doliolid zoïden op te nemen bij het initiëren van een nieuwe cultuur.
Succes in het ondersteunen van een cultuur van D. gegenbauri, zoals is beschreven voor andere pelagische tunicaatsoorten20, hangt af van het verstrekken van voldoende, maar niet overdreven, voedsel-en voedsel diversiteit die nodig is om elke levensfase te ondersteunen. Aangezien de dieeteisen gedurende de gehele levenscyclus variëren, moet de hoeveelheid algen die bij elke voedertijd wordt verstrekt, worden gevarieerd om de voedsel concentraties op de gewenste streefniveaus te houden (40 – 95 μg C/L) (tabel 3). Concentraties boven of onder deze niveaus kunnen resulteren in verhoogde sterftecijfers (G.A. Paffenhöfer pers. comm.). Hoewel het natuurlijke dieet van D. gegenbauri slecht begrepen blijft6, kunnen culturen worden gehandhaafd door relatief eenvoudige mengsels van gekweekte algen te leveren en procedures te volgen die uiteenlopende microbiële gemeenschappen in staat stellen om in de cultuur. Het vergroten van de potentiële diversiteit van het prooi veld wordt bereikt door het vasthouden van een fractie van beladen-water uit oudere culturen en het opnemen van een klein aantal levende copepoden en grote dolioliden bij elke water verandering of overdracht. Vermoedelijk verwerken deze organismen algen en detrital materiaal en dienen ze om de deeltjesgrootte en het kwaliteits spectrum te diversifiëren dat beschikbaar is voor doliolid Nutrition, maar er zijn aanvullende studies nodig om deze hypothese te bevestigen.
De beschikbaarheid van doliolid culturen biedt de middelen om te onderzoeken, onder gecontroleerde experimentele omstandigheden, vele belangrijke aspecten van doliolid biologie, fysiologie, ecologie, en moleculaire biologie. Bijvoorbeeld, hoewel dolioliden overvloedig in tal van regio's van de kust Oceaan en zijn grote plankton grazers25, gegevens over de tarieven van voeding en groei blijven schaars26. Met behulp van culturen van D. gegenbauri, is een focus van op cultuur gebaseerd onderzoek geweest om de toevoer-en groeipercentages te kwantificeren in reactie op kritieke milieuparameters, waaronder temperatuur-en voedsel concentraties26. De resultaten van deze studies hebben aangetoond dat de klaring percentages vergelijkbaar zijn bij concentraties van 20 tot 60 μg C/L en afnemen naarmate de voedsel concentraties toenemen (figuur 5a). De klaring stijgt proportioneel over de temperatuurbereiken die de groei van D. gegenbauri ondersteunen (Figuur 5b). Groeipercentages (k) variëren van 0,1 – 0,7/dag als functie van temperatuur en beschikbaarheid van voedsel (Figuur 6). Deze studies, naast het verstrekken van praktische informatie voor het kweken, hebben de bepaling van kwantitatieve relaties tussen doliolid voeding en groeipercentages als een functie van omgevingsparameters toegestaan en bieden kritische inzichten in de biologie en ecologie van doliolids die nodig zijn voor het opnemen van deze belangrijke zoöplankton groep in modellerings kaders27.
Figuur 1: de levenscyclus van D. gegenbauri bij 20 °c.
De levenscyclus tekening (1A) is gewijzigd na Walters et al. 20186 en opnieuw getekend met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: plankton wiel gebruikt voor cultuur D. gegenbauri. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Schematisch overzicht van D. gegenbauri collectie en teelt aanpak.
Inzameling op zee (A), overbrenging van geconcentreerde emmers naar klein glazen bekerglas in kleine batches (B), isolatie van doliolid zoïden in kweek potten met deeltjes rijk zeewater (C), onderhoud aan het plankton wiel gedurende de gehele levenscyclus (D, E). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: plankton net en implementatie.
Implementatie (linksboven), ophalen (rechtsboven) en schematisch van net en COD-einde (onder). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: algal-klarings percentages van D. gegenbauri gonozooids.
A) de verhouding tussen (a) gemiddelde (± s) klaring (ml/zooid/dag) versus fytoplankton concentratie (μg C/L) voor drie maten van D. gegenbauri gonozooids. Elk punt vertegenwoordigt 4 – 11 observaties. B) gemiddelde klaring (±s) (ml/zooid/dag) versus temperatuur (°c) voor de drie maten van D. gegenbauri gonozooids. Elk punt vertegenwoordigt 4 – 12 observaties. Gonozooids maten zijn 2,5 mm (
), 4,5 mm (
), en 6,5 mm (
). Cijfers zijn opnieuw getekend met toestemming26. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: groeipercentages van D. gegenbauri gonozooid.
Relatie tussen (a) gemiddelde (± s) groeipercentages (k) versus fytoplankton concentratie (μg C/L) voor drie maten dolioletta gegenbauri gonozooids. Elk punt vertegenwoordigt 4 – 11 observaties. B) gemiddelde (± s) groeipercentages (k) versus temperatuur (°c) voor drie maten dolioletta gegenbauri gonozooids. Elk punt vertegenwoordigt 4 – 12 observaties. Gonozooids maten zijn 2,5 mm (), 4,5 mm (), en 6,5 mm (). De cijfers zijn opnieuw getekend met toestemming van Gibson en Paffenhöfer26. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Tabel 1. Oceanografische condities en de overvloed aan Doliolid | |||||||||||
| Oppervlak | Onder | Oppervlak | Onder | Oppervlak | Onder | Doliolid overvloed | |||||
| Datum | Cruise-ID | Latitude (N) | Lengtegraad (W) | Diepte (m) | Temperatuur (⁰ C) | Temperatuur (⁰ C) | Zoutgehalte (PSU) | Zoutgehalte (PSU) | CHLA (μg/L) | CHLA (μg/L) | zooids/M3 |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | 31,1889 | 80,1527 | 41,30 | 25,26 | 22,43 | 33,58 | 36,96 | NA | 0,20 | NA |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | 29,5687 | 80,3269 | 40,00 | 26,40 | 21,75 | 36,26 | 36,32 | 1,04 | 1,35 | 218 |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | 31,1674 | 80,1249 | 40,80 | 23,24 | 22,60 | 35,91 | 35,81 | 1,06 | 1,70 | 13 |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | 31,2139 | 80,1823 | 41,00 | 18,72 | 18,84 | 36,00 | 36,12 | 0,83 | 1,50 | 3 |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | 31,2144 | 80,1822 | 42,00 | 24,19 | 23,85 | 36,00 | 36,04 | 0,63 | 1,30 | 254 |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | 31,1835 | 80,1466 | 43,00 | 16,85 | 16,45 | 36,50 | 36,48 | 0,56 | 0,89 | NA |
| NB: gegevens niet beschikbaar | |||||||||||
Tabel 1: oceanografische condities en de overvloed aan doliolid op de Zuid-Atlantische bocht midden-continentaal plat op het moment en de locatie waar D. gegenbauri zoïden werden verzameld en gebruikt om nieuwe culturen te initiëren.
| Tabel 2. Resultaten van D. gegenbauri culturing pogingen | ||||
| Datum | Cruise-ID | Zooids verzameld | Resultaat | Opmerkingen |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | Seksueel volwassen grote (6-7 mm) gonozooids | Mislukt | Alle gonozooids waren gestorven na 4 dagen. Oozooid en vroege verpleegkundige levensstadia werden geproduceerd, maar het lukte niet om te gedijen. |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | Seksueel volwassen grote (8-10 mm) gonozooids | Mislukt | Gonozooids stierf kort na de collectie. Oozooids en vroege verpleegkundigen werden geproduceerd, maar niet gedijen. |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | Gemengde collectie inclusief late verpleegkundige (4-5 mm) met bijgevoegde trophozooids, seksueel volwassen grote (6 mm) gonozooids en oozooids (2 mm) | Succesvolle | Gekweekt voor 4 volle generaties, extra gonozooids en verpleegkundigen verzameld in januari en maart 2016 werden toegevoegd aan de cultuur. Laboratorium werd gedurende 4 dagen geëvacueerd tijdens de orkaan Matthew in oktober 2016 en de cultuur overleefde niet. |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | Gemengde verzameling inclusief gonozooids (1,5-5 mm) en grote phorozooids (6 mm) met bijgevoegde gonozooid clusters | Succesvolle | Gecultiveerde voor 4 volle generaties, extra gonozooids verzameld in april 2017 werden toegevoegd aan de cultuur. Beëindigde cultuur in september 2017 op voorhand van orkaan Irma. |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | Gonozooids (3-6 mm) | Mislukt | Grote gonozooid stierf na 1 dag. De onrijpe gonozooid overleefde in de cultuur gedurende 14 dagen. Eieren werden door beide gonozooids vrijgegeven. Oozooids werden geproduceerd, maar konden niet uitgroeien tot verpleegkundige stadia. Cultuur is mislukt na 1 maand. |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | Grote (6-7 mm) late verpleegster zonder trophozooids | Succesvolle | In cultuur produceerde de verpleegster trophozooids. De cultuur werd 3 generaties lang gehandhaafd en werd eind juni 2018 beëindigd toen er experimenten werden afgesloten. |
Tabel 2: resultaat van pogingen om laboratorium culturen van D. gegenbauri verzameld van de Zuid-Atlantische Bight mid-continentaal plat.
| Dolioletta gegenbauri | zooid-nummer per | zooid-nummer per | |||
| levensfase | 3,9 L jar | 1,9 L jar | Isochrysis Galbana | Rhodomonas SP. | Thalassiosira weissflogii |
| oozooid | 20 | 10 | OMVATTEN | OMVATTEN | BEVATTEN GEEN |
| vroege verpleegster | 20 | 10 | OMVATTEN | OMVATTEN | BEVATTEN GEEN |
| late verpleegster met 8 trophozooids | 4 | 2 | OMVATTEN | OMVATTEN | OMVATTEN |
| late verpleegster met 20 trophozooids | 2 | 1 | OMVATTEN | OMVATTEN | OMVATTEN |
| late verpleegster met 30 trophozooids | 1 | 1 | OMVATTEN | OMVATTEN | OMVATTEN |
| phorozooid (1 tot 3 mm) | 30 | 15 | OMVATTEN | OMVATTEN | OMVATTEN |
| phorozooid gonozooid cluster (> 5 mm) | 2 | 1 | OMVATTEN | OMVATTEN | OMVATTEN |
| gonozooid (1 tot 3 mm) | 30 | 15 | OMVATTEN | OMVATTEN | OMVATTEN |
| gonozooid (> 5 mm) | 2 | 1 | OMVATTEN | OMVATTEN | OMVATTEN |
| De doel concentraties van algen dienen te worden gehandhaafd tussen 40-95 μg C/L met gelijke mengsels (door koolstofgehalte) van elke algensoort | |||||
Tabel 3: doel kweekomstandigheden voor elke D. gegenbauri levenscyclus fase.
Aanvullend figuur 1: gedetailleerde beschrijving van het Custom plankton wiel. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het vermogen tot cultuur doliolids is in de afgelopen decennia vastgesteld en is gebruikt om onderzoek op verschillende gebieden te ondersteunen. Experimentele studies in onze laboratoria hebben de publicatie ondersteund van ten minste 15 wetenschappelijke studies gericht op de voeding en groei18,26, reproductie18,28, dieet6, 29, fysiologie30, ecologie31, en ecologische modellering27 van doliolids.
Hoewel de cultuur van deze delicate dieren momenteel arbeidsintensieve en tijdrovend is, is de teelt van dolioliden haalbaar en, indien uitgevoerd door de bredere gemeenschap, zal de vooruitgang van het begrip van dit ecologisch en evolutionair belangrijke groep van dieren. Het doel van deze studie was om de huidige benaderingen voor het verzamelen, fokken en onderhouden van D. gegenbauri in cultuur te beschrijven met het oog op het uitvoeren van laboratorium studies.
De oprichting van een doliolid cultuur vereist het verzamelen van gezonde en onbeschadigde dieren en, eenmaal gevangen, zachte behandeling, passende voeding, en veeteelt. Dolioliden, in het bijzonder de soort D. gegenbauri, gebeurt globaal op subtropische continentale planken, maar overvloed kan zeer variabel zijn. Bijvoorbeeld, in een recente studie gericht op de mid-shelf regio van de SAB, hoewel de overvloed dramatisch varieerde van < 1/m3 tot > 20000/m3, doliolids waren aanwezig gedurende het jaar6. Vanwege de hoge variabiliteit van dolioliden in de ruimte en tijd en de relatieve moeilijkheden die betrokken zijn bij het bemonsteren van continentale schapmarge omgevingen, is betrouwbare kennis van doliolid Community Dynamics waar studies worden uitgevoerd een belangrijke voorwaarde voor de succesvolle oprichting van de cultuur.
Zodra doliolid zoïden zijn gevestigd en gevangen, kan het moeilijk zijn om te bepalen of de dieren zijn beschadigd. Dieren kunnen lijken te zijn onbeschadigd en vertonen actief zwemmen en ontsnappen gedrag, maar zelfs de kleinste verwonding kan resulteren in hun onvermogen om te gedijen. Een kenmerk dat vooral relevant is voor de beoordeling van de gezondheid van gevangen doliolid zoïden is hun vermogen om te voeden. De toevoer activiteit kan eenvoudig worden beoordeeld door het verstrekken van gepigmenteerde algen aan vers gevangen dieren. Als een dier voedt, zal de darm binnen korte tijd gekleurd worden. In onze ervaring hebben we ontdekt dat het toevoegen van een kleine hoeveelheid van de rode gepigmenteerde algen, Rhodomonas SP., snel informatie geeft over het voeren van de activiteit. Als het voederen niet wordt nageleefd, is het hoogst onwaarschijnlijk dat er een cultuur kan worden vastgesteld.
Waakzaamheid en goede veehouderij zijn cruciaal voor het vestigen en ondersteunen van dolioliden gedurende hun complexe levenscyclus. Misschien wel de meest problematische fase is de ontwikkeling van een levensvatbare verpleegkundige uit de larvale fase en de productie (spruiten) van de voedende trophoozoïden. In deze levensfase speculeren we dat de voedselbehoefte, met betrekking tot kwantiteit, kwaliteit en deeltjesgrootte het meest beperkt is. Voor onze kennis zijn er geen eerdere studies geweest die de voedings activiteit van D. gegenbauri larven en oozooids hebben onderzocht. Bijvoorbeeld, hoewel de ontwikkelende gonozooids en phorozooids in staat zijn om deeltjes te nemen over een breed scala van maten, de capaciteit van larven, oozooids, en kleine verpleegkundigen is waarschijnlijk beperkter. In de praktijk vinden we dat succesvolle teelt in deze levensfasen kan worden bereikt door diatomen uit het algen voedsel mengsel te weglaten, door voedsel concentraties op gematigde niveaus te handhaven, door frequente voedingen in lagere concentraties te voeren, door een enkele grotere gonozooid en een paar gerust met de cultuur, en door het handmatig verwijderen van grote aggregaten van detritus.
Hoewel we culturen van D. gegenbauri hebben onderhouden voor meerdere generaties afkomstig uit een enkele verzameling, indien mogelijk, vullen we routinematig bestaande culturen aan met vers verzamelde dieren om de genetische diversiteit en robuustheid te vergroten van de cultuur. Een potentieel gevaar van deze praktijk is de introductie van parasieten of ziekten in de cultuur, maar voor onze kennis hebben we dit probleem nooit ondervonden. Hoewel er weinig meldingen van parasieten van doliolids32, ongetwijfeld, ze bestaan. Interessant, in een recente studie vergelijken van het dieet van gekweekte D. gegenbauri gonozooids blootgesteld aan natuurlijke wateren met veld-gevangen D. gegenbauri gonozooids, vermoedelijke Apicomplexa parasieten werden gedetecteerd in de wilde populatie die werden afwezig in de gekweekte dieren6.
Een bestaande beperking van de beschreven cultuur technologie is de beperking van het productievolume van zooid. Vooral omdat de beschreven technieken de teelt in verzegelde potten met lage dichtheden op een draaiend plankton wiel betreffen, is het onduidelijk of deze aanpak opgeschaald zou kunnen worden of dat de werkstroom voor automatisering vatbaar zou zijn. Grotere schaal teeltsystemen, echter, voor een andere delicate kleine gelatineuze mariene zoöplankton soorten, de larvacean oikopleura dioica, zijn beschreven20,33,34, wat suggereert dat het kan mogelijk om in de toekomst soortgelijke systemen voor doliolids te ontwerpen. Echter, de complexe levensgeschiedenis van D. gegenbauri in vergelijking met de eenvoudigere levensgeschiedenis van O. dioica zal een belangrijke uitdaging voor grootschalige teelt blijven.
Concluderend, volgens de hier beschreven protocollen, kan D. gegenbauri op betrouwbare wijze worden gekweekt onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden gedurende zijn complexe levensgeschiedenis. Deze capaciteit maakt de soorten vatbaar voor een verscheidenheid aan gecontroleerde experimentele studies, en misschien om dolioliden te ontwikkelen als een nieuw diermodel in Ontwikkelingsbiologie en evolutie. Beperkingen van de productieschaal zullen echter moeten worden overwonnen voordat dit doel kan worden bereikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te verklaren.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de vele personen die in de loop der jaren opgebouwde kennis hebben bijgedragen aan dit project, waaronder G.-A. Paffenhöfer en D. Deibel die deze protocollen oorspronkelijk ontwikkelden. M. Köster en L. Lamboley hebben ook een aanzienlijke bijdrage geleverd aan de ontwikkeling van deze procedures. N.B. López-Figueroa en Á.E. Rodríguez-Santiago genereerden de schattingen van de overvloed aan doliolid in tabel 1. Deze studie werd deels gesteund door de US National Science Foundation Awards OCE 082599, 1031263 tot MEF, collaboratieve projecten OCE 1459293 en OCE 14595010 naar MEF en DMG en, de National Oceanic and atmosferische Administration Award NA16SEC4810007 to DMG. We zijn dankbaar voor de hardwerkende en professionele bemanning van de R/V Savannah. Lee Ann deleo bereidde de figuren voor, Charles Y. Robertson Review het manuscript en James (Jimmy) Williams vervaardigde het plankton wiel
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
References
- Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
- Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
- Kiorboe, T.
- Holland, L. Z.
- Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , Special Issue: Species Interactions, Ecological Networks and Community Dynamics (2018).
- Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
- Acuña, J. L.
- Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
- Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
- Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
- Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P.
- Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 1-24 (1998).
- Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).
- Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
- Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
- Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean's minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).
- Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
- Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).
- Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
- Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
- Deibel, D. The biology of pelagic tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 171-186 (1998).
- Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
- Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
- Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
- Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7 (2014).
- Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
- Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
- Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).
