Summary
Les doliolides, y compris l'espèce Dolioletta gegenbauri, sont de petits zooplanctonmarins marins gélatineux d'importance écologique que l'on trouve sur les plateaux sous-continentaux productifs du monde entier. La difficulté de cultiver ces organismes délicats limite leur recherche. Dans cette étude, nous décrivons les approches de culture pour la collecte, l'élevage et l'entretien du doliolide Dolioletta gegenbauri.
Abstract
Les zooplanktons gélatineux jouent un rôle crucial dans les écosystèmes océaniques. Cependant, il est généralement difficile d'étudier leur physiologie, leur croissance, leur fécondité et leurs interactions trophiques principalement en raison de défis méthodologiques, y compris la capacité de les culture. Cela est particulièrement vrai pour le doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri se produit généralement dans les systèmes subtropicaux productifs de plateau continental dans le monde entier, souvent à des concentrations de floraison capables de consommer une grande fraction de la production primaire quotidienne. Dans cette étude, nous décrivons des approches de culture pour la collecte, l'élevage et le maintien de D. gegenbauri dans le but de mener des études en laboratoire. D. gegenbauri et d'autres espèces de dolioldes peuvent être capturés vivants à l'aide de filets de plancton à mailles coniques obliquement remorquées de 202 m à partir d'un navire à la dérive. Les cultures sont les plus fiables établies lorsque les températures de l'eau sont inférieures à 21 oC et sont commencées à partir de gonozooides immatures, de phorozooïdes en maturation et de grandes infirmières. Les cultures peuvent être maintenues dans des récipients de culture arrondis sur une roue de plancton tournant lentement et soutenues sur un régime des algues cultivées dans l'eau de mer normale pendant beaucoup de générations. En plus de la capacité d'établir des cultures de laboratoire de D. gegenbauri, nous démontrons que l'état de collecte, la concentration d'algues, la température et l'exposition à l'eau de mer naturellement conditionnée sont tous essentiels à la culture l'établissement, la croissance, la survie et la reproduction de D. gegenbauri.
Introduction
Le compte de zooplancton pour la plus grande biomasse animale dans l'océan, sont des composants clés dans les réseaux alimentaires marins, et jouent un rôle important dans les cycles biogéochimiques océaniques1,2. Le zooplancton, bien que composé d'une grande diversité d'organismes, peut être grossièrement distingué en deux catégories: gélatineux et non-gélatineux avec peu de taxons intermédiaires3,4. Comparé au zooplancton non-gélatineux, le zooplancton gélatineux est particulièrement difficile àétudier en raison de leurs histoires de vie complexes 5, et leurs tissus délicats sont facilement endommagés pendant la capture et la manipulation. Les espèces de zooplancton gélatineux sont donc notoirement difficiles à culture en laboratoire et généralementmoins étudiées que les espèces non gélatineuses 6.
Parmi les groupes de zooplancton gélatineux, un abondant et d'importance écologique dans l'océan du monde sont les Thaliacéens. Les Thaliacéens sont une classe de tuniciers pélagiques qui incluent les ordres Salpida, Pyrosomida, et Doliolida7. Les Doliolida, collectivement appelées doliolides, sont de petits organismes pélagiques en forme de baril qui peuvent atteindre des abondances élevées dans les régions nerveuses productives des océans subtropicaux. Les doliolides sont parmi les plus abondants de tous les groupes de zooplancton4,8. En tant que mangeoires de suspension, les doliolides recueillent les particules alimentaires de la colonne d'eau en créant des courants de filtre et en les capturant sur les filets de mucus9. Taxonomiquement, les doliolides sont classés dans le phylum Urochordata10. Ancestral aux chordates, et en plus de leur importance écologique en tant que composants clés des systèmes pélagiques marins, les Thaliacéens sont d'importance pour comprendre les origines de l'histoire de la vie coloniale10,11 et l'évolution des chordates5,7,10,12,13,14.
L'histoire de la vie des doliolides est complexe et contribue à la difficulté de les cultiver et de les soutenir tout au long de leur cycle de vie. Un examen du cycle de vie et de l'anatomie doliolid peut être trouvé dans Godeaux et autres15. Le cycle de vie doliolid, qui implique une alternance obligatoire entre les stades de l'histoire de la vie sexuelle et asexuée, est présenté dans la figure 1. Les ovules et le sperme sont produits par les gonozooides hermaphroditiques, la seule étape solitaire du cycle de vie. Les gonozooides libèrent le sperme dans la colonne d'eau et les œufs sont fécondés à l'interne et relâchés pour se développer en larves. Les larves éclosent et se métamorphosent en oozooïdes pouvant atteindre 1 à 2 mm. En supposant des conditions environnementales et une nutrition favorables, les oozooïdes deviennent des infirmières précoces dans un délai de 1 à 2 jours à 20 oC et initient les étapes coloniales du cycle de vie. Les oozooides produisent asexué des bourgeons sur leur stolon ventral. Ces bourgeons quittent le stolon et migrent vers le cadophore dorsal où ils s'alignent en trois rangées jumelées. Les doubles rangées centrales deviennent des phorozooïdes et les deux rangées doubles extérieures deviennent des trophozooïdes. Ces derniers fournissent de la nourriture à la fois à l'infirmière et aux phorozooïdes16,17. Les trophozooïdes fournissent à l'infirmière de la nutrition car elle perd tous les organes internes. Comme l'abondance des trophozooïdes augmente, la taille de l'infirmière peut atteindre 15 mm en laboratoire. À mesure que les phorozooïdes grandissent, ils ingèrent de plus en plus de proies planctoniques et atteignent 1,5 mm de taille avant d'être relâchés à l'instar de17individus. Une seule infirmière peut libérer 100 phorozooïdes au cours de sa durée de vie18. Après que les phorozooïdes sont libérés du cacophore, ils continuent à se développer et sont la deuxième étape coloniale du cycle de vie. Une fois qu'ils atteignent la taille de 5 mm, chaque phorozooid développe un groupe de gonozooides sur leur pédoncule ventral. Ces gonozooides peuvent ingérer des particules lorsqu'elles atteignent 1 mm de longueur. Une fois que les gonozooides ont atteint une taille de 2 à 3 mm, ils sont libérés du phorozooide et deviennent la seule étape solitaire du cycle de vie. Une fois qu'ils atteignent la taille de 6 mm, les gonozooides deviennent sexuellement matures17. Les gonozooides peuvent atteindre 9 mm ou plus de longueur. Gonozooids sont hermaphroditiques, le sperme est libéré par intermittence tandis que la fécondation des œufs se produit à l'interne16,17. Lorsque le gonozooid mesure 6 mm, il libère jusqu'à 6 œufs fécondés. La culture réussie exige de soutenir les besoins spécifiques de chacune de ces étapes uniques de l'histoire de la vie.
En raison de l'importance écologique et évolutive des Thaliacéens, y compris les doliolides, il est nécessaire que les méthodologies de culture fassent progresser la compréhension de la biologie, de la physiologie, de l'écologie et de l'histoire évolutive uniques de cet organisme19. . Les doliolides sont très prometteurs en tant qu'organismes modèles expérimentaux en biologie du développement et en génomique fonctionnelle parce qu'ils sont transparents et ont probablement rationalisé les génomes20,21. L'absence de méthodes de culture fiables, cependant, empêche leur utilité en tant que modèles de laboratoire. Bien qu'une poignée de laboratoires aient publié des résultats basés sur des doliolides cultivés, nos approches de culture du savoir et nos protocoles détaillés n'ont pas été publiées auparavant. Basé sur des années d'expérience, et des tentatives de culture d'essais et d'erreurs, le but de cette étude était d'examiner les expériences et de partager des protocoles pour la collecte et la culture des doliolides, en particulier l'espèce Dolioletta gegenbauri.
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Protocol
1. Préparation des installations de culture pour l'élevage de D. gegenbauri
REMARQUE : Tous les matériaux et équipements requis sont répertoriés dans le Tableau des matériaux.
- Préparer 1 M d'hydroxyde de sodium (NaOH), 0,06 M de permanganate de potassium (KMnO4) solution. Pour préparer cette solution, dissoudre 400 g de NaOH dans 10 L d'eau déionisée. Ajouter 100 g de KMnO4 à la solution NaOH et bien mélanger.
- Préparer une solution de 0,1 M de bisulfite de sodium (NaHSO3) en dissolvant 100 g de NaHSO3 en 10 L d'eau déionisée et bien mélanger.
CAUTION: Ces réactifs sont des irritants qui peuvent causer des problèmes respiratoires s'ils sont inhalés. Placer dans un endroit bien aéré comme une hotte à fumée. Évitez tout contact cutané. Portez des gants de protection, des vêtements de protection, une protection oculaire et une protection du visage lors de la manipulation. - Avant d'établir et d'élever les cultures doliolid en laboratoire, nettoyez et stérilisez les pots de culture.
- Rincer les pots de culture de 1,9 L et de 3,8 L au moins 3 fois avec de l'eau déionisée. Laisser sécher les bouchons à vis, car les bouchons ne sont pas inclus dans les étapes de nettoyage suivantes.
- Nettoyez et stérilisez les pots de culture en verre de 1,9 et 3,8 L en les immergeant dans la solution NaOH/KMnO4. Laisser tremper les pots toute la nuit.
- Retirer les pots de la solution NaOH/KMnO4 et les plonger dans la solution de bisulfite de sodium (NaHSO3). Laisser tremper les pots toute la nuit.
- Retirer les pots de la solution NaHSO3 et bien rincer à l'eau déionisée. Laisser sécher les pots.
- Placez la roue de plancton (figure 2) dans un espace à température contrôlée (chambre environnementale). Équilibrez la température à 20 oC. Pour une description plus détaillée de la roue de plancton personnalisée, veuillez consulter la figure supplémentaire 1.
2. Culture phytoplancton
- Obtenir des cultures d'algues du Centre national pour les algues marines et le microbiote (NCMA) ou d'autres sources pour être utilisé comme nourriture pour D. gegenbauri. Des mélanges de deux espèces flagellates, dont Isochrysis galbana (CCMP 1323), Rhodomonas sp (CCMP 740), et d'une petite diatomée, Thalassiosira weissflogii (CCMP 1051) ont été obtenus auprès de la NCMA et ont été utilisés en laboratoire précédent. études à l'arrière doliolids avec succès17.
- Préparer les médias de croissance L1 et L1-Si22, comme le recommande la NCMA.
- Suivez les instructions fournies par le fournisseur pour initier les nouvelles cultures d'algues.
- Pour maintenir les cultures de stock, en utilisant des techniques rigoureuses de culture axenique, transférer 0,5 ml de vieille culture sénecing à 25 ml de médias de croissance fraîche dans des tubes stériles de culture en verre 55 ml toutes les deux semaines.
REMARQUE : Il n'est pas possible de stocker des cultures d'algues vivantes sans les transférer régulièrement. Si les cultures ne seront pas utilisées pendant de longues périodes, et qu'il n'est pas possible de maintenir les cultures pendant toute la durée de la période de non-utilisation, il est recommandé de réacquérir ces cultures d'algues communes à partir de leurs sources d'origine (p. ex., NCMA). - Préparer de plus grands volumes de phytoplancton pour l'alimentation des doliolides dans des flacons propres de culture de tissu plastique de 500 ml contenant 200 ml de support de croissance.
- Inoculer le phytoplancton des stocks axeniques (4 ml) en 200 ml de support de croissance (1:50 dilution).
- Incuber à 20 oC avec une lumière de 12:12 h : cycle sombre sous une lumière blanche fraîche de 65-85 'E/m2. Poser les flacons de culture à plat pour maximiser l'éclairage. Tourbillonner doucement la culture tous les jours.
- Déterminer la concentration des cellules à l'aide d'un compteur de particules ou d'un microscope pour surveiller la croissance des cultures.
REMARQUE : Après 7 à 10 jours d'inoculation, les cultures flagellates contiendront 10à106 cellules/mL et la culture de la diatomée contiendra 10à105 cellules/mL. Ces concentrations sont suffisantes pour maintenir les cultures doliolides. - Initier de nouveaux stocks d'alimentation au moins toutes les deux semaines pour fournir suffisamment de biomasse d'algues pour soutenir toutes les activités culturelles.
3. Collection de doliolids sauvages et d'eau de mer pour la culture
REMARQUE : Un aperçu des approches de collecte et de culture est décrit à la figure 3. Une description du filet de plancton de collecte spécialisé et de l'extrémité de la morue est fournie à la figure 4.
- Localiser les doliolides en les détectant à l'aide de filets de plancton ou de systèmes d'imagerie in situ23.
REMARQUE : Étant donné que les doliolides sont rarement présents dans les eaux de surface et ne sont pas détectables par la technologie de télédétection, guidés par la connaissance préalable des conditions favorables aux doliolides (voir Discussion), la présence de doliolides doit être déterminée avant l'échantillonnage. - Recueillir de l'eau de mer riche en particules avant de recueillir des doliolides vivants en vue de l'initiation d'une culture D. gegenbauri.
- Déployer des bouteilles Niskin montées sur une rosette CTD ou un équipement équivalent pour recueillir l'eau du site où se trouvent les doliolides et de la profondeur contenant les estimations les plus élevées de chlorophylle, une concentration estimée par la fluorometryine in situ.
REMARQUE : La chlorophylle est utilisée comme indicateur des concentrations de particules. Sur le plateau mi-continental de l'Atlantique Sud (SAB), la chlorophylle souterraine d'un maximum est généralement proche du fond, mais dans d'autres endroits, il se peut qu'il ne le soit pas.
- Déployer des bouteilles Niskin montées sur une rosette CTD ou un équipement équivalent pour recueillir l'eau du site où se trouvent les doliolides et de la profondeur contenant les estimations les plus élevées de chlorophylle, une concentration estimée par la fluorometryine in situ.
- Une fois que les doliolides sont localisés, récupérez les zooides doliolides intacts à l'aide du filet de plancton spécialisé et de l'extrémité de la morue. Avant de déployer le filet, remplissez la morue d'eau de mer.
- À partir d'un navire à la dérive, abaissez et soulevez le filet à travers la colonne d'eau en maintenant un angle de remorquage oblique de 15 à 25 degrés et une vitesse de récupération verticale ne supérieure pas à 15 m/min.
- Une fois le filet à bord, transférer délicatement et diviser le contenu de l'extrémité de la morue en seaux en plastique de 3, 5 gallons (20 L) contenant chacun 10 L d'eau de mer de surface prélevée sur le site.
REMARQUE : Les nouveaux seaux en plastique doivent être conditionnés par l'ajout de jours d'eau de mer avant de vivre la collecte de doliolid. L'objectif est de réduire le lixiviation des produits chimiques à partir de plastique. Si l'eau de mer n'est pas disponible, utilisez de l'eau purifiée (p. ex. Milli Q) ou de l'eau du robinet exempte de contaminants toxiques pour conditionner les seaux. - Isoler les zooides doliolides des autres planctons.
- En petits lots (2 L) transférer les planches mélangées du contenu net de remorquage (maintenant dans des seaux en plastique de 20 L) à un bécher en verre de 2 L.
- À l'aide d'une pipette en verre à large souper (8 mm D.ID x 38 cm de longueur), siphonner soigneusement et transférer activement les zooides doliolides de natation du bécher dans des pots de culture en verre propre contenant de l'eau de mer riche en particules recueillis à l'aide de bouteilles Niskin d'où les doliolides étaient situé.
- Relâchez doucement les zooides doliolides sous la surface de l'eau de mer.
REMARQUE : Recueillir les gonozooides, les phorozooïdes contenant des gonozooïdes en développement attachés et les stades d'infirmières contenant des trophozooïdes attachés (figure 1).
- Après l'ajout de doliolides, ajouter la culture Rhodomonas sp. à une concentration finale de 5 x 103 - 104 cellules/mL (50 ml d'une culture contenant 5 x 104 - 1 x 105 cellules/mL dans un bocal de 3,8 L). Il s'agit de déterminer si les doliolides se nourrissent activement. Lorsque les doliolides ingèrent Rhodomonas sp., leur tube digestif apparaîtra de couleur rouge. Enlever les zooïdes qui ne semblent pas se nourrir.
- Pour éviter que les doliolides ne soient piégés à l'interface air-eau, évitez l'espace de tête dans les pots de culture en remplissant complètement les pots d'eau de mer non filtrée riche en particules et en plaçant un morceau de pellicule plastique sur l'ouverture du bocal (89 mm de large).
- Évitez de créer des bulles d'air qui peuvent également endommager les animaux. Vissez soigneusement le bouchon sur le bocal et inversez doucement le pot pour déterminer si des bulles sont présentes. Si des bulles sont présentes, retirez-les.
- Une fois les bocaux remplis, essuyez l'excès d'eau de l'extérieur du bocal.
- Montez chaque bocal sur la roue de plancton (Figure 2) en plaçant le pot sur les barres métalliques verticales recouvertes de tubes en caoutchouc, et entre une pince à tuyaux en acier inoxydable.
- Assurez-vous que l'arrière du pot est amorti contre le tube en caoutchouc. Resserrer la pince de tuyau autour du pot en ajustant la vis.
- Vérifiez que le pot ne bouge pas une fois qu'il est solidement fixé en place. Laisser les bocaux tourner à 0,3 tr/min pour garder les doliolides en suspension.
CAUTION: Il est important de ne pas trop serrer le pot pour empêcher le pot de se fissurer.
- À bord du navire, maintenir les navires de culture sur la roue de plancton à 20 oC sous un faible luminosité jusqu'à ce qu'ils puissent être transférés à l'installation de culture de laboratoire.
- À votre retour au laboratoire, transférer les pots contenant des doliolides dans l'installation de culture préparée. Montez les bocaux sur la roue du plancton (voir l'étape 3.8) et laissez les bocaux continuer à tourner à 0,3 tr/min.
REMARQUE : Toute l'élevage des doliolides dans cette étude a été réalisé à 20 oC.
4. Maintenir les cultures D. gegenbauri
- Du navire au laboratoire, permettre aux animaux de s'acclimater dans les bocaux d'origine aux conditions de laboratoire pendant 3 jours.
- Pendant la période d'acclimatation, utilisez une pipette en verre à large perceuse pour échanger 10 % de l'eau avec de l'eau de mer non filtrée riche en particules du site de collecte tous les jours pendant 3 jours.
- Gardez plusieurs copépodes dans le bocal, mais enlevez tous les autres zooplancton, les grosses pastilles fécales et les grosses particules agrégées qui peuvent obstruer l'appareil de filtrage du doliolide (filet de mucus). Si la culture se compose d'infirmières précoces, garder un grand gonozooid (6 mm) dans le bocal.
REMARQUE : Il n'est pas important que les espèces de copépodes soient incluses dans la culture, mais dans cette expérience, les espèces les plus abondantes présentes d'où les doliolides ont été capturés ont été utilisées.
- Après la période d'acclimatation, transférer les zooïdes et les copépodes doliolides du bocal d'origine dans un bocal de culture propre contenant 80 % de filtre en fibre de verre (GF/F) filtré l'eau de mer et 20 % de l'eau de mer du pot d'origine. Préparer l'eau de mer filtrée en filtrant l'eau de mer à travers un GF/F d'une taille nominale de pores de 0,7 m de papier filtre.
- Maintenir la nouvelle culture en échangeant 10 % de l'eau avec de l'eau de mer filtrée GF/F tous les 3 jours et en enlevant les agrégats et les granulés fécaux. Hebdomadaire, transférer les animaux dans un nouveau bocal tel que décrit à l'étape 4.2.
- Nourrir les doliolids en maintenant les concentrations de phytoplancton dans les pots de culture entre 40 et 95 g C/L.
REMARQUE : Ces concentrations imitent les conditions environnementales qui sont connues pour soutenir les conditions de floraison de D. gegenbauri17. Le mélange d'espèces d'algues varie selon le stade de la vie et le nombre de zooïdes dans chaque bocal. Au début de la vie, ajoutez 1:1 mélange (par teneur en carbone) des algues cryptomonades(Isochrysis galbana et Rhodomonas sp.) seulement. Les plus grandes espèces de proies peuvent facilement obstruer l'appareil d'alimentation des petites infirmières et développer des trophozooïdes. Ajouter la diatomée Thalassiosira weissflogii au mélange d'algues, également à teneur égale en carbone, lors de l'alimentation des infirmières plus grandes, des phorozooïdes et des gonozooides.- Surveiller les concentrations d'algues avant et après l'allaitement pour guider la décision de la fréquence et de la quantité d'algues à ajouter aux cultures. Utilisez un compteur de particules pour déterminer les concentrations d'algues, car les concentrations d'algues dans les pots de culture sont relativement diluées.
- Enlevez suffisamment de zooïdes pour maintenir des concentrations d'algues de 40 à 95 g/L afin que les doliolides restants aient assez de nourriture pour pousser.
REMARQUE : Le stade de vie le plus difficile à maintenir avec succès dans des conditions de laboratoire est le développement des larves et de l'oozooide (infirmière précoce). Pendant cette phase de la culture, conservez un grand gonozooid (6 mm) en plus de plusieurs copépodes dans le bocal avec des larves et des oozooides en développement (20 pour 3,8 L de pot). - Transférer au moins 4 infirmières dans un nouveau bocal de culture une fois qu'un minimum de 8 trophozooïdes sont visibles sur le cacophore de l'infirmière (figure 1B).
REMARQUE : Les trophozooïdes doubleront en nombre tous les 1 à 2 jours à 20 oC. Les trophozooïdes sont assez grands pour être visibles à l'œil nu.- Retirez deux des infirmières une fois que les infirmières développent 20 trophozooïdes.
- Enlevez une infirmière lorsque les infirmières développent 30 trophozooïdes sur leurs cadophores. Permettre à l'infirmière restante de développer des phorozooïdes sur son cadophore.
- Retirez l'infirmière une fois que l'infirmière libère jusqu'à 30 phorozooïdes.
- Réduire le nombre d'animaux dans le bocal une fois que les phorozooïdes atteignent 3 mm de taille.
- Enlevez tous les phorozooïdes sauf quatre lorsque les phorozooïdes deviennent plus grands (-gt; 5 mm) et ont développé des amas de gonozooides.
- Réduire la culture à deux phorozooïdes lorsque le nombre de grappes de gonozooides augmente en taille et commence à se nourrir.
- Enlever les phorozooïdes une fois que les phorozooides libèrent jusqu'à 30 gonozooides.
- Réduire le nombre de gonozooides de 30 zooïdes à 2 par pot. Laisser les œufs fécondés être libérés dans le bocal.
- Enlever un gonozooid en laissant un seul gonozooid dans le bocal une fois que les oozooides se développent.
REMARQUE : Les infirmières, les phorozooïdes et les gonozooides jetés peuvent être utilisés pour semer d'autres cultures et pour mener d'autres expériences.
- Enlever un gonozooid en laissant un seul gonozooid dans le bocal une fois que les oozooides se développent.
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Representative Results
Suivant les procédures décrites pour la collecte et la culture du doliolid, D. gegenbauri décrit dans la figure 3, il est possible de maintenir une culture de D. gegenbauri tout au long de son histoire de vie complexe (Figure 1) et le soutenir pendant de nombreuses générations. Bien que la culture de D. gegenbauri soit décrite ici, ces procédures devraient également être pertinentes pour la culture d'autres espèces de dolioldes.
La capture de zooides doliolides sains et intacts nécessite l'application de filets spécialisés et de procédures de remorquage (figure 4). En tant qu'animaux délicats sans structures dures, il faut prendre soin de minimiser les procédures qui peuvent entraîner des dommages physiques. Ces facteurs peuvent inclure la turbulence, la pression et les interactions avec les surfaces, y compris le filet, l'air et les bulles d'air. Malgré leur nature délicate, cependant, les zooides doliolides intacts peuvent être recueillis à l'aide d'un filet de plancton conique avec un rapport diamètre-longueur d'ouverture de 1:5 et équipé d'une morue non filtrante pondérée relativement grande. De façon routinière, nous avons utilisé un filet de plancton de 2,5 m (longueur) avec une ouverture de 0,5 m montée dans un harnais pivotant et équipée d'une morue non filtrante de 4 L (figure4). Bien que l'effet de la taille du maillage planctonique sur la capture des zooïdes cultivables de D. gegenbauri n'ait pas été systématiquement étudié, théoriquement, l'utilisation d'un filet avec une plus grande taille de maillage peut entraîner une amélioration supplémentaire car une plus grande taille de maillage réduire le champ de pression généré pendant le remorquage. Alternativement, une plus grande taille de maille aura comme conséquence un plus grand écoulement d'eau par le filet, les zooides doliolides potentiellement dommageables. Les vitesses de remorquage et l'angle net doivent être optimisés afin de minimiser le temps de remorquage et les dommages pendant la collecte. D'après notre expérience, nous avons constaté que des conditions de remorquage suffisamment douces peuvent être obtenues en remorquant le filet obliquement à un angle de 15-25 degrés à partir d'un navire à la dérive avec un déploiement vertical et des vitesses de récupération ne supérieures pas à 15 m/min. Pour orienter le filet vers la direction de l'écoulement de l'eau, le filet de plancton est monté dans un harnais pivotant. Il est généralement le cas que la distribution des doliolides dans la colonne d'eau n'est pas aléatoire et généralement plus grande dans la région avec les charges de particules les plus élevées24. Par conséquent, la colonne d'eau du sous-sol de la chlorophylle maximale à la surface doit être échantillonnée. Dans le plateau continental moyen peu profond de SAB (20 à 45 m), la colonne d'eau de 1 m au-dessus du fond jusqu'à la surface est échantillonnée.
Une fois que les zooïdes sains ont été recueillis, il est essentiel de les maintenir d'une manière qui minimise l'exposition aux surfaces. Pour minimiser les rencontres avec les surfaces, les doliolides sont conservés dans des bocaux arrondis remplis d'eau de mer et dégringolés doucement sur une roue de plancton en rotation lente (figure 2).
Bien qu'il soit théoriquement possible de commencer une culture avec des zooïdes de n'importe quelle étape de la vie, l'exploration des succès et des échecs à établir de nouvelles cultures de D. gegenbauri de 6 tentatives entre 2015 et 2018 dans la baie de l'Atlantique Sud suggèrent que le succès est le plus souvent réalisé lorsque les zooïdes sont recueillis dans des eaux qui sont 'lt; 21 'C, et lorsque les stades de vie autres que les grands gonozooides matures sont utilisés pour commencer une nouvelle culture (tableau 1 et tableau 2). Dans la pratique, il est utile, ou du moins pas préjudiciable, d'inclure plusieurs stades de vie des zooides doliolides lors de l'initiation d'une nouvelle culture.
Le succès dans le maintien d'une culture de D. gegenbauri, comme cela a été décrit pour d'autres espèces de tuniciers pélagiques20, dépend de fournir suffisamment, mais pas excessive, la diversité alimentaire et alimentaire nécessaire pour soutenir chaque étape de la vie. Comme les besoins en alimentation varient tout au long du cycle de vie, la quantité d'algues fournies à chaque période d'alimentation doit être modifiée pour maintenir les concentrations alimentaires aux niveaux cibles souhaités (40 à 95 g C/L) (tableau3). Les concentrations supérieures ou inférieures à ces niveaux peuvent entraîner une augmentation des taux de mortalité (G.A. Paffenh-fer pers. comm.). Bien que le régime alimentaire naturel de D. gegenbauri reste mal compris6, les cultures peuvent être maintenues en fournissant des mélanges relativement simples d'algues cultivées et en utilisant des procédures qui permettent à diverses communautés microbiennes de s'établir en la culture. L'augmentation de la diversité potentielle du champ de proies est obtenue en conservant une fraction de l'eau chargée de particules provenant de cultures plus anciennes et en intenant un petit nombre de copépodes vivants et de grands doliolides à chaque changement ou transfert d'eau. Vraisemblablement, ces organismes traitent les algues et les matériaux détritiques et servent à diversifier la taille des particules et le spectre de qualité disponiblepour la nutrition doliolide, mais des études supplémentaires sont nécessaires pour confirmer cette hypothèse.
La disponibilité des cultures doliolides fournit les moyens d'étudier, dans des conditions expérimentales contrôlées, de nombreux aspects importants de la biologie doliolide, de la physiologie, de l'écologie et de la biologie moléculaire. Par exemple, bien que les doliolides soient abondants dans de nombreuses régions de l'océan côtier et qu'ils soient d'importants brouteurs planctoniques25, les données sur les taux d'alimentation et de croissance restent rares26. L'utilisation des cultures de D. gegenbauri, l'un des objectifs de la recherche basée sur la culture a été de quantifier les taux d'alimentation et de croissance en réponse à des paramètres environnementaux critiques, y compris la température et les concentrations alimentaires26. Les résultats de ces études ont indiqué que les taux de défrichage sont semblables à des concentrations de 20 à 60 g C/L et diminuent à mesure que les concentrations alimentaires augmentent (figure 5A). Les taux de dédouanement augmentent proportionnellement au-dessus des plages de température favorables à la croissance de D. gegenbauri (figure 5B). Les taux de croissance (k) varient de 0,1 à 0,7 /jour en fonction de la température et de la disponibilité des aliments (figure 6). Ces études, en plus de fournir des informations pratiques pour la culture, ont permis de déterminer les relations quantitatives entre l'alimentation doliolide et les taux de croissance en fonction des paramètres environnementaux et fournissent des informations critiques sur la biologie et l'écologie des doliolides nécessaires pour inclure cet important groupe de zooplancton dans des cadres de modélisation27.
Figure 1 : Le cycle de vie de D. gegenbauri à 20 oC.
Le dessin du cycle de vie (1A) a été modifié après Walters et al., 2018 6, et redessiné avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Roue de plancton utilisée pour la culture D. gegenbauri. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Aperçu schématique de D. gegenbauri collection et culture approche.
Collection en mer (A), transfert de seaux concentrés à petits béchers en verre en petits lots (B), isolement des zooides doliolides dans des pots de culture contenant de l'eau de mer riche en particules (C), entretien sur la roue de plancton tout au long du cycle de vie (D,E). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Filet de plancton et déploiement.
Déploiement (en haut à gauche), récupération (en haut à droite) et schéma de filet et de morue (en bas). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Taux de dédouanement des algues de D. gegenbauri gonozooids.
(A) relation entre (A) Moyenne (S.E.) taux de dégagement (mL/zooid/jour) et concentration de phytoplancton (g C/L) pour trois tailles de gonozooides De. gegenbauri. Chaque point représente 4 à 11 observations. (B) Taux de dégagement moyen (S.E.) (mL/zooid/jour) par rapport à la température (C) pour trois tailles de gonozooides D. gegenbauri. Chaque point représente 4 à 12 observations. Les tailles gonozooides sont
de 2,5
mm ( ), 4,5 mm ( ), et 6,5 mm ( ).
Les chiffres ont été redessinés avec la permission26. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Taux de croissance de D. gegenbauri gonozooid.
Relation entrelestaux de croissance moyen (S.E.) (k) et la concentration de phytoplancton (g C/L) pour trois tailles de gonozooides Dolioletta gegenbauri. Chaque point représente 4 à 11 observations. (B) Taux de croissance moyen (S.E.) (k) par rapport à la température (C) pour trois tailles de gonozooides Dolioletta gegenbauri. Chaque point représente 4 à 12 observations. Les tailles gonozooides sontde 2,5mm ( ), 4,5 mm ( ), et 6,5 mm ( ). Les chiffres ont été redessinés avec la permission de Gibson et Paffenh-fer26. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Tableau 1. Conditions océanographiques et abondance doliolid | |||||||||||
| surface | bas | surface | bas | surface | bas | Abondance doliolide | |||||
| date | ID de croisière | Latitude (N) | Longitude (A) | Profondeur (m) | Température (CC) | Température (CC) | Salinité (PSU) | Salinité (PSU) | Chla (g/L) | Chla (g/L) | zooides/m3 |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | 31.1889 | 80.1527 | 41.30 | 25.26 | 22.43 | 33.58 | 36.96 | Na | 0.20 | Na |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | 29.5687 | 80.3269 | 40.00 | 26.40 | 21.75 | 36.26 | 36.32 | 1.04 | 1.35 | 218 |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | 31.1674 | 80.1249 | 40.80 | 23.24 | 22.60 | 35.91 | 35.81 | 1.06 | 1.70 | 13 |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | 31.2139 | 80.1823 | 41.00 | 18.72 | 18.84 | 36.00 | 36.12 | 0.83 | 1.50 | 3 |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | 31.2144 | 80.1822 | 42.00 | 24.19 | 23.85 | 36.00 | 36.04 | 0.63 | 1.30 | 254 |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | 31.1835 | 80.1466 | 43.00 | 16.85 | 16.45 | 36.50 | 36.48 | 0.56 | 0.89 | Na |
| NA : données non disponibles | |||||||||||
Tableau 1 : Conditions océanographiques et abondance doliolide sur le plateau moyen-continental de l'Atlantique Sud au moment et à l'endroit où D. gegenbauri zooides ont été recueillis et utilisés pour initier de nouvelles cultures.
| Tableau 2. Résultats des tentatives de culation de D. gegenbauri | ||||
| date | ID de croisière | Zooides recueillis | résultat | Commentaires |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | Gonozooids de grande maturité sexuelle (6-7 mm) | raté | Tous les gonozooides étaient morts après 4 jours. Oozooid et les premières étapes de la vie infirmière ont été produites, mais n'a pas réussi à prospérer. |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | Gonozooids de grande maturité sexuelle (8-10 mm) | raté | Gonozooids est mort peu de temps après la collecte. Des oozooides et des premières infirmières ont été produites mais n'ont pas réussi à prospérer. |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | Collection mixte comprenant l'infirmière tardive (4-5 mm) avec les trophozooides attachés, les gonozooides de grande maturité sexuellement (6 mm) et les oozooides (2 mm) | qui a réussi | Cultivés pendant 4 générations complètes, des gonozooides et des infirmières supplémentaires collectées en janvier et mars 2016 ont été ajoutées à la culture. Le laboratoire a été évacué pendant 4 jours lors de l'ouragan Matthew en octobre 2016 et la culture n'a pas survécu. |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | Collection mixte comprenant des gonozooides (1,5-5 mm) et de grands phorozooïdes (6 mm) avec amas gonozooides attachés | qui a réussi | Cultivés depuis 4 générations complètes, d'autres gonozooides collectés en avril 2017 ont été ajoutés à la culture. Fin de la culture en septembre 2017 avant l'ouragan Irma. |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | Gonozooides (3-6 mm) | raté | Grand gonozooid est mort après 1 jour. Le gonozooid immature a survécu dans la culture pendant 14 jours. Les œufs ont été libérés par les deux gonozooides. Des Oozooides ont été produits mais n'ont pas réussi à se développer dans des étapes d'infirmière. La culture a échoué après 1 mois. |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | Grande infirmière (6-7 mm) sans trophozooides | qui a réussi | Dans la culture, l'infirmière produisait des trophozooïdes. La culture a été maintenue pendant 3 générations et a pris fin à la fin de juin 2018 lorsque les expériences ont été conclues. |
Tableau 2 : Résultat des tentatives d'établir des cultures de laboratoire D. gegenbauri recueilli sur le plateau mi-continental de south Atlantic Bight.
| Dolioletta gegenbauri | numéro zooide par | numéro zooide par | |||
| étape de la vie | Pot de 3,9 L | 1,9 L bocal | Isochrysis galbana | Rhodomonas sp. | Thalassiosira weissflogii |
| oozooide | 20 | 10 | inclure | inclure | N'INCLUEZ PAS |
| infirmière précoce | 20 | 10 | inclure | inclure | N'INCLUEZ PAS |
| infirmière avec 8 trophozooides | 4 | 2 | inclure | inclure | inclure |
| infirmière avec 20 trophozooides | 2 | 1 | inclure | inclure | inclure |
| infirmière avec 30 trophozooides | 1 | 1 | inclure | inclure | inclure |
| phorozooide (1 à 3 mm) | 30 | 15 | inclure | inclure | inclure |
| amas de gonozooides phorozooïdes | 2 | 1 | inclure | inclure | inclure |
| gonozooide (1 à 3 mm) | 30 | 15 | inclure | inclure | inclure |
| gonozooid (5 mm) | 2 | 1 | inclure | inclure | inclure |
| Les concentrations cibles d'algues doivent être maintenues entre 40 et 95 g de C/L avec des mélanges égaux (par teneur en carbone) de chaque espèce d'algues | |||||
Tableau 3 : Conditions de culture ciblées pour chaque D. gegenbauri phase de cycle de vie.
Figure supplémentaire 1 : Description détaillée de la roue de plancton personnalisée. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
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Discussion
La capacité de culture des doliolides a été établie au cours des dernières décennies et a été utilisée pour soutenir la recherche dans plusieurs domaines. Les études expérimentales dans nos laboratoires ont soutenu la publication d'au moins 15 études scientifiques axées sur l'alimentation et la croissance18,26, reproduction18,28, régime6, 29, physiologie30, écologie31, et modélisation écologique27 des doliolides.
Bien que la culture de ces animaux délicats soit actuellement laborieuse et chronophage, la culture des doliolides est faisable et, si elle est entreprise par la communauté en général, favorisera l'avancement de la compréhension de cette groupe d'animaux d'importance évolutive. L'objectif de cette étude était de décrire les approches actuelles de collecte, d'élevage et de maintien de D. gegenbauri en culture dans le but de mener des études en laboratoire.
L'établissement d'une culture doliolid exige la collecte des animaux sains et intacts et, une fois capturés, le traitement doux, la nutrition appropriée, et l'élevage. Doliolids, en particulier l'espèce D. gegenbauri, se produit circumglobally sur les plateaux continentaux subtropicaux, mais l'abondance peut être très variable. Par exemple, dans une étude récente axée sur la région de milieu de rayon de la SAB, bien que l'abondance ait varié de façon spectaculaire de 'lt;1/m3 à 'gt; 20.000/m3, les doliolids étaient présents tout au long de l'année6. En raison de la grande variabilité des doliolides dans l'espace et le temps et de la difficulté relative liée à l'échantillonnage des environnements de marge du plateau continental, une connaissance fiable de la dynamique des communautés doliolides où des études sont menées est importante. préalable à la réussite de l'établissement de la culture.
Une fois que les zooides doliolides ont été localisés et capturés, il peut être difficile de déterminer si les animaux ont été endommagés. Les animaux peuvent sembler intacts et présenter des comportements actifs de natation et d'évasion, mais même les plus petites blessures peuvent entraîner leur incapacité à prospérer. Une caractéristique qui est particulièrement pertinente à l'évaluation de la santé des zooides doliolides capturés est leur capacité à se nourrir. L'activité alimentaire peut être évaluée simplement en fournissant des algues pigmentées aux animaux fraîchement capturés. Si un animal se nourrit, l'intestin deviendra coloré dans un court laps de temps. D'après notre expérience, nous avons constaté que l'ajout d'une petite quantité d'algues pigmentées rouges, Rhodomonas sp., fournit rapidement des informations sur l'activité alimentaire. Si l'alimentation n'est pas observée, il est très peu probable qu'une culture puisse être établie.
La vigilance et la bonne élevage sont essentielles pour établir et maintenir les doliolides tout au long de leur cycle de vie complexe. Peut-être le stade le plus problématique est le développement d'une infirmière viable à partir du stade larvaire et la production (sprouting) des trophoozoïdes d'alimentation. À ce stade de la vie, nous supposons que les besoins alimentaires, en ce qui concerne la quantité, la qualité et la taille des particules est le plus limité. À notre connaissance, il n'y a eu aucune étude précédente qui a étudié l'activité d'alimentation des larves de D. gegenbauri et des oozooides. Par exemple, bien que les gonozooides et les phorozooïdes en développement soient capables d'ingérer des particules sur un large éventail de tailles, la capacité des larves, des oozooïdes et des petites infirmières est probablement plus limitée. Dans la pratique, nous constatons que la culture réussie à ces stades de la vie peut être réalisée en omettant les diatomées du mélange alimentaire des algues, en maintenant les concentrations alimentaires à des niveaux modérés, en effectuant des alimentations fréquentes à des concentrations plus faibles, en maintenant un gonozooid plus grand simple et quelques copépodes avec la culture, et en enlevant manuellement de grands agrégats de détritus.
Bien que nous ayons maintenu des cultures de D. gegenbauri pendant plusieurs générations provenant d'une seule collection, lorsque cela est possible, nous complétons régulièrement les cultures existantes avec des animaux fraîchement recueillis afin d'accroître la diversité génétique et la robustesse de la culture. Un danger potentiel de cette pratique est l'introduction de parasites ou de maladies dans la culture, mais à notre connaissance, nous n'avons jamais rencontré ce problème. Bien qu'il y ait eu peu de rapports de parasites des doliolides32,sans aucun doute, ils existent. Fait intéressant, dans une étude récente comparant le régime alimentaire des gonozooides de D. gegenbauri cultivés exposés aux eaux naturelles avec des gonozooides d'Apicomplexids capturés sur le terrain, des parasites présumés d'Apicomplexa ont été détectés dans la population sauvage qui étaient absent chez les animaux de culture6.
Une limitation existante de la technologie de culture décrite est la limitation du volume de production de zooide. En particulier parce que les techniques décrites impliquent la culture dans des bocaux scellés à faible densité sur une roue de plancton rotative, il n'est pas clair si cette approche pourrait être étendue ou que le flux de travail serait propice à l'automatisation. Les systèmes de culture à plus grande échelle, cependant, pour une autre espèce de zooplancton marin gélatineux délicat, le larvacean Oikopleura dioica, ont été décrits20,33,34, suggérant qu'il peut être possible de concevoir des systèmes similaires pour les doliolids à l'avenir. Cependant, l'histoire de la vie complexe de D. gegenbauri par rapport à l'histoire de vie plus simple de O. dioica restera un défi important à la culture à grande échelle.
En conclusion, suivant les protocoles décrits ici, D. gegenbauri peut être cultivé de façon fiable dans des conditions de laboratoire contrôlées tout au long de son histoire de vie complexe. Cette capacité rend l'espèce favorable à une variété d'études expérimentales contrôlées, et peut-être à développer des doliolides comme un nouveau modèle animal en biologie du développement et l'évolution. Toutefois, les limites de l'échelle de production devront être surmontées avant que cet objectif puisse être atteint.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à déclarer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants aux nombreuses personnes qui ont contribué aux connaissances accumulées à ce projet au fil des ans, y compris G.-A. Paffenh-fer et D. Deibel qui ont initialement développé ces protocoles. M. Koster et L. Lamboley ont également contribué de manière significative à l'élaboration de ces procédures. N.B. Làpez-Figueroa et 'E. Rodràguez-Santiago ont généré les estimations de l'abondance doliolid fournies dans le tableau 1. Cette étude a été soutenue en partie par la National Science Foundation des États-Unis qui décerne l'OCE 082599, 1031263 au MEF, les projets collaboratifs OCE 1459293 et OCE 14595010 à MEF et DMG et, le prix NA16SEC48810007 de la National Oceanic and Atmospheric Administration à DMG. Nous sommes reconnaissants à l'équipage travailleur et professionnel de la Savane R/V. Lee Ann DeLeo a préparé les chiffres, Charles Y. Robertson a relu le manuscrit et, James (Jimmy) Williams a fabriqué la roue de plancton
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
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