Summary
Долиолиды, в том числе вид Dolioletta gegenbauri,являются небольшими желатиновым морским зоопланктоном экологического значения, встречаемым на продуктивных субконтинентальных шельфовых системах по всему миру. Трудность культивирования этих деликатных организмов ограничивает их исследование. В этом исследовании мы описываем подходы к выращиванию для сбора, выращивания и поддержания долиолетта гегенбаури.
Abstract
Гелатиновские зоопланктоны играют решающую роль в океанских экосистемах. Тем не менее, как правило, трудно исследовать их физиологии, роста, плодовитости и трофических взаимодействий в первую очередь из-за методологических проблем, в том числе способность к их культуре. Это особенно верно для долиолида, Долиолетта гегенбаури. D. gegenbauri обычно встречается в продуктивных субтропических континентальных системах шельфа во всем мире, часто при концентрациях цветения, способных потреблять большую часть суточной первичной продукции. В этом исследовании мы описываем подходы к выращиванию для сбора, выращивания и поддержания D. gegenbauri с целью проведения лабораторных исследований. D. gegenbauri и другие виды doliolid могут быть захвачены жить с помощью косо буксусированных конических 202 мкм сетки планктона сетей с дрейфующего судна. Культуры наиболее надежно устанавливаются, когда температура воды ниже 21 градусов по Цельсию и начинается с незрелых гонозооидов, созревания phorozooids, и большие медсестры. Культуры могут поддерживаться в округлых сосудах культуры на медленно вращающемся колесе планктона и поддерживаться на диете культивированных водорослей в естественной морской воде на протяжении многих поколений. В дополнение к способности устанавливать лабораторные культуры D. gegenbauri, мы демонстрируем, что состояние сбора, концентрация водорослей, температура и воздействие естественно обусловленной морской воды имеют решающее значение для культуры создание, рост, выживание и размножение D. gegenbauri.
Introduction
Зоопланктон приходится на крупнейших животных биомассы в океане, являются ключевыми компонентами в морских пищевых сетей, и играют важную роль в океане биогеохимических циклов1,2. Зоопланктон, хотя и состоит из огромного разнообразия организмов, можно сильно различать на две категории: желатиновые и нежелатинские с несколькими промежуточными таксонами3,4. По сравнению с нежелатиновым зоопланктоном, желатиновый зоопланктон особеннотрудно изучать из-за их сложной истории жизни 5, и их тонкие ткани легко повреждаются во время захвата и обработки. Gelatinous зоопланктона видов, поэтому, как известно, трудно культуры в лаборатории и в целом менее изучены по сравнению с не-желатиновых видов6.
Среди желатиновых групп зоопланктона, один обильные и экологического значения в мировом океане являются thaliaceans. Талицеаны являются классом пелагических туникатов, которые включают в себя заказы Салпида, Пиросомида, и Долиолида7. Долилида, которую в совокупности называют долиолидами, представляют собой небольшие бочкообразные пелагические организмы, которые могут достигать высокого изобилия в продуктивных неритических регионах субтропических океанов. Долиолиды являются одними из самых распространенных из всех групп зоопланктона4,8. В качестве подвесных фидеров, долиолиды собирают частицы пищи из столбцаводы, создавая фильтровальных токов и захватывая их на слизистых сетях 9. Таксономически, долиолиды классифицируются в phylum Urochordata10. Предки хордатов, и в дополнение к их экологической значимости в качестве ключевых компонентов морских пелагических систем, thaliaceans имеют значение для понимания истоков колониальной истории жизни10,11 и эволюции из хордатов5,7,10,12,13,14.
История жизни долиолидов сложна и вносит свой вклад в трудности в культивирования и поддержания их в течение их жизненного цикла. Обзор полиолид жизненного цикла и анатомии можно найти в Godeaux и др.15. Это долиолидный жизненный цикл, который включает в себя обязательное чередование между сексуальными и бесполыми этапами истории жизни, представлен на рисунке 1. Яйца и сперматозоиды производятся гермафродическими гонозооидами, единственным одиночным этапом жизненного цикла. Gonozooids релиз спермы в колонку воды и яйца внутренне оплодотворены и выпущены развиваться в личинки. Личинки люк и метаморфозы в oozooids, которые могут достигать 1-2 мм. Предполагая благоприятные условия окружающей среды и питания, ooooids стать ранними медсестрами в течение 1-2 дней при 20 градусах Цельсия и инициировать колониальные этапы жизненного цикла. Oozooids бесполым веществом производят почки на их вентральном толоне. Эти почки оставляют столоон и мигрируют в дорсаловый кадофор, где они выстраиваются в три парных ряда. Центральные двойные ряды становят phorozooids и внешние 2 двойных ряда будут trophozooids. Последние обеспечивают питанием как медсестры, так и phorozooids16,17. Трофозуиды снабжают медсестру питанием, так как она теряет все внутренние органы. По мере увеличения численности трофозуидов размер медсестры может достигать 15 мм в лаборатории. По мере того как phorozooids растут, они все больше и больше гладают добычу планктона и достигают й 1.5 мм в размере до быть выпущенным как индивидуалы17. Одна медсестра может выпустить 100 phorozooids в течение своей жизни18. После того, как phorozooids высвобождаются из кадофора, они продолжают расти и являются вторым колониальным этапом жизненного цикла. Как только они достигают 5 мм в размерах, каждый phorozooid развивается кластер gonozooids на их брюшной peduncle. Эти гонозуиды могут глотать частицы, когда они достигают 1 мм в длину. После того, как гонозовиды достигли от 2 до 3 мм в размерах, они высвобождаются из phorozooid и становятся единственной одиночной стадией жизненного цикла. Как только они достигают 6 мм в размерах, gonozooids становятся сексуально зрелыми17. Гонозуиды могут достигать 9 мм и больше в длину. Гонозооиды гермафродические, сперма высвобождается с перерывами, в то время как оплодотворение яйцеклеток происходит внутренне16,17. Когда размер гонозооида составляет 6 мм, он высвобождает до 6 оплодотворенных яйцеклеток. Успешная культивирование требует поддержки конкретных потребностей каждого из этих уникальных этапов истории жизни.
В связи с экологическим и эволюционным значением талицей, в том числе долиолидов, существует необходимость в методах выращивания для продвижения понимания уникальной биологии этого организма, физиологии, экологии и эволюционной истории19 . Долиолиды имеют значительные перспективы в качестве экспериментальных моделей организмов в биологии развития и функциональной геномики, потому что они прозрачны и, вероятно, оптимизированы геномы20,21. Однако отсутствие надежных методов культивирования препятствует их полезности в качестве лабораторных моделей. Хотя несколько лабораторий опубликовали результаты, основанные на культивированных долиолидах, к нашим знаниям подходы к выращиванию и подробные протоколы ранее не публиковались. Основываясь на многолетнем опыте, и проб и ошибок попыток культивирования, цель этого исследования заключается в обзоре опыта и обмена протоколами для сбора и выращивания долиодов, в частности, вид Dolioletta gegenbauri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка культивирующих сооружений для выращивания D. gegenbauri
ПРИМЕЧАНИЕ: Все необходимые материалы и оборудование перечислены в таблицематериалов.
- Приготовьте 1 M Гидроксид натрия (NaOH), 0.06 MПерманганат калия (KMnO 4) раствор. Чтобы подготовить этот раствор, растворите 400 г NaOH в 10 л деионизированной воды. Добавьте 100 г KMnO4 в раствор NaOH и хорошо перемешайте.
- Подготовьте раствор бисульфита натрия0,1 М (NaHSO 3) путем растворения 100 г NaHSO3 на 10 л деионизированной воды и хорошо перемешайте.
ВНИМАНИЕ: Эти реагенты являются раздражителями, которые могут вызвать проблемы с дыханием при вдыхании. Поместите в хорошо проветриваемую область, такую как дымовой капот. Избегайте контакта с кожей. Носите защитные перчатки, защитную одежду, защиту глаз и защиту лица при обращении. - Перед созданием и воспитанием долилидовых культур в лаборатории очистите и стерилизуют культурные банки.
- Промыть 1,9 л и 3,8 л культуры банки по крайней мере 3 раза с деионизированной водой. Дайте крышкам винта высохнуть, так как колпачки не включены в следующие шаги очистки.
- Очистите и стерилизуйте 1,9- и 3,8 л стеклянных культуры банки, погрузив их в решение NaOH/KMnO 4. Разрешить банки, чтобы замочить на ночь.
- Удалите банки из раствора NaOH/KMnO4 и погрузите банки в раствор натрия (NaHSO3). Разрешить банки, чтобы замочить на ночь.
- Удалите банки из раствора NaHSO3 и тщательно промыть деионированной водой. Дайте банкам высохнуть.
- Поместите колесо планктона(рисунок 2) в контролируемое температурой пространство (экологическая камера). Уравновесите температуру до 20 градусов по Цельсию. Для более подробного описания пользовательского колеса планктона, пожалуйста, обратитесь к дополнительной рисунок 1.
2. Фитопланктона культуры
- Получить водорослей культур из Национального центра морских водорослей и микробиоты (NCMA) или других источников, которые будут использоваться в качестве пищи для D. gegenbauri. Смеси двух видов flagellate, включая Isochrysis galbana (CCMP 1323), Rhodomonas sp (CCMP 740) и небольшой диатом, Thalassiosira weissflogii (CCMP 1051) были получены из NCMA и были использованы в предыдущей лаборатории исследования для задних долиодов успешно17.
- Подготовьте L1 и L1-Si рост сми22 в соответствии с рекомендациями NCMA.
- Следуйте инструкциям, предоставленным поставщиком для инициирования новых культур водорослей.
- Для поддержания фондовых культур, используя строгие методы острого культуры, передача 0,5 мл старой чувствительной культуры до 25 мл свежих носителей роста в стерильных 55 мл стеклянных культурных труб каждые две недели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Невозможно хранить живые водоросли культур без передачи их регулярно. Если культуры не будут использоваться в течение длительного времени, и не представляется возможным поддерживать культуры в течение периода неиспользования, рекомендуется повторно приобрести эти общие водоросли культур из своих первоначальных источников (например, NCMA). - Подготовьте большие объемы фитопланктона для кормления долиолидами в чистых флягах культуры пластиковой ткани 500 мл, содержащем 200 мл растущих носителей.
- Прививать фитопланктон из апорных запасов (4 мл) в 200 мл роста носителей (1:50 разбавления).
- Инкубировать при 20 градусах Цельсия при освещении 12:12 ч:темный цикл при прохладном белом освещении 65-85 зЭ/м2. Lay культуры фляги плоские, чтобы максимизировать освещение. Аккуратно вихревой культуры ежедневно.
- Определите концентрацию клеток с помощью счетчика частиц или микроскопа для мониторинга роста культур.
ПРИМЕЧАНИЕ: После 7-10 дней с прививки, флагелировать культуры будет содержать 105-106 клеток / мл и диатома культуры будет содержать 104-105 клеток / мл. Эти концентрации достаточны для поддержания долиолидных культур. - Инициировать новые запасы питания как минимум каждые две недели, чтобы обеспечить достаточное количество водорослей биомассы для поддержки всех культурных мероприятий.
3. Коллекция диких долиолидов и морской воды для культуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор подходов к сбору и культивированию изложен на рисунке 3. Описание специализированной коллекции планктона сетки и трески конца приводится в рисунке 4.
- Найдите долиолиды, обнаруживая их с помощью либо планктонных сетей, либо в системах визуализации situ23.
ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что долиолиды редко присутствуют в поверхностных водах и не обнаруживаются с помощью технологии дистанционного зондирования, руководствуясь предварительным знанием условий, благоприятных для долиолидов (см. Обсуждение), наличие долиолидов должно быть определено до отбора проб. - Собирайте богатую частицами морскую воду до сбора живых долиолидов в рамках подготовки к исводу культуры D. gegenbauri.
- Развертывание бутылки Niskin установлен на розетку CTD или эквивалентное оборудование для сбора воды из места, где doliolids расположены и из глубины, содержащей самые высокие оценки хлорофилла концентрации оценивается в ситу фторрометрии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация хлорофилла используется в качестве индикатора концентрации частиц. На среднеконтинентальном шельфе южной Атлантики (SAB) подповерхностный хлорофилл максимум, как правило, близок к дну, но в других местах его может и не быть.
- Развертывание бутылки Niskin установлен на розетку CTD или эквивалентное оборудование для сбора воды из места, где doliolids расположены и из глубины, содержащей самые высокие оценки хлорофилла концентрации оценивается в ситу фторрометрии.
- После того, как долиолиды расположены, восстановить неповрежденные долилид зооиды с помощью специализированных планктона сети и трески конца. Перед развертыванием сети заполните треску морской водой.
- С дрейфующего судна опустите и поднимите сетку через водяную колонку, поддерживающую наклон наклона буксировки от 15 до 25 евро и вертикальное развертывание и скорость поиска не более 15 м/мин.
- После того, как сеть на борту, аккуратно передать и разделить содержимое трески конца на 3, 5-галлон (No 20 L) пластиковые ведра каждый, содержащий 10 л поверхностной морской воды, собранной с сайта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Новые пластиковые ведра должны быть обусловлены добавлением морской воды дней до жизни долиолид коллекции. Цель состоит в том, чтобы уменьшить выщелачивание химических веществ из пластика. Если морская вода отсутствует, используйте очищенную (например, Милли) или водопроводную воду, свободную от токсичных загрязняющих веществ, чтобы обусловливать ведра. - Изолятный долиолид зооиды из других планктона.
- Небольшими партиями (2 л) перенесите смешанные планктоны из содержимого сетчатого буксира (теперь в 20 л пластиковых ведер) в стеклянный стакан объемом 2 л.
- Используя широкорые стеклянные пипетки (8 мм ID x 38 см длиной), тщательно сифон и передачи активно плавание долиолид зооидов из стакана в чистые стеклянные культуры банки, содержащие богатые частицами морской воды, собранные с помощью бутылки Нискин, откуда были долиоиды были Расположен.
- Аккуратно отпустите долилидные зооиды под поверхностью морской воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Собирать гонозооиды, phorozooids, содержащие прилагается развивающихся gonozooids, и медсестра этапов, содержащих прилагается трофозуиды (Рисунок 1).
- После добавления долиолидов, добавьте культуру Rhodomonas sp. к окончательной концентрации 5 х 103 - 104 клеток/мл (50 мл культуры, содержащей 5 х 104 - 1 х 105 клеток/мл в банке 3,8 л). Это необходимо для того, чтобы определить, активно ли дуются ли мелиоиды. Когда долиолины глотают Rhodomonas sp. ., их пищеварительный тракт будет выглядеть красным цветом. Удалите зооиды, которые, как представляется, не кормления.
- Чтобы предотвратить doliolids от ловушки на воздушно-водный интерфейс, избежать headspace в культуре банки, полностью заполняя банки с нефильтрованной частицы богатых морской водой и размещение кусок пластиковой пленки над отверстием банку (89 мм в ширину).
- Избегайте создания пузырьков воздуха, которые также могут повредить животных. Тщательно винт крышку на банку и осторожно инвертировать банку, чтобы определить, если пузырьки присутствуют. Если пузырьки присутствуют, удалите их.
- После того, как банки заполнены, протрите лишнюю воду с внешней стороны банки.
- Установите каждую банку на колесо планктона(рисунок 2), поместив банку на вертикальные металлические прутья, покрытые резиновыми трубками, и между зажимом шланга из нержавеющей стали.
- Убедитесь, что задняя часть банки мягкая против резиновых труб. Затяните шланг зажим вокруг банки, регулируя винт.
- Убедитесь, что банку не движется, как только она надежно закреплена на месте. Разрешить банки вращаться на 0,3 об/ ч, чтобы держать долиолиды в подвеске.
ВНИМАНИЕ: Важно не затягивать банку, чтобы предотвратить банку от растрескивания.
- На корабле, поддерживать культуры судов на колесе планктона на 20 градусов по Цельсию в тусклом свете, пока они не могут быть переданы в лаборатории культуры объекта.
- По возвращении в лабораторию перенесите банки с долиолидами в подготовленное культурное учреждение. Маунт банки на колесе планктона (см. шаг 3.8) и позволяют банки продолжать вращаться на 0,3 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все выращивание долиодов в этом исследовании было проведено при 20 градусах Цельсия.
4. Поддержание культур Ы. Гегенбаури
- От корабля до лаборатории, позвольте животным акклиматизироваться в оригинальных банках к лабораторным условиям в течение 3 дней.
- Во время акклиматизации используйте широкую стеклянную пипетку для обмена 10% воды с нефильтроченной богатой частицами морской водой из места сбора каждый день в течение 3 дней.
- Держите несколько copepods в банке, но удалить все другие зоопланктона, большие фекальные гранулы, и большие агрегированные частицы, которые могут засорить фильтрующий аппарат долиолида (слизистая сеть). Если культура состоит из ранних медсестер, держите одну большую гонозовидную (6 мм) в банке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не важно, какие copepod видов включены в культуру, но в этом эксперименте, наиболее распространенных видов, присутствующих, откуда были захвачены долиолиды были использованы.
- После периода акклиматизации, передача долиолид зооидов и copepods из оригинальной банки для выращивания, содержащий 80% стеклянного волокна фильтра (GF /F) фильтруется морская вода и 20% морской воды из оригинальной банки. Подготовка фильтрования морской воды путем фильтрации морской воды через GF / F с номинальным размером поры 0,7 мкм фильтровальной бумаги.
- Поддерживайте новую культуру, обменивая 10% воды с фильтрованную морскую воду GF/F каждые 3 дня и удаляя агрегаты и фекальные гранулы. Еженедельно переносить животных в новую банку, описанную в шаге 4.2.
- Кормите долиолидами, поддерживая концентрации фитопланктона в культурных банках между 40 - 95 мкг C/L.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти концентрации имитируют условия окружающей среды, которые, как известно, поддерживают условия цветения для D. gegenbauri17. Смесь водорослей варьируется в зависимости от стадии жизни и количества зооидов в каждой банке. На ранних стадиях жизни добавляйте только смесь 1:1 (по содержанию углерода) из криптомонадных водорослей(Isochrysis galbana и Rhodomonas sp.). Более крупные виды добычи могут легко засорить кормовой аппарат маленьких медсестер и развитие трофозуидов. Добавить диатом Thalassiosira weissflogii в водоросли смеси, а также при равном содержании углерода, при кормлении больших медсестер, phorozooids, и gonozooids.- Мониторинг концентраций водорослей до и после кормления, чтобы руководство решение о том, как часто и сколько водорослей, чтобы добавить к культурам. Используйте счетчик частиц для определения концентрации водорослей, потому что концентрации водорослей в культурных банках относительно разбавлены.
- Удалите достаточное количество зооидов для поддержания концентрации водорослей 40 - 95 мкг/л, так что остальные долиоиды будут иметь достаточно пищи, чтобы расти.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее сложным этапом жизни для успешного поддержания в лабораторных условиях является развитие личинок и oozooid (ранняя медсестра). Во время этой фазы культуры, держать один большой гонозовид (No 6 мм) в дополнение к нескольким copepods в банке с развивающимися личинок и ooooids (20 за 3,8 л банку). - Передача по крайней мере 4 медсестер в новую банку культивирования раз как минимум 8 трофозуидов видны на кадофоре медсестры(рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Trophozooids удвоится в число каждые 1 - 2 дня при 20 градусах Цельсия. Трофозуиды достаточно велики, чтобы быть видимыми невооруженным глазом.- Удалите двух медсестер, как только медсестры разработают 20 трофозуидов.
- Удалите одну медсестру, когда медсестры разовьют 30 трофозуидов на их кадофорах. Разрешить оставшейся медсестре развивать phorozooids на его кадофора.
- Удалить медсестру, как только медсестра выпускает до 30 phorozooids.
- Уменьшите количество животных в банке, как только phorozooids достичь 3 мм в размерах.
- Удалите все, кроме четырех phorozooids, когда phorozooids становятся больше (5 мм) и разработали гонозуидных кластеров.
- Уменьшите культуру до двух phorozooids, когда количество скоплений gonozooids увеличивается в размерах и начинают кормить.
- Удалите phorozooids раз phorozooids выпустить до 30 гонозуидов.
- Уменьшите количество гонозуидов с 30 зооидов до 2 за банку. Разрешить оплодотворенные яйца, которые будут выпущены в банку.
- Удалите один gonozooid оставив один gonozooid в банке, как только oozooids развиваться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отбрасываемые медсестры, phorozooids, и gonozooids могут быть использованы для семян дополнительных культур и для проведения дальнейших экспериментов.
- Удалите один gonozooid оставив один gonozooid в банке, как только oozooids развиваться.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следуя описанным процедурам сбора и культивирования долиолида, D. gegenbauri, изложенные на рисунке 3, можно поддерживать культуру D. gegenbauri на протяжении всей своей сложной истории жизни (Рисунок 1) и поддерживать его в течение многих поколений. Хотя культивирование D. gegenbauri описано здесь, эти процедуры также должны быть актуальны для выращивания других видов долиолидов.
Захват здоровых и неповрежденных долилид зооидов требует применения специализированных сетей и буксировки процедур(рисунок 4). Как деликатные животные без твердых структур, следует позаботиться, чтобы свести к минимуму процедуры, которые могут привести к любому физическому ущербу. Эти факторы могут включать турбулентность, давление и взаимодействие с поверхностями, включая чистые, воздушные и воздушные пузырьки. Несмотря на их деликатный характер, однако, неповрежденные долиолидные зооиды могут быть собраны с помощью конической сетки планктона с диаметром открытия к длине соотношение 1:5 и оснащены относительно большой взвешенной нефильтровающей трески конца. Регулярно мы использовали 202 мкм сетки 2,5 м (длина) планктона сети с 0,5 м открытия установлен в поворотный ремень и оснащен 4 L взвешенных нефильтрованного трески конца (Рисунок 4). Хотя влияние размера планктона сетки на захват культивируемых D. gegenbauri зооидов не было систематически исследовано, теоретически, использование сети с большим размером сетки может привести к дальнейшему улучшению, как больший размер сетки будет уменьшить давление поля, генерируемого во время буксировки. Кроме того, больший размер сетки приведет к увеличению потока воды через сеть, потенциально вредных долилид зооидов. Скорость буксировки и чистый угол должны быть оптимизированы, чтобы свести к минимуму время буксировки и повреждения во время сбора. По нашему опыту, мы обнаружили, что достаточно мягкие условия буксировки могут быть достигнуты путем буксировки сети косо под углом 15-25 "с дрейфующего судна с вертикальным развертыванием и скоростью поиска не более 15 м / мин. Чтобы сориентировать сеть в направлении потока воды, сетка планктона устанавливается в поворотный ремень. Это, как правило, так, что распределение долиолидов в колонке воды не является случайным и, как правило, наибольшее в регионе с самыми высокими нагрузками твердых частиц24. Поэтому следует отбирать водный столб из-под подповерхностного хлорофилла максимум на поверхность. На мелководном среднеконтинентальном шельфе САБ (20 - 45 м) отбирается водная колонка с 1 м над дном и поверхностью.
После того, как здоровые зооиды были собраны, очень важно поддерживать их таким образом, чтобы свести к минимуму воздействие поверхностей. Чтобы свести к минимуму встречи с поверхностями, долиолиды хранятся в закругленных банках, наполненных морской водой, и мягко поваливают на медленно вращающееся колесо планктона(рисунок2).
Хотя теоретически возможно начать культуру с зооиды любого этапа жизни, исследование успехов и неудач в создании новых культур D. gegenbauri от 6 попыток между 2015 и 2018 в южной части Атлантического залива предположить, что успех чаще всего достигается, когда зооиды собираются из вод, которые являются lt; 21 "C, и когда этапы жизни, кроме больших зрелых гонозуидов используются, чтобы начать новую культуру (Таблица 1 и таблица 2). На практике, это полезно, или, по крайней мере, не вредно, чтобы включить несколько этапов жизни долилид зооиды при издании новой культуры.
Успех в поддержании культуры D. gegenbauri, как было описано для других пелагических видов туниката20, зависит от обеспечения достаточного, но не чрезмерного, пищевой и пищевой разнообразия, необходимых для поддержки каждого этапа жизни. Поскольку требования к питанию меняются на протяжении всего жизненного цикла, количество водорослей, предоставляемых в каждое время кормления, должно быть разнообразным для поддержания концентрации пищи на желаемом целевом уровне (40 - 95 мкг C/L) (Таблица 3). Концентрации выше или ниже этих уровней могут привести к повышению уровня смертности (G.A. Paffenh'fer pers. comm.). Хотя естественная диета D. gegenbauri остается плохо изученным6, культуры могут быть сохранены путем поставки относительно простых смесей культивированных водорослей и использования процедур, которые позволяют различным микробным сообществам установить в культуры. Увеличение потенциального разнообразия хищного поля достигается за счет сохранения доли частиц груженой воды из старых культур и включения небольшого числа живых копеподов и крупных долиолидов при каждом изменении или передаче воды. Предположительно, эти организмы обрабатывают водоросли и детритальный материал и служат для диверсификации размера частиц и спектра качества, доступных для питания долилида, но необходимы дополнительные исследования, чтобы подтвердить эту гипотезу.
Наличие долилидовых культур обеспечивает средства для исследования, в контролируемых экспериментальных условиях, многие важные аспекты долиолид биологии, физиологии, экологии и молекулярной биологии. Например, хотя долилиды в изобилии во многих регионах прибрежного океана и являются основными планктонных grazers25, данные о темпах кормления и роста остаются скудными26. Использование культур D. gegenbauri, в центре внимания культурных исследований было количественно кормления и темпов роста в ответ на критические параметры окружающей среды, включая температуру и концентрации пищи26. Результаты этих исследований показали, что показатели расчистки аналогичны в концентрациях от 20 до 60 мкг C/L и уменьшаются по мере увеличения концентраций пищи(рисунок 5A). Коэффициенты клиренса увеличиваются пропорционально над температурным диапазоном, поддерживающим рост D. gegenbauri (рисунок 5B). Темпы роста (k) варьируются от 0,1 до 0,7/день в зависимости от температуры и наличия продовольствия(рисунок6). Эти исследования, в дополнение к предоставлению практической информации для культивирования, позволили определить количественные взаимосвязи между долилид питания и темпы роста в зависимости от экологических параметров и обеспечить критическое понимание биологии и экологии долиолидов, необходимых для включения этой важной группы зоопланктона в моделирование рамок27.
Рисунок 1: Жизненный цикл D. gegenbauri при 20 градусах По Цельсию.
Рисунок жизненного цикла (1A) был изменен после Walters et al. 20186 и перерисован с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Планктон колесо используется для культуры Д. Гегенбаури. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Схематический обзор D. gegenbauri сбора и культивирования подход.
Коллекция в море (A), передача из концентрированных ведер к небольшому стеклянному стакану небольшими партиями (B), изоляция долилидовых зооидов в оловянные банки, содержащие богатую частицами морскую воду (C),техническое обслуживание на колесе планктона на протяжении всего жизненного цикла(D,E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Сетка планктона и развертывание.
Развертывание (вверху слева), поиск (вверху справа) и схема чистого и трески (внизу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Показатели альгал-расчистки D. gegenbauri gonozooids.
(A) связь между (A) Средние (Я S.E.) расчистка ставки (мЛ / зооид / день) по сравнению с фитопланктоном концентрации (мкг C/ L) для трех размеров D. gegenbauri гонозооидов. Каждая точка представляет 4-11 наблюдений. (B) Средние (я. S.E.) расчистка ставки (мЛ / зооид /день) по сравнению с температурой (КК) для трех размеров D. gegenbauri gonozooids. Каждая точка представляет 4-12 наблюдений. Размеры Gonozooids 2,5
мм (,
4,5 мм
( , и 6,5 мм ( ). Цифры были перерисованы с разрешения26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Темпы роста D. gegenbauri gonozooid.
Связь между (A) Средние (S.E.) темпы роста (k) против концентрации фитопланктона (мкг C/L) для трех размеров Dolioletta gegenbauri gonozooids. Каждая точка представляет 4-11 наблюдений. (B) Средние (S.E.) темпы роста (k) по сравнению с температурой (КК) для трех размеров Dolioletta gegenbauri gonozooids. Каждая точка представляет 4-12 наблюдений. Размеры Gonozooids 2,5мм (,4,5 мм( , и 6,5 мм ( ). Цифры были перерисованы с разрешения Гибсона и Паффенхефера26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Таблица 1. Океанографические условия и изобилие долиолидов | |||||||||||
| Поверхности | Нижней | Поверхности | Нижней | Поверхности | Нижней | Изобилие Долиолида | |||||
| Дата | Идентификатор круиза | Широта (N) | Долгота (w) | Глубина (м) | Температура (кС) | Температура (кС) | Залитье (PSU) | Залитье (PSU) | Хла (мкг/л) | Хла (мкг/л) | зооиды/м3 |
| 20/05/2015 | САВ-15-10 | 31.1889 | 80.1527 | 41.30 | 25.26 | 22.43 | 33.58 | 36.96 | Na | 0.20 | Na |
| 04/08/2015 | САВ-15-19 | 29.5687 | 80.3269 | 40.00 | 26.40 | 21.75 | 36.26 | 36.32 | 1.04 | 1.35 | 218 |
| 02/12/2015 | САВ-15-31 | 31.1674 | 80.1249 | 40.80 | 23.24 | 22.60 | 35.91 | 35.81 | 1.06 | 1.70 | 13 |
| 02/02/2017 | САВ-17-03 | 31.2139 | 80.1823 | 41.00 | 18.72 | 18.84 | 36.00 | 36.12 | 0.83 | 1.50 | 3 |
| 07/11/2017 | САВ-17-23 | 31.2144 | 80.1822 | 42.00 | 24.19 | 23.85 | 36.00 | 36.04 | 0.63 | 1.30 | 254 |
| 01/02/2018 | САВ-18-02 | 31.1835 | 80.1466 | 43.00 | 16.85 | 16.45 | 36.50 | 36.48 | 0.56 | 0.89 | Na |
| NA: данные недоступны | |||||||||||
Таблица 1: Океанографические условия и изобилие долиолидов на среднеконтинентальном шельфе южной Атлантики в то время и в месте, где Д. гегенбаури были собраны и использованы для инициирования новых культур.
| Таблица 2. Результаты D. gegenbauri Попытки культивирования | ||||
| Дата | Идентификатор круиза | Зооиды Собранные | Результат | Комментарии |
| 20/05/2015 | САВ-15-10 | Сексуально зрелые крупные (6-7 мм) гонозуиды | Сбой при | Все гонозооиды умерли через 4 дня. Oozooid и ранних стадий жизни медсестры были произведены, но не удалось процветать. |
| 04/08/2015 | САВ-15-19 | Сексуально зрелые крупные (8-10 мм) гонозуиды | Сбой при | Гонозуиды умерли вскоре после сбора. Oozooids и ранних медсестер были произведены, но не удалось процветать. |
| 02/12/2015 | САВ-15-31 | Смешанная коллекция, включая поздняя медсестра (4-5 мм) с прикрепленными трофозуидами, сексуально зрелыми крупными (6 мм) гонозуидами и озуидами (2 мм) | Успешной | Культурные для 4 полных поколений, дополнительные gonozooids и медсестер, собранных в январе и марте 2016 были добавлены к культуре. Лаборатория была эвакуирована на 4 дня во время урагана Мэтью в октябре 2016 года, и культура не выжила. |
| 02/02/2017 | САВ-17-03 | Смешанная коллекция, включающая гонозуиды (1,5-5 мм) и крупные phorozooids (6 мм) с прикрепленными скоплениями гонозуидов | Успешной | Культурные для 4 полных поколений, дополнительные gonozooids собраны в апреле 2017 были добавлены к культуре. Прекратила культуру в сентябре 2017 года в преддверии урагана «Ирма». |
| 07/11/2017 | САВ-17-23 | Гонозуиды (3-6 мм) | Сбой при | Большой гонозовид умер после 1 дня. Незрелый гонозовид выжил в культуре в течение 14 дней. Яйца были выпущены обоими гонозуидами. Oozooids были произведены, но не превратились в стадии медсестры. Культура потерпела неудачу после 1 месяца. |
| 01/02/2018 | САВ-18-02 | Большая (6-7 мм) поздняя медсестра без трофозуидов | Успешной | В культуре медсестра производила трофозуиды. Культура сохранялась в течение 3 поколений и была прекращена в конце июня 2018 года, когда были завершены эксперименты. |
Таблица 2: Результаты попыток создания лабораторных культур D. gegenbauri собраны из южной Атлантики Bight средне-континентального шельфа.
| Долиолетта гегенбаури | зооидное число на | зооидное число на | |||
| этап жизни | 3.9 L банка | 1.9 L банка | Изохриза галбана | Родомонас sp. | Талассиоза Вайсфлоги |
| ooooid | 20 | 10 | Включают | Включают | НЕ ВКЛЮЧАЙТЕ |
| ранняя медсестра | 20 | 10 | Включают | Включают | НЕ ВКЛЮЧАЙТЕ |
| поздняя медсестра с 8 трофозуидами | 4 | 2 | Включают | Включают | Включают |
| поздняя медсестра с 20 трофозуидами | 2 | 1 | Включают | Включают | Включают |
| поздняя медсестра с 30 трофозуидами | 1 | 1 | Включают | Включают | Включают |
| phorozooid (1 до 3 мм) | 30 | 15 | Включают | Включают | Включают |
| phorozooid gonozooid кластера (Яgt; 5 мм) | 2 | 1 | Включают | Включают | Включают |
| гонозуид (от 1 до 3 мм) | 30 | 15 | Включают | Включают | Включают |
| гонозуид (Зтт; 5 мм) | 2 | 1 | Включают | Включают | Включают |
| Целевые концентрации водорослей должны поддерживаться между 40 - 95 мкг C/L с равными смесями (по содержанию углерода) каждого вида водорослей | |||||
Таблица 3: Целевые условия культуры для каждого D. gegenbauri фазы жизненного цикла.
Дополнительная рисунок 1: Подробное описание пользовательского колеса планктона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
За последние несколько десятилетий был создан потенциал в области культуры долиолидов, который использовался для поддержки научных исследований в нескольких областях. Экспериментальные исследования в наших лабораториях поддержали публикацию по крайней мере 15 научных исследований, посвященных кормлению и росту18,26, воспроизводства18,28, диета6, 29, физиология30, экология31, и экологическое моделирование27 долиолидов.
Хотя культура этих деликатных животных в настоящее время трудоемкая и трудоемкая, выращивание долиодов возможно, и, если это будет осуществляться более широким сообществом, будет способствовать углублению понимания этого экологического и эволюционно важной группы животных. Цель этого исследования состояла в том, чтобы описать современные подходы к сбору, воспитанию и поддержанию D. gegenbauri в культуре с целью проведения лабораторных исследований.
Создание долилидной культуры требует сбора здоровых и неповрежденных животных и, после захвата, мягкое лечение, надлежащее питание и животноводство. Долиолиды, в частности вид D. gegenbauri, встречается примерно на субтропических континентальных шельфах, но изобилие может быть весьма изменчивым. Например, в недавнем исследовании сосредоточены на середине полки области SAB, хотя изобилие резко варьируется от ют;1/m3 до йgt; 20000/m3, долиолиды присутствовали в течение года6. Из-за высокой изменчивости долилидов в пространстве и времени и относительных трудностей, связанных с отбором проб континентального шельфа, надежные знания о динамике общин аллиолидов, где проводятся исследования, являются важными предпосылкой для успешного создания культуры.
После того, как долилид зооиды были обнаружены и захвачены, это может быть трудно определить, были ли животные были повреждены. Звери могут показаться неповрежденными и проявлять активное плавание и избежать поведения, но даже малейшая травма может привести к их неспособности процветать. Одной из особенностей, которая особенно уместна для оценки состояния здоровья захваченных долиолидовых зооидов, является их способность питаться. Кормовую активность можно оценить, просто предоставив пигментированные водоросли свежезахваченным животным. Если животное кормится, кишечник станет цветным в течение короткого периода времени. По нашему опыту, мы обнаружили, что добавление небольшого количества красных пигментированных водорослей, Rhodomonas sp., быстро предоставляет информацию о деятельности кормления. Если кормление не наблюдается, маловероятно, что культура может быть создана.
Бдительность и хорошее животноводство имеют решающее значение для создания и поддержания долиолидов на протяжении всего их сложного жизненного цикла. Пожалуй, наиболее проблемным этапом является развитие жизнеспособной медсестры из личиночной стадии и выработка (прорастания) кормящихся трофозоидов. На этом этапе жизни мы полагаем, что потребности в продуктах питания, в отношении количества, качества и размера частиц, наиболее ограничены. Насколько нам известно, не было никаких предыдущих исследований, которые исследовали активность кормления d. gegenbauri личинок и oozooids. Например, хотя развивающиеся гонозуиды и phorozooids способны глотать частицы в широком диапазоне размеров, способность личинок, ooooids, и небольшие медсестры, вероятно, более ограничены. На практике мы обнаруживаем, что успешное культивирование на этих этапах жизни может быть достигнуто путем опускания диатомовых из водорослей пищевой смеси, путем поддержания концентрации пищи на умеренных уровнях, путем проведения частых кормлений при более низких концентрациях, путем поддержания один больше gonozooid и несколько copepods с культурой, и вручную удалить большие агрегаты детрит.
Хотя мы поддерживаем культуры D. gegenbauri для нескольких поколений, происходящих из одной коллекции, когда это возможно, мы обычно дополняем существующие культуры свежесобранными животными, чтобы увеличить генетическое разнообразие и надежность культуры. Потенциальной опасностью этой практики является внедрение паразитов или болезней в культуру, но, насколько нам известно, мы никогда не сталкивались с этой проблемой. Хотя было мало сообщений о паразитов долиолидов32, несомненно, они существуют. Интересно, что в недавнем исследовании сравнения диеты культивированных D. gegenbauri gonozooids подвергаются воздействию природных вод с полевыми D. gegenbauri gonozooids, предполагаемые паразиты Apicomplexa были обнаружены в дикой популяции, которые были отсутствует в культурных животных6.
Существующее ограничение описанной технологии культуры является ограничение объема производства зооидного. В частности, поскольку описанные методы включают культивирование в запечатанных банках при низкой плотности на вращающемся колесе планктона, неясно, можно ли было бы масштабировать этот подход или же рабочий поток будет поддается автоматизации. Более масштабные системы культивирования, однако, для другого деликатного небольшого желатинового морского зоопланктона видов, larvacean Oikopleura dioica, были описаны20,33,34, предполагая, что он может можно разработать аналогичные системы для долиолидов в будущем. Тем не менее, сложная история жизни D. gegenbauri по сравнению с более простой историей жизни O. dioica будет оставаться серьезной проблемой для крупномасштабного выращивания.
В заключение, следуя описанным здесь протоколам, D. gegenbauri можно надежно культивировать в контролируемых лабораторных условиях на протяжении всей своей сложной истории жизни. Эта способность делает вид поддается различным контролируемым экспериментальным исследованиям, и, возможно, развивать долиолиды в качестве новой модели животных в биологии развития и эволюции. Однако для достижения этой цели необходимо будет преодолеть ограничения в масштабах производства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего декларировать.
Acknowledgments
Мы признательны многим людям, которые внесли накопленные знания в этот проект на протяжении многих лет, включая Г.-А. Паффенхефер и Д. Дейбель, которые первоначально разработали эти протоколы. М. Кёстер и Л. Ламколей также внесли значительный вклад в разработку этих процедур. Н.Б. Лопес-Фигероа и З.Е. Родригес-Сантьяго составили оценки изобилия долиолидов, приведенные в таблице 1. Это исследование было частично поддержано Национальным научным фондом США награды OCE 082599, 1031263 в MEF, совместные проекты OCE 1459293 и OCE 14595010 в MEF и DMG и, Национальное управление океанических и атмосферных наград NA16SEC4810007 DMG. Мы благодарны трудолюбивому и профессиональному экипажу R/V Savannah. Ли Энн DeLeo подготовил цифры, Чарльз И. Робертсон корректир рукописи и, Джеймс (Джимми) Уильямс изготовлены планктона колесо
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
References
- Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
- Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
- Kiorboe, T.
- Holland, L. Z.
- Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , Special Issue: Species Interactions, Ecological Networks and Community Dynamics (2018).
- Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
- Acuña, J. L.
- Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
- Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
- Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
- Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P.
- Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 1-24 (1998).
- Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).
- Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
- Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
- Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean's minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).
- Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
- Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).
- Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
- Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
- Deibel, D. The biology of pelagic tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 171-186 (1998).
- Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
- Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
- Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
- Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7 (2014).
- Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
- Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
- Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).
